CN105954866A - 一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其中，用于所述超分辨表层显微成像的照明器件从下到上依次包括：透明基底，光栅，金属/介质多层膜层；所述显微成像方法利用金属/介质多层膜层在光栅的激发下产生的深亚波长体等离子体(BPPs)模式，作为显微成像时的照明场，可在可见光及紫外光波段实现待测样品5nm‑300nm的表层超分辨成像。该方法有望应用于活细胞中细胞质膜的实时在线显微成像，应用广泛。本发明不仅可对待测样品进行纵向照明深度的调节，也可横向提高图像的空间分辨率，大大提高了样品表层成像质量。

Description

一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法

技术领域

本发明属于显微成像领域，涉及一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法。

背景技术

现代细胞科学正朝着分子尺度方向发展。其中，细胞表层区域附近的生物现象是一个热点研究内容。这些生物现象仅发生在距离膜表面一百纳米甚至几十纳米左右的极薄区域内。传统的荧光显微镜利用传输波照明整个被荧光染料标记的生物样品，但是较大的照明深度使得膜表层图像易受细胞内部散射光信号的干扰，降低了图像的对比度。为获得清晰的细胞质膜表层图像，仅需照明膜表层区域即可。全内反射荧光显微镜(TIRFM)，是利用全内反射时产生的倏逝波，选择性地照明膜表层一定厚度的区域(约100nm)，以减小表层成像时源自样品深层区域的光噪声，但是能达到的照明深度一般都大于70nm，而且倏逝波激发的荧光会受到入射激光的散射光以及激发荧光的干扰从而降低了图像的对比度。为了解决这些问题，近年来学者们提出了LED侧向照明的玻璃薄板TIRF结构，但是由于LED的光束发散角大，光束质量差，因而其倏逝波照明深度约为200nm。此外，其照明深度也无法进行调节，无法用于宽波段、大发散角度的光源照明。

百纳米厚度的薄膜光波导可作为另一种倏逝波照明结构。当入射光耦合进入波导时，就会在波导内激发特定的传输模式，波导界面处的倏逝波就可用于照明生物样品薄层。不同于棱镜材料和浸没式照明所用液体材料，介质薄膜材料更易于获得更高的折射率，从而实现更小照明深度的照明。但由于波导模式的离散性，导致照明深度无法连续调节。另外，光波在波导内传输时，由于样品的散射损耗，界面处的倏逝波强度将沿传输方向缓慢衰减，从而导致非均匀照明场。表面等离子体(SPs)被提出用于表层照明。但是由于临近激发结构会产生干扰光，也无法获得均匀和低照明深度的SPs，无法用于宽波段、大发散角度的光源照明。

前期我们申请并授权的申请号为CN201210107957.7的中国专利“一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法”通过改变金属/介质多层膜中的材料及膜厚可使消逝波穿透深度在5nm～200nm范围得到调节，当多层膜材料与膜厚固定时，也无法对照明深度进行动态的连续调节。此外，其工作带宽还有待提高。

本申请是专利CN201210107957.7内容的补充，增加了照明深度可调、宽波段光源工作、大发散角度光源工作和横向超分辨成像等保护内容。

发明内容

本发明针对现有技术的不足提供一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法。

本发明采用的技术方案为：一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，用于所述超分辨表层显微成像方法的照明器件包括：从下到上沿光线入射方向依次为：透明基底，激发光栅，金属/介质多层膜层。显微成像样品位于多层膜层之上，其中：

所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式A，采用单色和小发散角光源照明，发散半角<10°，从基底一侧，中心光线沿特定倾斜角度照明激发光栅结构，不改变光源波长、激发光栅和多层膜层结构，仅仅调整中心光束照明角度，最大角度调节范围0°～90°，实现连续的照明深度调节，照明深度连续调节范围为：5-300nm。

或者所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式B，采用单色和大发散角光源照明，发散半角<70°，从基底一侧对称照明激发光栅,结构，实现表层照明深度20～300nm。

或者所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式C，采用宽波带小发散角光源，或者多种波长激光，光源波长带宽<400nm，或者激光波长差异<400nm，发散半角<10°，从基底一侧，中心光线沿特定倾斜角度照明激发光栅结构，实现纳米尺度的表层照明成像，照明深度通过改变入射角度可以调节，调节范围30～300nm。

或者所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式D，采用宽波带和大发散角光源，光源带宽<400nm，发散半角<70°，从基底一侧对称照明激发光栅结构，实现纳米尺度的表层照明成像，深度范围40nm～300nm。

其中，所述的照明光源可以为非相干、自然偏振光、激光，波段范围紫外～可见光。

其中，所述单色光源可以为引入滤波片的汞灯、纳黄灯、单色LED灯、氙灯等。

其中，所述光源中心波长的真空波矢k0、中心光线入射角度θ、光栅波矢kg、基底折射率n、多层膜中体等离子体(BPPs)两个波矢窗口(kxmin，kxmax)和(-kxmax，-kxmin)、照明发散半角Δθ、光源波长带宽的设计规则如下：1)光栅波矢kg选择位于中心波长BPPs窗口上边缘kxmax；2)针对中心波长和中心光线照明角度，选择kg-n*sinθ*k₀位于对应波长BPPs窗口(kxmin，kxmax)之内，且对于不等于1的任何正负整数m，m*kg-n*sinθ*k₀位于两个对应波长BPPs窗口之外；3)以包含在光源发散角和光源波长带宽在内任何角度和波长组合，均满足规则2)。

其中，二维激发光栅情形，光源照明使用方式同工作方式A～D，设计规则修正为1～4个有限二维光栅衍射级次进入BPPs窗口。

其中，BPPs照明成像结合小角度反射照明成像，通过多幅图像频谱拓展叠加，实现超分辨成像。

其中，所述光栅所用材料可以为高折射率(折射率n>2)的介质或金属,包括：硅、铬、铜。

其中，所述金属/介质多层膜中的金属可以为良导体材料：金、银、铝。

其中，所述金属/介质多层膜中的介质可以为低损耗的光学膜层材料：二氧化硅、氟化镁。

本发明原理及方法如下：

当TM极化的单色平面波从基底背面入射至光栅，光栅协同上方的金属/介质多层膜层激发出体等离子体(BPPs)，BPPs模式是由多层膜中相邻金属/介质层界面处存在的表面等离子体场相互耦合产生的，其在多层膜结构中呈现传输特性，BPPs场分布贯穿整个三维超材料空间，而不是局限在金属膜层表面，离开多层膜结构时将指数衰减。为了进一步说明BPPs模式，本发明采用等效介质理论(EMT)将金属/介质多层膜层近似为一各向异性介质，而x，y和z方向的等效介电常数分别为：

ε_x＝ε_y＝ε_df+ε_m(1-f)

ε_z ^-1＝ε_d ^-1f+ε_m ^-1(1-f)

其中，ε_m和ε_d分别为金属和介质的介电常数，f＝h_d/(h_d+h_m)为介质层的填充因子。在TM极化下该等效介质中的色散关系为k_x ²/ε_z+k_z ²/ε_x＝k₀ ²，其中k_x，k_z为沿着x，z方向的等效波矢分量，而k₀为真空中的波矢。因此可以得到多层膜结构的色散关系为一条双曲线，显然，该等效介质材料对空间频率k_x具有高通滤波的效果，也就是说，低频BPPs模式[包括表面等离子体(SPs)模式]无法在超材料中传输，从而只剩下高频BPPs模式才能透过金属/介质多层膜而进入待测样品。由于金属/介质多层膜上表面的BPPs场是呈指数衰减的倏逝波，因此仅对待测样品下表面实现照明；此外，当采用光栅激发深亚波长的BPPs模式时，光栅产生的衍射波可被耦合至多层膜结构中的BPPs模式。此时，样品中的照明深度为：

$L_p=\frac{\mathrm{\&lambda;}}{4\mathrm{\&pi;}\sqrt{{(k_x/k_0)}^2-\mathrm{\&epsiv;}}}=\frac{\mathrm{\&lambda;}}{4\mathrm{\&pi;}\sqrt{{(nsin\mathrm{\&theta;}+q\mathrm{\&lambda;}/d)}^2-\mathrm{\&epsiv;}}},(q=0,\&PlusMinus;1,\&PlusMinus;2,...)$

式中，λ和θ分别为入射光波长和角度，n为光栅所在基底的折射率，ε为待照明样品的介电常数，d为光栅周期，而q为光栅衍射级次。从上式中可以看出，在BPPs照明结构参数不变的情况下，倏逝波照明深度依赖于样品介电常数，以及入射光波长和角度。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明仅需通过单独或同时改变入射光角度和波长即可实现对待测样品5nm～300nm深度范围连续可调的表层均匀照明，出射面光强不均匀性因子均低于0.03，而且，本发明不仅可对待测样品进行纵向照明深度的调节，也可横向提高图像的空间分辨率，大大提高了样品表层成像质量。此外，本发明具有原理新颖、结构简单、易于操作、工作带宽宽、效率高、成本低等优点，为实现更高质量的表层光学显微成像开拓了新思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中照明器件的结构示意图，其中，1为透明基底层，2为光栅层，3为金属，4为介质，5为待测样品；

图2为本发明实施例1水溶液中计算得到的与仿真得到的照明深度随入射角度的变化关系，入射波长为532nm；

图3为本发明实施例1中出射界面处x方向的光强不均匀性因子与入射角度间的关系。插图是入射角度为5°，25°，40°及50°时x方向的光强分布曲线；

图4为本发明实施例2中400-700nm波长范围内的OTF；

图5为本发明实施例2水溶液中BPPs所能实现的照明深度调制范围随入射波长的变化关系；

图6为本发明实施例3中Ag/SiO₂多层膜的OTF。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，而且通过以下实施例对领域的技术人员即可以实现本发明权利要求的全部内容。

实施例1，通过改变入射光角度对照明深度进行连续调节。图1是该超分辨表层显微成像的照明器件结构示意图，所述器件由下到上依次为：光源、透明石英基底；硅光栅；Ag/SiO₂多层膜。设置硅光栅周期为202nm，深度为50nm，占空比为0.5。Ag/SiO₂多层膜由9层Ag膜(20nm)和8层SiO₂膜(80nm)组成。532nm光入射时，Ag的介电常数为ε_Ag＝-11.3+0.17i，SiO₂的介电常数以照明光λ＝532nm的TM极化的单色平面波从基底背面入射至光栅，光栅产生的衍射波可被耦合至多层膜结构中的BPPs模式。当Ag/SiO₂多层膜仅激发-1级次BPPs模式时，改变入射光角度范围0-52°。如图2所示，由理论公式计算得到的与全波仿真获得的照明深度几乎一致，并且倏逝波照明深度将随着入射角度的增加而增大。且可知在水溶液中，照明深度调制范围为19-63nm。

接下来，本实施例进一步探讨照明均匀性。在0-51°范围内，出射面处的光强不均匀性因子(U＝(I_max-I_min)/(I_max+I_min))与入射角度的关系见图3上半部分。从中可以看出，除了0°和52°角附近，其余入射角度下的不均匀性因子均小于0.1。由于在0°和51°角附近，金属/介质多层膜层中不仅激发-1级次的BPPs模式，而且还会激发其他级次衍射光，因而-1级次BPPs模式与其他级次光波的干涉会使光强均匀性稍有恶化。此外，从中还可以看出，光强不均匀性因子随入射角度的变化呈振荡形式。主要原因是，超材料结构中激发的-1级次BPPs模式泄露出的电场幅值随入射角度而振荡变化(见图3下半图)，因而与变化不大的0级传输光的干涉作用效果也将振荡变化，从而导致振荡变化的光强不均匀性因子。同时，超材料出射面处的-1级次BPPs模式电场幅值越大，其与0级传输光的干涉作用越弱，故对应的光强不均匀性因子将越小。此外，在5°，25°，40°和50°时的光强横向分布见图3插图，此时的光强不均匀性因子均低于0.03。

实施例2，本发明在宽带波长范围内的工作性能，BPPs照明结构在可见光波长范围内也能实现极低的照明深度。图4显示了在可见光范围(400-700nm)内金属/介质多层膜层的光学传递函数。从中可以看出，OTF窗口下限几乎不随入射波长而变化，其上限将随着入射波长的增加而缓慢减小。其中，多层膜结构OTF的上下限定义为窗口抑制比约为20(透过率大于0.015的条件下)或者透过率约为0.015(OTF窗口抑制比大于20的条件下)时的kx值。同时发现波长接近400nm时，携带有低频空间波矢的BPPs模式将被多层膜结构传输。

当入射波长为650nm以及530nm时，超材料仅支持一定带宽的高频BPPs模式，而450nm时其还能同时还能激发低频BPPs模式。通过计算发现波长小于530nm时金属/介质多层膜层可以同时激发高频和低频空间波矢BPPs模式，而530nm以及更长入射波长时，仅有存在高频BPPs模式。因而为了仅支持高频BPPs模式，入射光波长不能小于530nm。通过优化照明结构材料及参数，就可以将工作波长拓展至紫外光波段。

在530-700nm入射波长范围内，倏逝波照明源在水溶液中的照明深度如图5所示。可获得的最小照明深度从530nm波长时的19nm缓慢增加至700nm时的27nm，即最小照明深度关于入射波长变化不大，本发明可在宽波带范围内工作。

实施例3，基于该发明可以提升横向成像分辨率。成像器件结构与图1类似，基底层为玻璃衬底,光栅层为亚波长Cr激发光栅(周期为160nm，占空比为0.5)，金属/介质多层膜层由30对20nm厚的Ag膜(入射波长为442nm时介电常数为-5.77+0.225i)和30nm厚的SiO₂膜(介电常数为2.13)交替堆叠而成。波长为442nm的平面波入射时，Ag/SiO₂多层膜的OTF见图6。从中可以看出，仅在p极化入射光时，多层膜结构呈现带通滤波特性，只有横向波矢位于2.2k₀～3.8k₀的倏逝波分量可被多层膜结构增强和透过。光栅激发的±1级次衍射光的横向波矢为±2.76k₀，均位于多层膜结构的带通窗口之内，±1级次衍射光在多层膜结构内产生的两高频BPPs模式相互干涉，干涉后的BPPs模式横向波矢可增大为原来的两倍，即5.52k₀。该BPPs模式可作为高空间频率的结构照明场。由于结构照明场的空间频率越高，成像时可达到的空间分辨率越大，因而该发明具有实现超衍射高分辨率的成像。通过理论估算，此时可以将空间分辨率提高为传统荧光显微镜的6.5倍。具体实现成像时，需调节照明场的相位，获取多幅频谱扩展后的原始图像，后经过图像重建算法得到超高分辨率图像。

因此，上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。本发明未详细阐述部分属于本领域技术人员的公知技术。

Claims (9)

1.一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，用于所述超分辨表层显微成像方法的照明器件包括：从下到上沿光线入射方向依次为：透明基底，激发光栅，金属/介质多层膜层，显微成像样品位于多层膜层之上，其中：

所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式A，采用单色和小发散角光源照明，发散半角<10°，从基底一侧，中心光线沿特定倾斜角度照明激发光栅结构，不改变光源波长、激发光栅和多层膜层结构，仅仅调整中心光束照明角度，最大角度调节范围0°～90°，实现连续的照明深度调节，照明深度连续调节范围为：5～300nm；

或者所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式B，采用单色和大发散角光源照明，发散半角<70°，从基底一侧对称照明激发光栅结构，实现表层照明深度20～300nm；

或者所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式C，采用宽波带小发散角光源，或者多种波长激光，光源波长带宽<400nm，或者激光波长差异<400nm，发散半角<10°，从基底一侧，中心光线沿特定倾斜角度照明激发光栅结构，实现纳米尺度的表层照明成像，照明深度通过改变入射角度可以调节，调节范围30～300nm；

或者所述超分辨表层显微成像方法包括以下工作方式D，采用宽波带和大发散角光源，光源带宽<400nm，发散半角<70°，从基底一侧对称照明激发光栅结构，实现纳米尺度的表层照明成像，深度范围40nm～300nm。

2.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，所述的照明光源可以为非相干、自然偏振光、激光，波段范围紫外～可见光。

3.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，所述单色光源可以为引入滤波片的汞灯、纳黄灯、单色LED灯或氙灯。

4.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，所述光源中心波长的真空波矢k₀、中心光线入射角度θ、光栅波矢kg、基底折射率n、多层膜中体等离子体(BPPs)两个波矢窗口(k_xmin，k_xmax)和(-k_xmax，-k_xmin)、照明发散半角Δθ、光源波长带宽的设计规则如下：1)光栅波矢kg选择位于中心波长BPPs窗口上边缘kxmax；2)针对中心波长和中心光线照明角度，选择kg-n*sinθ*k₀位于对应波长BPPs窗口(kxmin，kxmax)之内，且对于不等于1的任何正负整数m，m*kg-n*sinθ*k₀位于两个对应波长BPPs窗口之外；3)以包含在光源发散角和光源波长带宽在内任何角度和波长组合，均满足规则2)。

5.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，二维激发光栅情形，光源照明使用方式同工作方式A～D，设计规则修正为1～4个有限二维光栅衍射级次进入BPPs窗口。

6.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，BPPs照明成像结合小角度反射照明成像，通过多幅图像频谱拓展叠加，实现超分辨成像。

7.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，所述光栅所用材料可以为高折射率的介质或金属，包括：硅、铬或铜，高折射率为折射率n>2。

8.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，所述金属/介质多层膜中的金属可以为良导体材料：金、银或铝。

9.根据权利要求1所述的一种照明深度可调的宽波段光源超分辨表层显微成像方法，其特征在于，所述金属/介质多层膜中的介质可以为低损耗的光学膜层材料：二氧化硅或氟化镁。