CN105954334B - 一种用于检测二苯胺的分子印迹电化学传感器及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于检测二苯胺的分子印迹电化学传感器及其应用。本发明公开了一种分子印迹电化学传感器及其应用。所述分子印迹电化学传感器包括工作电极，所述工作电极表面依次涂覆有一层石墨烯/钌纳米粒子和一层分子印迹聚合物。本发明分子印迹电化学传感器既结合了石墨烯/钌纳米粒子良好的导电性和催化性，也结合印迹材料的特异选择性。当分子印迹聚合物使用的模板分子为二苯胺时，所制备的分子印迹电化学传感器对二苯胺具有良好的吸附性能，选择性强，不易受干扰，且检测线性范围宽，检测下限可以达到0.02μM。

Description

一种用于检测二苯胺的分子印迹电化学传感器及其应用
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域，特别是涉及一种用于检测二苯胺的分子印迹电化学传感器及其应用。
背景技术
芳香胺是一类在环境中潜在的致癌物质。芳香胺类化合物在化工行业中的应用较广，主要用于染料、化妆品、药物和橡胶合成的中间体，并随工业废水排放，给水体、土壤带来环境污染。一些塑料食品包装材料也是初级芳香胺的来源之一。这种塑料包装材料用于食品包装，可迁移到食品中造成污染，给食品安全带来严重后患。二苯胺(DPA)是芳香胺一种，可通过吸入、食入、皮肤吸收等途径侵入人体，接触者可有头疼、头晕、呕吐、腹泻等症状，如若长期接触后皮肤黏膜会出现刺激现象，会损害神经系统、心血管系统及血液系统，经过一系列活化作用使人体细胞DNA发生结构与功能的变化，严重情况下出现尿频或血尿等症状，引起膀胱癌。由于二苯胺的广泛使用，二苯胺已在地表水及地下水中被检出，被列入欧盟优先控制污染物的名单。二苯胺的测定方法主要有高效液相色谱法、荧光法、毛细管电泳法以及电化学方法等，电化学方法具有操作简便、快速、便携方便等特点，因此适用于环境水样品中二苯胺的检测。
分子印迹技术是制备具有特殊的识别能力的分子印迹聚合物材料的有力工具。在分子印迹聚合物的制备过程中，在模板分子存在下，一种或多种功能单体和交联剂在适当的溶剂中发生聚合。分子印迹聚合物的合成成本低、方法简单、选择性好，广泛应用于分离、荧光传感器以及电化学传感器。为进一步提高分子印迹聚合物电化学传感器的导电性和灵敏度，纳米材料已经被用于电化学传感中。很多纳米材料能够提高电极的电流响应，而且还能为物质检测提供微环境，促进电子的转移。石墨烯作为纳米材料的一种，其二维层状结构使其具有良好的成膜性和稳定性，较多的被用作纳米粒子的载体，尤其是金属纳米粒子与石墨烯复合纳米材料。
CN103868966A公开了一种分子印迹聚合物-石墨烯复合材料修饰电极，包括分子印迹聚合物-石墨烯复合材料和玻碳电极，以所述玻碳电极为基体，所述分子印迹聚合物-石墨烯复合材料修饰在所述玻碳电极上。该发明还提供了分子印迹聚合物-石墨烯复合材料修饰电极的制备方法及其在苯胺和4,4’-亚甲基二苯胺(MDA)检测中的应用。
发明内容
本发明提供了一种用于检测二苯胺的分子印迹电化学传感器，该分子印迹电化学传感器对二苯胺有良好的选择性。
一种分子印迹电化学传感器，包括工作电极，所述工作电极表面依次涂覆有一层石墨烯/钌纳米粒子(GR-Ru)和一层分子印迹聚合物。石墨烯本身常被用于制备电化学传感器，而钌金属的使用，使得本发明分子印迹电化学传感器具有良好的导电性和催化性。
优选的，所述工作电极为玻碳电极。当然，金电极或铂电极也可以用作本发明，但玻碳电极较金电极或铂电极便宜。玻碳电极在使用时，需要预处理，预处理的方法为先用0.05μm Al2O3的抛光成镜面后，依次用丙酮、HNO3(1∶1，v/v)、NaOH(1.0mol/L)和二次去离子水超声洗涤，于室温下晾干备用。
所述石墨烯/钌纳米粒子由氧化石墨烯和钌源在还原剂作用下反应制得。
优选的，所述石墨烯/钌纳米粒子的制备方法为：
(1)将氧化石墨烯分散于二次水中获得悬浮液1；
(2)将钌源分散于悬浮液1中获得悬浮液2；
(3)在悬浮液2中加入还原剂进行还原反应；
(4)还原反应完成后，离心收集产物，产物洗涤、干燥后获得石墨烯/钌纳米粒子。
氧化石墨烯(GO)在透射电镜下的形状为片层褶皱且很薄。当石墨烯与钌纳米粒子复合后，钌纳米粒子较均匀地分布在石墨烯表面，钌纳米粒子粒径约在1-10nm左右。
所述石墨烯/钌纳米粒子涂覆到工作电极上时，先将干燥的石墨烯/钌纳米粒子分散于N,N-二甲基甲酰胺，然后涂覆在预处理的工作电极表面，再在红外灯下干燥。优选的，所述分子印迹电化学传感器涂覆的石墨烯/钌纳米粒子的基底浓度为0.3mg/mL。
优选的，所述氧化石墨烯与钌源的质量摩尔比为7～9mg∶0.01mmol。最优选的，所述氧化石墨烯与钌源的质量摩尔比为8mg∶0.01mmol。
优选的，所述钌源为三氯化钌、硫酸钌和硝酸钌中的至少一种。最优选的，所述钌源为三氯化钌。
优选的，所述的还原剂为硼氢化钠。
所述分子印迹聚合物由功能单体、交联剂、模板分子聚合反应后，再脱除模板分子后制得。
优选的，所述模板分子的去除方法为差分脉冲伏安法。
优选的，所述分子印迹聚合物的制备方法为：
(1)800μL无水乙醇、80μL交联剂、20μL功能单体、100μL浓度为0.1M的二苯胺混合均匀得到溶液1；
(2)840μL乙氧基乙醇、84μL交联剂、20μL功能单体、28μL二次水、28μL浓度为0.1M的盐酸、100μL浓度为0.1M的二苯胺混合均匀得到溶液2；
(3)1.7mL无水乙醇、0.3mL氨水、0.3mL浓度为0.1M的二苯胺混合，搅拌1～3h获得溶液3；
(4)取30μL溶液1加入溶液3中，搅拌1～3h，然后加入30μL溶液2，搅拌10～14h；
(5)步骤(4)的反应产物经离心、洗涤获得所述分子印迹聚合物材料。
所述功能单体为苯基三甲氧基甲硅烷、乙烯基三甲基硅烷或γ-氨丙基三甲氧基硅烷。优选的，所述功能单体为苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)。
所述交联剂为正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丁酯。优选的，所述交联剂为正硅酸甲酯(TMOS)。正硅酸甲酯为有机硅类交联剂。
优选的，所述模板分子为二苯胺。
本发明又提供了所述的分子印迹电化学传感器在检测二苯胺中的应用。检测时，最佳吸附时间为4min，最佳的电解质溶液pH为5.0。检测时，样品中DPA的浓度在0.05～70.0μM范围内具有较好的线性关系，最低检测限为0.02μM。
本发明分子印迹电化学传感器通过在工作电极的表面依次涂覆一层石墨烯/钌纳米粒子和一层分子印迹聚合物制备得到。本发明分子印迹电化学传感器既结合了石墨烯/钌纳米粒子良好的导电性和催化性，也结合印迹材料的特异选择性。当分子印迹聚合物使用的模板分子为二苯胺时，所制备的分子印迹电化学传感器对二苯胺具有良好的吸附性能，选择性强，不易受干扰，且检测线性范围宽，检测下限可以达到0.02μM。
附图说明
图1为本发明分子印迹电化学传感器的制备流程图；
图2为红外光谱图，其中，曲线a：GO，b：GR-Ru，c：SiO2-MIP；
图3为GR-Ru的扫描电镜能谱分析图；
图4为X-射线光电子能谱分析图，其中，图A为GO(曲线a)和GR-Ru(曲线b)的XPS图谱，图B为GO中C1s全谱分析图，图C为GR-Ru中C1s全谱分析图，图D为GR-Ru中Ru 3p全谱分析图；
图5为透射电镜图，其中图A和B分别为GO和GR-Ru的透射电镜图；
图6为DPV法洗脱模板分子DPA洗脱次数分析结果图；
图7为本发明分子印迹电化学传感器的吸附性能检测结果图，其中图A和B分别为CV法和DPV法检测结果图，曲线a：GR-Ru/MIP/GCE，b：GR-Ru/NIP/GCE；
图8为本发明分子印迹电化学传感器导电性能检测结果图，其中，图A为CV检测(a：SiO2-NIP/GCE、b：SiO2-MIP/GCE、c：裸GCE、d：GR-Ru/MIP/GCE、e：GR-Ru/GCE)，图B为EIS检测(a：GR-Ru/GCE、b：GR-Ru/MIP/GCE、c：裸GCE、d：SiO2-MIP/GCE)，图C和D为计时库伦法检测(a：GR-Ru/GCE、b：GR-Ru/MIP/GCE、c：SiO2-MIP/GCE、d：裸GCE、e：SiO2-NIP/GCE)；
图9为本发明分子印迹电化学传感器工作条件优化结果图，其中图A和B分别为富集时间和测定液pH的优化；
图10为本发明分子印迹电化学传感器选择性考察结果图；
图11为本发明分子印迹电化学传感器检测DPA的浓度范围考察结果图，其中，图A为不同DPA浓度下的循环伏安曲线，图B为标准曲线。
具体实施方式
本发明用到的主要试剂如表1所示。
表1 主要试剂。
试剂 分子式 规格 生产厂家
正硅酸甲酯(TMOS) C8H20O4Si AR 梯希爱试剂有限公司
苯基三甲氧基硅烷(PTMOS) C9H14O3Si AR 梯希爱试剂有限公司
乙二醇乙醚 C4H10O2 AR 梯希爱试剂有限公司
二苯胺(DPA) C12H11N AR 百灵威试剂有限公司
氯化钌 RuCl3·3H2O AR 西格玛试剂有限公司
磷酸氢二钠 Na2HPO4 AR 上海国药化学试剂公司
磷酸二氢钠 NaH2PO4 AR 上海国药化学试剂公司
氨水 H5NO AR 阿拉丁试剂有限公司
乙醇 C2H6O AR 国药集团化学试剂公司
苯胺 C6H7N AR 百灵威试剂有限公司
萘胺 C10H9N AR 西格玛试剂有限公司
4，4’二氨基联苯 C6H4NH2 AR 百灵威试剂有限公司
2-萘酚 C10H8O AR 百灵威试剂有限公司
2,6-二氯苯酚 C6H4Cl2O AR 百灵威试剂有限公司
硼氢化钠 NaBH4 AR 阿拉丁试剂有限公司
备注：磷酸缓冲溶液PBS(pH 5.0，0.1M)采用Na2HPO4和NaH2PO4配制。
本发明用到的主要仪器如表2所示。
表2 主要仪器。
本发明分子印迹电化学传感器的制备流程和电化学传感检测过程如图1所示。
实施例1 石墨烯/钌纳米粒子的制备
石墨烯/钌纳米粒子(GR-Ru)的制备过程参照文献报道的方法(Kung C-C,Lin P-Y,Buse F J,et al.Preparation and characterization of three dimensionalgraphene foam supported platinum–ruthenium bimetallic nanocatalysts forhydrogen peroxide based electrochemical biosensors[J].Biosensors andBioelectronics,2014,52:1-7.和Cao N,Hu K,Luo W,et al.RuCu nanoparticlessupported on graphene:A highly efficient catalyst for hydrolysis of ammoniaborane[J].Journal of Alloys and Compounds,2014,590：241-246)，并进行适当的修改。将8mg氧化石墨烯(GO)均匀分散在5mL二次水中，超声2h分散；再向其中加入1mL浓度为0.01M的三氯化钌溶液，得到均匀分散的褐色溶液。将90mg硼氢化钠(NaBH4)溶解于4mL二次水中得到硼氢化钠溶液，作为氧化石墨烯和氯化钌的还原剂；将此溶液边搅拌边滴加至分散好的氧化石墨烯和三氯化钌的混合液中。最后，再将溶液在100℃下冷凝回流12h，得到黑色悬浮溶液，离心洗涤后，于真空干燥箱内干燥过夜，得到石墨烯/钌纳米粒子。
实施例2 二氧化硅分子印迹聚合物的制备
将1.7mL无水乙醇，0.3mL氨水和0.3mL二苯胺(0.1M)加入至圆底烧瓶中，该混合液在室温下搅拌2h，然后加入30μL溶液1(表3)，搅拌2h；最后加入30μL溶液2(表3)，持续搅拌12h，最终获得二氧化硅分子印迹聚合物(SiO2-MIP)。为了使模板分子二苯胺(DPA)、功能单体苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)和交联剂正硅酸甲酯(TMOS)之间完全地预聚合，溶液1和溶液2在加入混合物之前要分别搅拌2h。该混合物通过离心，并用无水乙醇充分洗涤除去未反应物之后得到SiO2-MIP。非印迹复合材料(SiO2-NIP)也用同样的方法合成，只是所有步骤中不加入模板分子DPA。
表3 溶液1和2配方。
实施例3 分子印迹电化学传感器的制备
将玻碳电极(GCE)在0.05μm Al2O3的抛光成镜面后，依次用丙酮、HNO3(1∶1，v/v)、NaOH(1.0mol/L)和二次去离子超声5min洗涤，于室温下晾干备用。先将上述制备的石墨烯/钌纳米粒子分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成0.3mg/mL的溶液，取5μL此溶液滴涂于处理好的玻碳电极表面，在红外灯下干燥20min。再将上述SiO2-MIP(对照组为SiO2-NIP)加入到1mL N,N-二甲基甲酰胺中，超声使其分散均匀获得悬浮液，取上述悬浮液5.0μL滴涂于已经滴涂有石墨烯/钌纳米粒子的玻碳电极表面，室温下过夜晾干即制得GR-Ru/MIP/GCE(对照组为GR-Ru/NIP/GCE)电化学传感器。通过差分脉冲伏安法(DPV)扫描来去除模板分子二苯胺。模板分子洗脱之后，再将修饰电极进行重新吸附和选择性识别实验。实验测量的DPV的扫描条件为：初始电位0.2V，终止点位0.8V，电位增量0.004V，振幅0.05A，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.25s。下列实施例中使用的GR-Ru/MIP/GCE传感器均为本实施例制备的分子印迹电化学传感器。
实施例4 红外光谱表征及EDX表征
利用傅里叶红外光谱技术分别将GO，实施例1中制备的GR-Ru纳米粒子和实施例2中制备的SiO2-MIP进行表征。结果如图2所示，其中曲线a对应GO，曲线b对应GR-Ru，曲线c对应SiO2-MIP，3433cm-1处强的吸收峰归属于GO上O-H的伸缩振动，1731cm-1和1635cm-1是GO上C＝O和C＝C的伸缩振动峰。当GO经过硼氢化钠还原后，3433cm-1处的吸收峰明显变弱，1731cm-1处的吸收峰消失，1634cm-1处的峰依然存在，这是由于还原不会破坏C＝C。对于SiO2-MIP，在1083cm-1出现的强峰可归因于Si-O-Si不对称振动，然而在799cm-1的吸收峰归因于Si-O-Si的对称振动，此外，在952cm-1处的吸收峰归属于Si-O的伸缩振动吸收峰。红外光谱证明了石墨烯成功被还原，但为了进一步表明钌元素的存在，对GR-Ru进行了扫描电镜能谱分析(EDX)，结果如图3所示。在GR-Ru的复合物中，C、O及Ru元素均有检测出来，且其原子百分比分别为74.20％、23.07％以及2.73％。
实施例5 X-射线光电子能谱表征
为进一步讨论石墨烯、氯化钌在硼氢化钠中的还原程度，通过X-射线光电子能谱(XPS)对GO和实施例1中制备的GR-Ru纳米粒子的价键及价态进行了分析，结果如图4所示。图4A为GO、GR-Ru的XPS谱图，GO中含有C、O两种元素，氧元素的含量为31.09％(曲线a)，当还原成GR-Ru后，氧元素的含量降低了，只有11.89％，同时也出现了钌元素，其含量为1.82％，说明Ru已成功附着在GR上。图4B和C分别为GO和GR-Ru中C1s的XPS全谱图，从图中可以看出，GO中C1s主要有三种碳组成，位于284.8eV、286.7eV和287.9eV的谱峰分别属于C-C(C＝C/C-H)、C-O-C(C-OH)以及C＝O官能团，当其还原得到GR-Ru后284.4eV、286.4eV和288.2eV的谱峰均能存在，C-O-C(C-OH)以及C＝O谱峰明显减弱，这与GO和GR-Ru的红外光谱表征结果也是基本一致的。为了研究材料中钌元素的存在形式，对GR-Ru中Ru 3p做了全谱图，结果如图4D所示，从图中可以看出，Ru中主要有两种价态，位于461.2eV和463.5eV的谱峰分别属于Ru(0)，RuO2(IV)。综上所述，说明还原石墨烯和Ru纳米颗粒已成功合成。
实施例6 透射电镜表征
为了能更清楚的了解材料的形貌和粒径尺寸，采用TEM来对GO和实施例1中制备的GR-Ru纳米粒子进行表征，结果如图5所示，其中，图5A为GO的TEM图，可以看到GO片层褶皱且很薄。当石墨烯与钌纳米粒子复合后，如图5B所示，钌纳米粒子较均匀的分布在石墨烯表面，其粒径约在1-10nm左右。
实施例7 模板分子洗脱条件考察
在分子印迹电化学传感器中，SiO2-MIP进行模板分子再吸附前需要将印迹的模板分子(DPA)洗脱掉，传统方法是用有机试剂(甲醇、乙酸等)或者缓冲溶液作为洗脱剂来洗脱印迹聚合物中的模板分子。但是，这些方法存在耗时长和模板分子不能完全洗脱等缺点。本发明采用DPV洗脱印迹聚合物中的模板分子，随着DPV扫描次数的增加峰电流显著减小，然后逐渐达到稳定。该法能快速而且较完全的洗脱掉DPA分子。如图6所示，当扫描圈数达到22圈时，DPV几乎对DPA无响应值，也就是说DPA分子已经完全从GR-Ru/MIP修饰电极膜基质中去除。
实施例8 本发明分子印迹电化学传感器吸附性能检测
分子印迹聚合物具有与模板分子对应的空穴位点，因此其吸附性能是一个重要特征，本发明通过循环伏安法(CV)和DPV法分别考察了GR-Ru/MIP/GCE(本发明分子印迹电化学传感器)、GR-Ru/NIP/GCE(对照)对模板分子的吸附性能。将GR-Ru/MIP/GCE、GR-Ru/NIP/GCE分别浸入10mL的10.0μM DPA溶液(电解质溶液是pH＝5的PBS溶液)中富集4min，使修饰电极与模板分子充分结合，然后进行CV扫描，结果如图7A所示，DPA在电极上的氧化还原是一个不可逆的过程，GR-Ru/MIP/GCE的峰电流明显比GR-Ru/NIP/GCE大。同时将GR-Ru/MIP/GCE、GR-Ru/NIP/GCE在相同条件下进行DPA检测，结果如图7B所示，可以看出GR-Ru/MIP/GCE对DPA的氧化峰电流是GR-Ru/NIP/GCE的3.1倍。这是由于GR-Ru/MIP/GCE具有与模板分子尺寸和结构相匹配的印迹空穴以及GR-Ru的催化作用，从而对目标分子DPA产生特异性识别。
实施例9 本发明分子印迹电化学传感器导电性能检测
电极材料导电性的优异程度也是电化学传感考察指标之一。本发明构筑了SiO2-MIP/GCE、SiO2-NIP/GCE、裸的工作电极、GR-Ru/MIP/GCE、GR-Ru电化学传感器并分别置于10mL含有5mM K3[Fe(CN)6]和0.1M KCl的混合溶液中，用循环伏安法对他们进行测定，测试条件：0.8V～-0.2V，扫速为100mV/s，结果如图8A所示。可以看出裸玻碳电极有一对可逆的氧化还原峰，其峰电流比值约为1∶1。SiO2-NIP/GCE的氧化还原峰电流明显比SiO2-MIP/GCE小，主要是因为非印迹材料缺乏印迹空穴。而SiO2-MIP/GCE比裸电极的信号还要弱，主要是因为SiO2-MIP导电性差，减缓了电子的传递速度。然而，当GR-Ru修饰于电极表面后，可以发现，其氧化还原峰电流明显增大，这也进一步说明GR-Ru具有良好的导电性能及催化性能，可作为优良的基质载体材料。相比于SiO2-MIP/GCE，GR-Ru/MIP/GCE传感器的氧化还原峰电流明显增大，这也主要利用了GR-Ru良好的导电性能及催化性能，以及印迹聚合物中模板分子DPA洗脱之后留下的印迹空穴有利于[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的扩散，从而促进[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的氧化还原反应。
电化学交流阻抗谱(EIS)也被用来进一步表征材料的导电性能，其图谱通常是由半圆和直线两部分组成，其中半圆的直径表示电子传质阻力，半圆直径越小就说明阻力越小，导电性越好。对GR-Ru/GCE、GR-Ru/MIP/GCE、裸GCE、SiO2-MIP/GCE进行电化学交流阻抗谱分析，结果如图8B所示，裸玻碳(曲线c)的电子传质阻力约为55Ω。当滴涂上GR-Ru材料后，电子传质阻力变小了，这说明石墨烯-钌纳米粒子的复合材料加快了[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面上的电子传递。与SiO2-MIP/GCE相比，GR-Ru/MIP/GCE修饰电极的电子传质阻力也明显减小，主要归因于石墨烯-钌纳米粒子良好的导电性和催化性能，EIS结果与上述修饰电极对K3[Fe(CN)6]的电化学行为研究结果也是一致的。
为了考察电极材料的有效表面积，本发明采用计时库伦法测定0.5mM K3[Fe(CN)6]的Q-t曲线，检测条件为脉冲宽度0.25s，取样间隔0.25ms，静置时间2s，然后得到相应的Q-t1/2标准曲线方程，计算Q与t1/2的斜率来获得GR-Ru/GCE、GR-Ru/MIP/GCE、SiO2-MIP/GCE、GCE、SiO2-NIP/GCE的电化学有效表面积，结果如图8C和D所示。根据Anson公式：
其中n为转移电子数(K3[Fe(CN)6]的转移电子数为1)，A为工作电极的有效表面积，C表示基质的浓度，D是扩散系数(K3[Fe(CN)6]的扩散系数为7.6×10-6cm2s-1)；Qdl代表双层电荷相对背景基质可忽略不计，Qads表示法拉第常数。根据Q与t1/2的线性关系可得出GR-Ru/GCE、GR-Ru/MIP/GCE、SiO2-MIP/GCE、GCE以及SiO2-NIP/GCE修饰电极的斜率分别为6.70×10-5、4.64×10-5、1.02×10-5、6.16×10-6和4.80×10-6，由此计算得到其对应的有效表面积分别为0.446cm2、0.309cm2、0.068cm2、0.041cm2和0.022cm2。结果说明，GR-Ru/GCE的高比表面积奠定了基质材料的优势，通过GR-Ru/MIP/GCE与SiO2-MIP/GCE、裸GCE、SiO2-NIP/GCE比较发现，GR-Ru/MIP/GCE有效表面积明显增大，这主要归因于石墨烯-钌纳米粒子的高有效表面积和印迹材料存在空穴位点从而增加了对DPA的总吸附量，更大的有效表面积可以导致DPA峰电流的增大。
实施例10 本发明分子印迹电化学传感器工作条件优化
通过初步实验探究，其GR-Ru的基底浓度确定为0.3mg/mL最优，在此基础上本发明通过DPV分析方法考察了富集时间和测定液pH对GR-Ru/MIP/GCE修饰电极电流响应的影响。富集时间影响修饰电极吸附目标分子，从而影响电流大小，当工作电极吸附目标分子达到饱和状态时，峰电流趋于平稳状态的时间就是最佳吸附时间。富集时间对电流大小的影响结果如图9A所示，GR-Ru/MIP/GCE修饰电极在1到4min，DPA的氧化峰电流逐渐增加。随着富集时间的增大，DPA在GR-Ru/MIP/GCE上的积累量也增加，在4min时电流达到最大且稳定，表明GR-Ru/MIP/GCE传感器具有较短的响应时间，这主要是因为GR-Ru材料表面优良电子传递性能与分子印迹识别位点的作用。考虑到灵敏度和工作效率，本实验选择最佳吸附时间为4min。为了使实验达到最优的检测条件，对溶液的pH也进行了优化，结果如图9B所示，电解质溶液pH从4.0-5.0时，峰电流随着pH的增加而增大；在pH为5.0时，电流达到最大值；当pH大于5.0时，峰电流又开始下降，所以本发明选择pH 5.0为最佳的电解质溶液pH。
实施例11 本发明分子印迹电化学传感器选择性、受干扰性检测
材料的选择性是构筑传感器的一个重要因素，为此本发明也深入考察了GR-Ru/MIP/GCE、GR-Ru/NIP/GCE对10.0μM DPA及其它几种类似物的DPV电流响应，其中类似物分别为2-萘酚(2-NP)、2,6-二氯苯酚(2,6-DCP)、4,4’-二氨基联苯(4,4’-DAP)、萘胺(NA)、苯胺(AN)。如图10所示，GR-Ru/MIP/GCE对10.0μM DPA的电流响应分别是2-萘酚、2,6-二氯苯酚、4,4’-二氨基联苯、萘胺、苯胺的2.20、2.76、2.52、6.58、6.45倍；GR-Ru/MIP/GCE对10.0μMDPA的电流响应与对照组GR-Ru/NIP/GCE有显著性差异，而两者对10.0μM 2-萘酚、2,6-二氯苯酚、4,4’-二氨基联苯、萘胺、苯胺的电流响应大小没有显著性差异。表明，GR-Ru/MIP/GCE传感器对DPA具有较好的选择性，这归因于GR-Ru/MIP材料形成了与DPA尺寸大小相同的印迹空穴，从而可以对模板分子DPA产生特异性吸附。
本发明还探究了金属离子、非金属离子和部分有机物对DPA检测的干扰。检测结果如表4所示。金属离子和某些阴离子对检测的干扰较小，Al3+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Mg2+、SO4 2-、Cl-浓度在1mM或者说是二苯胺的100倍以内基本无影响；2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-氯苯酚、4-硝基苯胺、1-萘酚浓度在100μM或者说是二苯胺的10倍以内也不会对DPA的检测产生干扰。
表4 潜在干扰物对DPA检测的影响。
干扰物质 干扰限度μM 相对倍数
Al3+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Mg2+、SO4 2-、Cl- 1000 100
2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-氯苯酚、4-硝基苯胺、1-萘酚 100 10
备注：测试条件为PBS(0.1M，pH＝5)，吸附时间：4min。
实施例12 本发明分子印迹电化学传感器检测范围、检测限、重现性和稳定性考察
在实施例10得出的优化检测条件下，采用DPV法研究了GR-Ru/MIP/GCE电化学传感器对DPA检测的线性范围及检测限。结果如图11A所示，随着DPA浓度的增加，其峰电流也不断增加，峰电流大小与DPA浓度在0.05-70.0μM范围内呈良好的线性关系，线性方程为Ip(μA)＝0.1207C(μM)+0.2457(R2＝0.9946)，最低检测限为0.02μM(S/N＝3)。而与Granado等(Granado V L,Gutierrez-Capitan M,Fernandez-Sanchez C,et al.Thin-filmelectrochemical sensor for diphenylamine detection using molecularlyimprinted polymers[J].Analytica Chimica Acta,2014,809:141-147.)制备的聚3,4-乙烯基二氧噻吩分子印迹聚合物并电沉积在金电极表面构筑的传感器相比(二苯胺在4.95-115μM呈线性，最低检测线为3.9μM)，本研究制备的GR-Ru/MIP/GCE传感器对二苯胺检测具有更低的检测限。如图11B所示，GR-Ru/NIP/GCE传感器对DPA检测(曲线b)的线性方程为：Ip(μA)＝0.0415C(μM)+0.2024(R2＝0.9936)。Ksv,MIP和Ksv,NIP分别为GR-Ru/MIP/GCE和GR-Ru/NIP/GCE传感器的线性斜率，由线性方程可知其值分别为0.1207和0.0415。该Ksv,MIP和Ksv,NIP的比值定义为印迹因素，被用于评估材料的特异性识别能力。该IF(Ksv,MIP/Ksv,NIP)值为2.90，这表明GR-Ru/MIP/GCE具有大量与模板分子DPA相对应的印迹位点，然而GR-Ru/NIP/GCE则没有与之相对应的印迹空穴，故电流响应明显减弱。为了研究GR-Ru/MIP/GCE检测的重现性和稳定性，用同一根修饰电极通过连续8次测定GR-Ru/MIP/GCE传感器对10.0μM DPA的电流响应，其相对标准偏差为3.9％。将GR-Ru/MIP/GCE电极保存在4℃冰箱中两周之后，仍然能达到初始信号的93.1％，结果证明该传感器拥有很好的重现性和稳定性。
实施例13 环境水样中DPA的检测
使用本发明GR-Ru/MIP/GCE传感器对水样中DPA进行检测。水样分别取自位于浙江省嘉兴市嘉兴学院校园内的湖水和自来水，水样首先用0.45μm滤膜进行预处理以除去水中的固体杂质。每个样品平行测定5次，发现实际各个水样中没有DPA的电化学响应，说明所取水样中DPA浓度低于检测下线。因此采用标准加入法来进行DPA检测实验，并获取回收率，结果如表5所示，GR-Ru/MIP/GCE传感器对DPA的回收率在93.0％-107.8％，相对标准偏差在0.72％-4.1％。另外采用高效液相色谱法(HPLC)对样本进行检测作为比较，结果显示两种检测方法的结果具有很好的吻合性，能满足实验要求。因此，可以说明GR-Ru/MIP/GCE传感器可应用于实际环境水样的检测，并且取得了较为满意的效果。
表5 水样中DPA检测。

Claims (1)

1.一种分子印迹电化学传感器在检测二苯胺中的应用，所述分子印迹电化学传感器，包括工作电极，其特征在于，
所述工作电极表面依次涂覆有一层石墨烯/钌纳米粒子和一层分子印迹聚合物，
所述石墨烯/钌纳米粒子由氧化石墨烯和钌源在还原剂作用下反应制得，所述氧化石墨烯与钌源的质量摩尔比为7～9mg∶0.01mmol，所述钌源为三氯化钌、硫酸钌和硝酸钌中的至少一种，所述的还原剂为硼氢化钠，
所述分子印迹聚合物由功能单体、交联剂、模板分子聚合反应后，再脱除模板分子后制得，所述功能单体为苯基三甲氧基硅烷，所述交联剂为正硅酸甲酯，所述模板分子为二苯胺，
钌纳米粒子均匀的分布在石墨烯表面，粒径1-10nm，石墨烯/钌纳米粒子的基底浓度为0.3mg/mL，
检测时，吸附时间为4min，电解质溶液pH5.0。
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