CN105954268A - 一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器及其构建与应用 - Google Patents

一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器及其构建与应用，属于生物检测技术领域。本发明主要包括：(1)四氧化三铁纳米簇探针的制备；(2)构建基于四氧化三铁纳米簇探针催化信号放大的可视化检测传感器；(3)对食源性致病菌进行快速和可视化检测。所用四氧化三铁纳米簇探针由于纳米粒子聚集作用，催化能力增强，从而大大提高检测灵敏度。所述传感器构建简单方便，可保存使用。该方法稳定性好，可不通过昂贵的仪器进行检测，通过裸眼即可进行比色检测，利于拓展到现场检测；检测过程快速简单，利用已准备好的传感器，整个检测可以在145分钟内完成。展现了良好的潜能可拓展应用到食源性致病菌的现场检测中去。

Description

一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器及其 构建与应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器及其构建与应用。
背景技术
由于食源性疾病的高爆发率，食源性致病菌对于公共健康已经成为了重大的威胁。食源性致病菌的识别方法需要具有快速，准确和方便的特性。传统的食源性致病菌识别方法多基于培养和菌落形态观察，并且结合标准的生化识别。这些方法虽相对可靠，但是要求专业人员操作，工作强度大，且所需时间长。基于核酸扩增的检测方法被广泛用来检测食源性致病菌，如聚合酶链式反应(PCR)，依赖核酸序列的扩增(NASBA)，环介导恒温扩增(LAMP)等。虽然这些方法灵敏度高，但是需要细胞裂解和核酸提取，及昂贵和专业的仪器。免疫检测的方法已经被广泛应用于食源性致病菌检测，如酶联免疫检测(ELISA)。三明治ELISA是一种常见的形式，这种免疫检测涉及两个抗体分别结合在致病菌的两个不同的位点，通常通过酶催化显色底物来进行比色检测。然而当前发展的比色免疫检测被它们的低灵敏度所限制，尤其当所要检测标志物量低时，这成为了检测食源性致病菌的一个瓶颈。因此发展一种快速的，高灵敏度的，方便操作的检测方法具有重要的价值和意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有催化活性的功能化四氧化三铁纳米簇探针的合成方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述合成方法得到的功能化四氧化三铁纳米簇探针。该功能化纳米簇探针可用于可视化检测传感器的构建。
本发明的另一目的在于提供一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器的构建方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法得到的基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器。
本发明的再一目的在于提供一种基于四氧化三铁纳米簇催化信号放大的可视化检测传感器对食源性致病菌进行快速和可视化检测的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有催化活性的功能化四氧化三铁纳米簇探针的合成方法，具体包括如下步骤：
通过水热法合成表面羧基化的四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NP)，通过聚赖氨酸(PLL)上氨基与Fe3O4NP上羧基之间进行缩合反应形成交联，从而形成四氧化三铁纳米粒子簇(Fe3O4NPC)；特异性的适配体与得到的Fe3O4NPC连接即得到功能化的Fe3O4NPC probe。
所述的Fe3O4NP，表面基团：-COOH，粒径为200～300nm，浓度为5mg/mL；
所述的聚赖氨酸分子量是30～70kDa。
所述的水热法合成表面羧基化的Fe3O4NP的反应步骤如下：
1)以乙二醇为基础液，混合加入六水合氯化铁，搅拌形成澄清溶液；
2)向澄清溶液中加入醋酸钠，将混合液搅拌；
3)将搅拌均匀的混合液加入聚四氟乙烯高压反应釜中反应后在室温中冷却高压反应釜；
4)得到产物用超纯水和乙醇清洗，用磁分离器去除多余液体，在真空中干燥产物，得到表面羧基化的Fe3O4NP。
步骤1)中所述的六水合氯化铁，乙二醇均购自美国西格玛奥德里奇公司，六水合氯化铁用量优选为10～30g/L；更优选为30g/L
步骤2)中所述的醋酸钠用量优选为50～75g/L，更优选为75g/L，购自广州试剂厂；
步骤2)中所述的搅拌的时间优选为30～60分钟；更优选为30分钟；
步骤3)中所述的反应的条件优选为180～200℃反应16～20小时；更优选为200℃反应16小时；
步骤4)中所述的干燥的时间优选为10～12小时。
所述的Fe3O4NPC合成的合成反应步骤如下：
1)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)通过涡旋溶解在PBS缓冲液，将Fe3O4NP加入其中，室温孵育活化；
2)然后加入PLL，4℃孵育过夜；
3)去除多余的未反应的PLL和EDC，Fe3O4NPC形成，将产物重分散在PBS缓冲液中，4℃保存备用。
步骤1)中所述的EDC购自美国西格玛奥德里奇公司；
步骤1)中所述的PBS缓冲液优选为1×PBS缓冲液，pH7.4～7.6，用量优选为0.5～1mL，购自上海生工生物工程公司；
步骤1)中所述的EDC在PBS缓冲液中的浓度优选为1～5mg/mL；更优选为1mg/mL；
步骤1)中所述的EDC与Fe3O4NP的质量比优选为(1～5)：1；
步骤1)中所述的室温孵育活化的时间优选为30～60分钟；
步骤2)中所述的PLL的分子量优选为30～70kDa，购自美国西格玛奥德里奇公司，浓度优选为5～15μg/mL；优选为12.5μg/mL；
所述的Fe3O4NPC probe的制备反应步骤：
1)用EDC和羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化Fe3O4NPC，室温下活化；
2)用PBS缓冲液清洗产物后，活化的Fe3O4NPC与特异性的适配体孵育在醋酸钠缓冲液中，反应孵育过夜，然后用PBS缓冲液清洗连接产物；
3)将产物重分散在Tris缓冲液中，室温下孵育，用PBS缓冲液清洗，重分散在PBS缓冲液中储存在4℃备用。
步骤1)中所述的EDC和NHS的浓度优选均为1～5mg/mL，更优选均为1mg/mL，NHS购自美国西格玛奥德里奇公司；
步骤1)中所述的活化的时间优选为30～60分钟；
步骤2)中所述的特异性的适配体的优选序列为：5'-NH2-TTT TTT TTT TATCCA TGG GGC GGA GAT GAG GGG GAG GAG GGC GGG TAC CCG GTTGAT-3'，合成自上海生工生物工程公司；
步骤2)中所述的醋酸钠缓冲液浓度优选为50～70mM，pH 5.0～6.0；更优选为50mM，pH6.0；
步骤2)中所述的PBS缓冲液优选1×PBS缓冲液，pH7.4～7.6；
步骤3)中所述的Tris缓冲液浓度优选为50～60mM，pH7.0～8.0；更优选为50mM，pH7.2；
步骤3)中所述的孵育的时间优选为30～60分钟。
一种具有催化活性的功能化Fe3O4NPC probe，通过上述制备方法得到。
一种基于上述Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器的构建方法，具体步骤如下：
1)用EDC和NHS活化万古霉素(Van)；
2)向已活化的Van溶液中加入牛血清白蛋白溶液(BSA)，4℃孵育过夜；
3)向BSA-Van混合液中加入Tris缓冲液终止反应；
4)用超滤管离心去除多余未反应的Van和EDC，转速为5000～7000rpm。
5)将BSA-Van加入到包被液中，用BSA-Van包被微孔板，震荡；
6)去除包被液，修饰的孔用清洗液清洗三次；然后用封闭液封闭微孔板，室温下在振荡器上孵育；
7)去除封闭液，用清洗液清洗三次，最后每孔加上PBS，4℃保存备用，基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器构建完成；
步骤1)中所述的EDC的浓度优选为20～50mg/mL，更优选为20mg/mL；NHS的浓度优选为1.0～5.0mg/mL，更优选为1.0mg/mL；
步骤1)中所述的Van购自美国西格玛奥德里奇公司；
步骤2)中所述的BSA的浓度优选为0.5～1.0mg/mL，更优选为1.0mg/mL，购自上海生工生物工程公司；
步骤3)中所述的Tris缓冲液浓度优选为50～60mM，pH7.0～8.0；更优选为50mM，pH7.2；
步骤4)中所述的超滤管优选为10kDa；
步骤5)中所述的包被液为Tris-HCl缓冲液，浓度优选为0.01～0.05M，pH7.5～8.7；更优选为0.01M，pH8.5；
步骤5)中所述的包被微孔板的BSA-Van的浓度优选为50～75μg/mL，更优选为50μg/mL；所述的微孔板优选为96孔板；
步骤5)中所述的震荡的条件优选为600～700rpm震荡4℃过夜；
步骤6)中所述的清洗液为包含0.05％～0.1％Tween-20的1×PBS缓冲液；更优选为包含0.05％Tween-20的1×PBS缓冲液；
步骤6)中所述的封闭液为包含2％～3％BSA和0.05％～0.1％ Tween-20的PBS缓冲液；更优选为包含3％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液；
步骤6)中所述的孵育的时间优选为30～60分钟；
一种基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器，通过上述方法构建得到；
一种基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器对食源性致病菌进行快速和可视化检测的方法，具体步骤如下：
1)检测食源性致病菌样品制备
培养食源性致病菌直至OD 600值达到1.0；取食源性致病菌菌液，离心，去除培养基，用PBS缓冲液清洗三次，得到食源性致病菌细胞重分散在PBS缓冲液中；并进行梯度稀释，得到各浓度检测菌液；
2)可视化检测传感器对食源性致病菌进行捕获
检测样品加入上述基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器中，室温下孵育，然后去除未捕获样品，用清洗液清洗三次；
3)Fe3O4NPC probe识别检测食源性致病菌
将Fe3O4NPC probe加入可视化检测传感器中，振荡器上孵育后去除未结合探针，清洗三次；
4)对可视化检测传感器上捕获食源性致病菌进行比色检测
将显色底物加入可视化检测传感器中，在Fe3O4NPC probe的催化下，底物变色，检测波长为652nm；结果也能通过催化产物的颜色变化进行裸眼检测；
所述的食源性致病菌优选为革兰氏阳性菌；
所述的食源性致病菌优选为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)；
步骤1)中所述的离心的条件优选为5000～10000rpm离心2～5分钟；
步骤1)中所述的PBS缓冲液的浓度优选为0.1～0.5M；更优选为0.1M；
步骤2)中所述的孵育的时间优选为30～60分钟；
步骤2)中所述的清洗液为包含0.05％～0.1％Tween-20的1×PBS缓冲液；更优选为包含0.05％Tween-20的1×PBS缓冲液；
步骤3)中所述的孵育的时间优选为30～60分钟；
步骤4)中所述的显色底物优选为四甲基联苯胺显色底物；所述的四甲基联苯胺显色底物优选为1-Step Ultra TMB solution，购自美国赛默飞公司；
本发明的基本原理如图1所示：
Van与BSA连接，Van通过BSA的物理吸附作用结合到微孔板上。革兰氏阳性菌与万古霉素通过牢固的五点氢键连接结合，Van牢固的锚定在革兰氏菌细胞壁上的D-Ala-D-Ala基团上，而D-Ala-D-Ala来自细菌细胞壁上的N-乙酰-葡萄糖肽和N-乙酰胞壁酸。适配体标记的Fe3O4NPC识别细菌通过强特异性结合在细菌细胞壁上的内源蛋白A上。这样三明治识别复合体在微孔板上形成了。Fe3O4NPC的合成通过单个的Fe3O4NP与PLL交联，PLL在每个重复单元具有一个氨基基团。Fe3O4NPC具有三个功能：识别，可视化和信号放大。Fe3O4NP具有内在的过氧化物酶活性，利用Fe3O4NPC的聚集作用，Fe3O4NPC相比较Fe3O4NP会有更高的催化能力。这样传感器通过Fe3O4NPC probe催化显色底物可以产生变色反应，因此可以直接可视化检测细菌。此方法可以成为一个有效的信号放大策略用于纳米粒子催化的比色检测。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器构建简单方便，可保存使用。
(2)该方法稳定性好，可不通过昂贵的仪器进行检测，通过裸眼即可进行比色检测，利于拓展到现场检测。
(3)该传感器有明显的灵敏度增强效应，能通过Fe3O4NPC的聚集效应增强催化能力，从而大大提高检测灵敏度。
(4)可快速检测，使用已构建完成的可视化检测传感器，整个检测过程用时145分钟。本发明的方法展现了良好的潜能可拓展应用到食源性致病菌的现场检测中去。
附图说明
图1是制备Fe3O4NPC probe的原理图及基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器的原理图。
图2是合成的Fe3O4NP形貌表征透射电镜照片及制备Fe3O4NPC probe过程中纳米粒子表面Zeta电位变化检测结果图。
图3是基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器灵敏度可视化检测结果对比，及灵敏度统计检测结果对比。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
Fe3O4NPC probe的制备原理图，见图1A；基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器的原理图，见图1B。
实施例1：合成具有催化活性的功能化Fe3O4NPC probe，具体包括如下步骤：
1.以20mL乙二醇为基础液，混合加入0.6g六水合氯化铁，搅拌形成澄清溶液，向澄清溶液中加入1.5g醋酸钠，混合液大力搅拌30分钟，将搅拌均匀的混合液加入聚四氟乙烯高压反应釜中200℃反应16小时后在室温中冷却高压反应釜，得到产物用超纯水和乙醇清洗，用磁分离器去除多余液体，在真空中干燥产物12小时，得到表面羧基化的Fe3O4NP；
2.将1mg EDC通过涡旋溶解在1×PBS缓冲液，将1mg Fe3O4NP加入其中，室温孵育活化30分钟，加入12.5μg PLL，4℃孵育过夜。用磁分离器去除多余的未反应的PLL和EDC，Fe3O4NPC形成，将产物重分散在1mL PBS缓冲液中，4℃保存备用；
3.用1mg/mL EDC和NHS活化1mg Fe3O4NPC，室温下活化30分钟；用1×PBS缓冲液(pH 7.4～7.6)清洗产物后，活化的Fe3O4NPC与特异性的适配体孵育在50mM醋酸钠缓冲液中(pH 6.0)，反应孵育过夜，然后用PBS缓冲液清洗连接产物；将产物重分散在50mM Tris缓冲液(pH 7.2)中，室温下孵育30分钟，用PBS缓冲液清洗，重分散在1mL PBS缓冲液中储存在4℃备用。
所述的特异性的适配体的序列为：5'-NH2-TTT TTT TTT TAT CCA TGG GGCGGA GAT GAG GGG GAG GAG GGC GGG TAC CCG GTT GAT-3'，合成自上海生工生物工程公司。
对实施例1中得到的Fe3O4NP通过透射电镜进行拍照，见图2A；图2B为制备Fe3O4NPC probe过程中纳米粒子表面Zeta电位变化检测结果图。
实施例2：构建基于上述Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器：
1.用300μL EDC(20mg/mL)和300μL NHS(1.0mg/mL)活化10mg Van，向已活化的Van溶液中加入250μL BSA(1.0mg/mL)，4℃孵育过夜。向BSA-Van混合液中加入40μL Tris缓冲液(50mM，pH7.2)终止反应。用10kDa超滤管离心去除多余未反应的Van和EDC，转速为5000rpm。
2.将BSA-Van加入到包被液(0.01M，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液)中，用50μg/mL BSA-Van包被96孔板，每孔100μL，置于振荡器600～700rpm震荡4℃过夜。去除包被液，修饰的孔用清洗液(包含0.05％Tween-20的1×PBS缓冲液)清洗三次，每孔300μL。然后用封闭液(包含3％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液)封闭微孔板，每孔150μL，室温下在振荡器上孵育60分钟，去除封闭液，用清洗液清洗三次，最后每孔加上250μL PBS，4℃保存备用，基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器构建完成。
实施例3基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器对单增李斯特菌进行快速和可视化检测，具体步骤如下：
1.检测细菌样品制备，实验所检测菌为单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(菌株号为CMCC54007，购自广州微生物研究所)在10mL LB培养基(LB培养基的配方如下：将1.0g的胰蛋白胨，0.5g的酵母提取物，1.0g的NaCl加入到100mL水中，用NaOH溶液调pH为7.0)中进行过夜培养的细菌，OD600为1，浓度约为1×108cfu/mL，取1mL上述细菌菌液，5000rpm离心5分钟，去除培养基，用PBS缓冲液清洗三次，得到细菌细胞重分散在0.1MPBS缓冲液中，并进行梯度稀释，得到各浓度检测菌液；
2.将150μL检测细菌样品加入实施例2构建的基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器中，室温下孵育30分钟，然后去除未捕获样品，用清洗液清洗三次；100μL实施例1制备的Fe3O4NPC probe加入可视化检测传感器中，振荡器上孵育30分钟后去除未结合探针，清洗三次。
3.100μL 1-Step Ultra TMB solution加入可视化检测传感器中，在Fe3O4NPCprobe的催化下，底物变色，检测波长为652nm。结果也可以通过催化产物的颜色变化进行裸眼检测。
图3是基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器灵敏度可视化检测结果对比，及灵敏度统计检测结果对比。
从图3中可以看出，基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器，单增李斯特菌在1×103到1×108cfu/mL浓度下可以被检测到，肉眼可视检测限为1×103cfu/mL，与基于Fe3O4NP probe的方法相比灵敏度高了两个数量级。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有催化活性的功能化Fe3O4NPC probe的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
通过水热法合成表面羧基化的Fe3O4NP，通过聚赖氨酸上氨基与Fe3O4NP上羧基之间进行缩合反应形成交联，从而形成Fe3O4NPC；特异性的适配体与得到的Fe3O4NPC连接即得到功能化Fe3O4NPC probe。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述的Fe3O4NP，表面基团：-COOH，粒径为200～300nm；
所述的聚赖氨酸分子量是30～70kDa。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述的Fe3O4NPC的合成反应步骤如下：
1)将EDC通过涡旋溶解在PBS缓冲液，将Fe3O4NP加入其中，室温孵育活化；
2)然后加入聚赖氨酸，4℃孵育过夜；
3)去除多余的未反应的PLL和EDC，Fe3O4NPC形成，将产物重分散在PBS缓冲液中，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述的Fe3O4NPC probe的制备反应步骤：
1)用EDC和NHS活化Fe3O4NPC，室温下活化；
2)用PBS缓冲液清洗产物后，活化的Fe3O4NPC与特异性的适配体孵育在醋酸钠缓冲液中，反应孵育过夜，然后用PBS缓冲液清洗连接产物；
3)将产物重分散在Tris缓冲液中，室温下孵育，用PBS缓冲液清洗，重分散在PBS缓冲液中储存在4℃备用。
5.根据权利要求1或4所述的合成方法，其特征在于：所述的特异性的适配体的序列为：5'-NH2-TTT TTT TTT TAT CCA TGG GGC GGA GAT GAG GGGGAG GAG GGC GGG TAC CCG GTT GAT-3'。
6.一种具有催化活性的功能化Fe3O4NPC probe，其特征在于通过权利要求1～5任一项所述的制备方法得到。
7.一种基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器的构建方法，其特征在于具体步骤如下：
1)用EDC和NHS活化万古霉素；
2)向已活化的Van溶液中加入牛血清白蛋白溶液，4℃孵育过夜；
3)向BSA-Van混合液中加入Tris缓冲液终止反应；
4)用超滤管离心去除多余未反应的Van和EDC，转速为5000～7000rpm；
5)将BSA-Van加入到包被液中，用BSA-Van包被微孔板，震荡；
6)去除包被液，修饰的孔用清洗液清洗三次；然后用封闭液封闭微孔板，室温下在振荡器上孵育；
7)去除封闭液，用清洗液清洗三次，最后每孔加上PBS，4℃保存备用，基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器构建完成。
8.一种基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器，其特征在于通过权利要求7所述的构建方法构建得到。
9.一种基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器对食源性致病菌进行快速和可视化检测的方法，其特征在于具体步骤如下：
1)检测食源性致病菌样品制备
培养食源性致病菌直至OD 600值达到1.0；取食源性致病菌菌液，离心，去除培养基，用PBS缓冲液清洗三次，得到食源性致病菌细胞重分散在PBS缓冲液中；并进行梯度稀释，得到各浓度检测菌液；
2)可视化检测传感器对食源性致病菌进行捕获
检测样品加入上述基于Fe3O4NPC probe催化信号放大的可视化检测传感器中，室温下孵育，然后去除未捕获样品，用清洗液清洗三次；
3)Fe3O4NPC probe识别检测食源性致病菌
将Fe3O4NPC probe加入可视化检测传感器中，振荡器上孵育后去除未结合探针，清洗三次；
4)对可视化检测传感器上捕获食源性致病菌进行比色检测
将显色底物加入可视化检测传感器中，在Fe3O4NPC probe的催化下，底物变色，检测波长为652nm；结果也能通过催化产物的颜色变化进行裸眼检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述的食源性致病菌为革兰氏阳性菌。
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