CN105950504A - 阿特拉津降解菌zxy-2的培养基 - Google Patents

阿特拉津降解菌zxy-2的培养基 Download PDF

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Abstract

阿特拉津降解菌ZXY‑2的培养基，它涉及一种阿特拉津降解菌ZXY‑2培养基。本发明的目的是为了解决现有用于培养节杆菌Arthrobacter sp.ZXY‑2所用的组成成分种类多且成本高的技术问题，阿特拉津降解菌ZXY‑2的培养基由蔗糖和Na2HPO4·12H2O溶于蒸馏水制成。阿特拉津初始浓度为50mg/L。所述培养基培养条件为pH 9，温度34.04℃，接菌量10％(v/v)，摇床转速150r/min。本发明的培养基只有两种成分。应用本发明的培养基培养细菌ZXY‑2，4h内可完全降解初始浓度50mg/L的阿特拉津，细胞密度可达2×108CFU/ml，降解效率达12.73mg·L‑1·h‑1。

Description

阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基
技术领域
本发明涉及一种培养基。
背景技术
除草剂是保证农业正常生产的重要资料。使用除草剂虽然可以为人类带来巨大的经济效益，然而由于除草剂具有长残留性、生物毒性等特点，一旦进入土壤、空气和水体，会给生态环境带来严重危害。阿特拉津在北方地区的广泛使用已经对自然界的动植物造成了严重的影响。微生物修复技术可将阿特拉津降解为无毒或低毒性的物质，因此具有广泛的应用前景。
其中，阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.ZXY-2，已于2015年6月1日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.10937。该细菌可以将不同初始浓度的阿特拉津进行高效降解。尽管该细菌具有高效降解能力，但是如何在短时间内提高菌体的生物量具有着重要的意义。此外，由于培养细菌ZXY-2所用的组成成分种类多且成本高，其高昂的培养价格会成为限制细菌推广与应用的重要原因。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有用于培养节杆菌Arthrobacter sp.ZXY-2所用的组成成分种类多且成本高的技术问题，提供了一种阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基。
阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基由蔗糖和Na2HPO4·12H2O溶于蒸馏水制成，蔗糖的浓度为2.212g/L，Na2HPO4·12H2O的浓度为6g/L。
所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基阿特拉津初始浓度为50mg/L。
所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基经过121℃，20min灭菌后使用。
所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为pH值为9，温度为34.04℃，摇床转速为150r/min，接菌量为10％(v/v)，培养时间为4h。
所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养条件为初始纯菌液细胞密度为108CFU/ml。所述ZXY-2为节杆菌Arthrobacter sp.ZXY-2，其保藏日期为2015年6月1日，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10937。
按照本发明的培养基组成对ZXY-2进行培养，4h内可完全降解初始浓度50mg/L的阿特拉津，细胞密度可达2×108CFU/ml(使用普通培养基培养节杆菌Arthrobactersp.ZXY-2在7h后生物量才能够增加至108CFU/ml。)，降解效率达12.73mg·L-1·h-1。其完全降解所用时间相较于优化前缩短3h,其细胞密度相较于优化前提高了28.6倍。
本发明提供一种阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，只有两种成分，能够使Arthrobacter sp.ZXY-2进行高效快速降解阿特拉津并节约了培养成本，本发明也为今后生物强化处理含有阿特拉津的工农业废水奠定理论基础和技术支持。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基由蔗糖和Na2HPO4·12H2O溶于蒸馏水制成，蔗糖的浓度为2.212g/L，Na2HPO4·12H2O的浓度为6g/L。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基阿特拉津初始浓度为50mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基经过121℃，20min灭菌后使用。其它与具体实施方式一或二之一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为pH值为9，温度为34.04℃，接菌量为10％。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为初始纯菌液细胞密度为108CFU/ml。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为摇床转速为150r/min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养时间为4h。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：应用普通阿特拉津培养基(无机盐培养基)培养ZXY-2过程如下：
用接菌环挑取4℃斜面保存节杆菌Arthrobacter sp.ZXY-2一环至浓度为50mg/L阿特拉津液体培养基中培养至108CFU/ml时，得到细菌悬液；
按照10％(v/v)的接菌量将细菌悬液接种至无机盐培养基中，接种后置于30℃，150r/min的摇床中培养。其中，无机盐培养基初始pH值为7.0，无机盐液体培养基中各组成成分浓度为：KH2PO4 0.9g/L，Na2HPO4.12H2O 6.5g/L，蔗糖3g/L，MgSO4.7H2O 0.2g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，微量元素液1ml/L。
微量元素液的制备方法为:将CoCl2.6H2O 0.1g、MnCl2.4H2O 0.425g、ZnCl2 0.05g，NiCl2.6H2O 0.01g、CuSO4.5H2O 0.015g、Na2MoO4.2H2O 0.01g和Na2SeO4.2H2O 0.01g溶于1000ml蒸馏水中。
将细菌悬液以10000r/min离心10min后，用0.22μm水系滤头过滤，利用高效液相色谱测定阿特拉津的浓度，色谱条件如下：流动相为乙腈：水＝6:4(V/V)，检测波长为220nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μL，25cm长C18柱。
通过上述方式培养ZXY-2，7h后阿特拉津完全降解。
其中，节杆菌Arthrobacter sp.ZXY-2保藏日期为2015年6月1日，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10937。
具体实施方式九：
优化阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基过程如下：
优化阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基通过应用Plackett-Burman及响应曲面设计，将阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基组成进行了优化。首先通过Plackett-Burman设计，从15个因素中筛选影响阿特拉津降解的主效应因子。这些因素包括：温度，pH值，摇床转速，接菌量，葡萄糖，蔗糖，柠檬酸钠，硝酸钾，氯化铵，异丙胺，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，硫酸亚铁，硫酸镁以及初始阿特拉津浓度。培养8h后测定阿特拉津降解率，每组实验三次重复，各因素高低水平值及分析结果如表1(15因素水平表及分析结果)所示。
表1
注：R-Sq＝96.06％；R-Sq(adj)＝94.35％.
根据表1所得结果，选择重要性排名前六的因素进行进一步优化，采用响应曲面设计，设定温度，pH，接菌量，蔗糖，磷酸氢二钠以及初始阿特拉津浓度六因素作为自变量，以阿特拉津降解率作为响应值，进行六因素三水平优化实验，并通过minitab17.0进行回归分析，确定优化后培养基组成。培养3h后测定阿特拉津降解率，每组实验三次重复，各因素高低水平值及结果如表2(六因素水平表及结果)所示。
表2
表3
注：R2＝0.9873
采用minitab17.0软件对实验结果进行进一步的统计分析，结果如表3(响应曲面统计结果)所示，拟合模型决定系数(0.9873)较高，p值小于0.0001，说明回归模型拟合度高，可用于响应值的预测。通过回归分析，建立优化模型如下所示：
Y = 48.442 + 2.811 X 2 + 8.255 X 3 + 2.235 X 4 - 9.964 X 6 - 3.21 X 1 2 + 3.94 X 6 2 - 1.020 X 1 X 3 - 1.427 X 1 X 4 + 1.137 X 1 X 6 - 1.307 X 2 X 5 - 0.781 X 3 X 4 - 0.829 X 3 X 5 + 4.923 X 3 X 6 + 0.948 X 4 X 6
其中，Y值为预测阿特拉津降解率，X1，X2，X3，X4，X5以及X6分别代表温度，pH，接菌量，蔗糖，磷酸氢二钠以及初始阿特拉津浓度。
通过对回归模型进行分析，结果表明，优化后的阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基组成为蔗糖的浓度为2.212g/L，Na2HPO4·12H2O的浓度为6g/L。所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养条件为pH值9，温度34.04℃，接菌量10％(v/v)。按照以上培养基组成对节杆菌Arthrobacter sp.ZXY-2进行培养，3h内可降解76.36％初始浓度为50mg/L的阿特拉津，其数值基本符合模型预测值。同时，该细菌4h内可完全降解初始浓度50mg/L的阿特拉津，细胞密度可达2×108CFU/ml。
通过具体实施方式八与本实施方式的比对分析，使用优化阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基可在4h内完全降解阿特拉津，而使用普通培养基(无机盐培养基)却需7h才能够完全降解阿特拉津；使用优化阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基对节杆菌Arthrobactersp.ZXY-2进行培养，细胞密度在4h内可达2×108CFU/ml，而对于具体实施方式八的培养基而言，细胞密度在4h内仅为7×106CFU/ml。此外，优化阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基由蔗糖，Na2HPO4·12H2O组成，而具体实施方式八中的培养基却由十种以上物质组成。

Claims (7)

1.阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基由蔗糖和Na2HPO4·12H2O溶于蒸馏水制成，蔗糖的浓度为2.212g/L，Na2HPO4·12H2O的浓度为6g/L。
2.根据权利要求1所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基阿特拉津初始浓度为50mg/L。
3.根据权利要求1所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基经过121℃，20min灭菌后使用。
4.根据权利要求1所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为pH值为9，温度为34.04℃，接菌量为10％。
5.根据权利要求4所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为初始纯菌液细胞密度为108CFU/ml。
6.根据权利要求4所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养条件为摇床转速为150r/min。
7.根据权利要求4所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基，其特征在于所述阿特拉津降解菌ZXY-2的培养基培养ZXY-2的培养时间为4h。
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