CN105949306A - 一种b/t淋巴细胞弱化因子免疫原多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的B/T淋巴细胞弱化因子免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR‑T细胞免疫治疗的应用。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞增殖，（2）能促进T细胞与肿瘤表面抗原的特异性结合，（3）在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR‑T等细胞疗法。

Description

一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽及其用途
技术领域
本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的B/T淋巴细胞弱化因子免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
背景技术
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
B/T细胞弱化分子(BTLA)是最近发现的B/T淋巴细胞弱化因子家族共抑制分子，是CD28家族成员，是与细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4及程序性死亡分子-1类似的抑制性受体。主要表达于B细胞、T细胞和抗原递呈细胞表面。BTLA的配体是TNF超家族成员疱疹病毒进入介质(HVEM)。HVEM-BTLA信号途径对T、B细胞的活化起负调节作用，在调节机体免疫应答，维持自身免疫稳定中起着十分重要的作用，是目前肿瘤免疫治疗研究的热点之一。
最近Gertner-Dardenne等认为淋巴瘤细胞可能通过BTLA介导的信号途径抑制γδT细胞的增殖(阻滞S期)，使得肿瘤细胞免疫逃逸的发生。另外，BTLA在黑色素瘤特异性CD8+T细胞上高表达，并通过与其配体HVEM介导信号途径抑制肿瘤特异性CD8+T细胞的功能，对BTLA信号途径封闭后可增强其增值活性及细胞因子的产生；对黑色素瘤患者接种CpG疫苗后，可下调BTLA在肿瘤特异性CD8+T细胞和B细胞的表达，并且其下降程度与免疫接种的次数呈正相关。Hobo等采用同种异基因干细胞过继治疗恶性血液病的研究中发现，BTLA在次级组织相容性抗原(Minor histocompatibility antigens，MiHA)特异性CD8+T细胞上高表达并削弱T细胞的增值及细胞因子的产生，阻断其信号途径后可恢复其功能。这些研究均为以BTLA作为靶点的肿瘤免疫治疗提供了线索。BTLA可与多重共抑制性分子(如PD-1、TIM-3等)同时表达在肿瘤特异性CD8+T细胞并使T细胞功能障碍。Radvanyi等采用体外扩增黑色素瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞进行过继细胞治疗时发现，BTLA+CD8+TILs数量与临床治疗疗效呈高度正相关。提示BTLA在TILs细胞过继治疗恶性黑色素瘤中可能是一个新的重要的生物标记物。
随着对BTLA的深入研究，我们发现BTLA不但在T、B淋巴细胞、巨噬细胞、DC、NK、单核细胞等固有免疫细胞表面表达，而且新近发现γδT细胞、血液系统肿瘤细胞B细胞型恶性肿瘤、多发性骨髓瘤细胞(MM)、急性髓系白血病细胞(AML)上也有表达。BTLA在肿瘤细胞上的表达提示其可能是一个肿瘤标记物，检测其表达可能对临床诊断具有重要指导作用。
B/T淋巴细胞弱化因子可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，B/T淋巴细胞弱化因子由414个氨基酸的蛋白，分子量较大，较难得到纯度高的B/T淋巴细胞弱化因子。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
发明内容
发明目的
本发明提供一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，序列为RPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRR(SEQ ID NO：1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
有益效果
本发明的B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于(1)促进T细胞增殖，(2)能促进T细胞与肿瘤表面抗原的特异性结合，(3)在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。
具体实施方式
多肽由上海生工吉尔合成。
实施例1
用人弥漫性大B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽的体内活力。
6-8w龄SCID小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)多肽低剂量组；(3)多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。建立人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)移植瘤模型，在接种DLBCL细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：0.5、1.0、2.0mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效地保护小白鼠，在剂量0.5、1.0、2.0mg/Kg时可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为40.98，68.92，79.01％。
实施例2
用人小细胞肺癌肿瘤模型检测B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽的体内活力。
6-8w龄C57BL/6裸鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)多肽低剂量组；(3)多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。建立人小细胞肺癌肿瘤模型，在接种肿瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：1.0、2.0、4.0mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效地保护小白鼠，在剂量1.0、2.0、4.0mg/Kg时可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为32.34，54.98，63.37％。
实施例3
T淋巴细胞的增殖作用：无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，Tris-NH4CL破解红细胞，冰水浴静置3-5min，离心(1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涤细胞两次。最后加入10％小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买)、多肽各剂量(5.0、10.0、20.0mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液100μl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终浓度为5μg/ml)。37℃细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μl MTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm处OD值，每孔设5个平行。
表1 多肽对T淋巴细胞的增殖作用
*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。
实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系，以20mg/ml的增殖率最高，为155.0％。
实施例4
B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽的T细胞结合试验：采用玫瑰花环试验评价T细胞与人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株(SUDHL-4)的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心1000转/分，10分钟，弃上清，以Hank’s液调细胞浓度为3×106/ml。于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入胸腺淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液500μl，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽。37℃细胞培养箱，培养48h，培养结束后每孔中加入100μl/孔人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞SUDHL-4(细胞浓度为1×106/ml，含10％胎牛血清)，混匀，500转/分，离心5分钟。弃上清，加少量戊二醛，轻轻晃动，使细胞悬浮，加甲紫染色，400倍显微镜观察。凡结合3个以上肿瘤细胞的T淋巴细胞为花环阳性细胞。记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率，即为T细胞与SUDHL-4细胞的结合率。每孔设5个平行。
实验结果见表2，与空白组比较，B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽可以显著性增加T细胞与SUDHL-4细胞的结合率(P<0.01)，低中高剂量组的结合率分别为67.33、81.33和86.82％。在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
表2 多肽对T细胞结合的影响
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽及其用途
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys Cys Leu Arg Arg
20 25 30

Claims (4)

1.一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
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