CN105929098A - 氨甲苯酸和注射液组合物及其质控方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氨甲苯酸和注射液组合物及其质控方法。具体地说，一方面，本发明涉及对氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液进行质量控制的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤。在一个实例中，还包括使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤。另一方面，本发明涉及作为药用原料药的氨甲苯酸、以及包含氨甲苯酸和注射用水的注射液，其是使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的方式进行质量控制的。本发明方法具有如说明书所述优异性能。

Description

氨甲苯酸和注射液组合物及其质控方法

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种可用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌肿、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等的原料药及其注射液药物组合物，特别是涉及氨甲苯酸原料药和包含氨甲苯酸的注射液药物组合物。本发明进一步涉及所述氨甲苯酸原料药和氨甲苯酸注射液组合物的质量控制方法。本发明方法具有优异的性能。

背景技术

氨甲苯酸(Aminomethylbenzoic Acid)，为对氨甲基苯甲酸一水合物，又名抗血纤溶芳酸、对羧基苄胺、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨甲基苯甲酸、对氨甲基苯甲酸；4-(Amino metmyl)benzoic acid、4-(Aminomethyl)benzoic acid，CAS号56-91-7。适用于肺、肝、胰、前列腺、甲状腺、肾上腺等手术时的异常出血，妇产科和产后出血及肺结核咯血、痰中带血、血尿，前列腺肥大出血、上消化道出血等。氨甲苯酸的分子式为C8H9NO2·H2O，分子量为169.18，其化学结构式为：

氨甲苯酸为白色或类白色的鳞片状结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦。氨甲苯酸在沸水中溶解，在水中略溶，在乙醇、氯仿、乙醚或苯中几乎不溶。

氨甲苯酸为氨甲苯酸类抗纤维蛋白溶解药。具有与6-氨基乙酸、氨甲环酸相同的作用机理。其立体构形与赖氨酸相似，能竞争性地抑制纤溶酶与纤维蛋白的吸附，保护纤维蛋白，使其不被纤溶酶降解，从而达到止血作用。其抗纤溶活性比6-氨基已酸强4-5倍。氨甲苯酸为促凝血药。血循环中存在各种纤溶酶(原)的天然拮抗物，如抗纤溶酶素等。正常情况下，血液中抗纤溶物质活性比纤溶物质活性高很多倍，所以不致发生纤溶性出血。但这些拮抗物不能阻滞已吸附在纤维蛋白网上的激活物(如尿激酶等)所激活而形成纤溶酶。纤溶酶是一种肽链内切酶，在中性环境中能裂解纤维蛋白(原)的精氨酸和赖氨酸肽链，形成纤维蛋白降解产物，并引起凝血块溶解出血。纤溶酶原通过其分子结构中的赖氨酸结合部位而特异性地吸附在纤维蛋白上，赖氨酸则可以竞争性地阻抑这种吸附作用，减少纤溶酶原的吸附率，从而减少纤溶酶原的激活程度，以减少出血。本品的立体构型与赖氨酸(1,5-二氨基己酸)相似，能竞争性阻抑纤溶酶原吸附在纤维蛋白网上，从而防止其激活，保护纤维蛋白不被纤溶酶降解而达到止血作用。

氨甲苯酸静注后有效血药浓度可维持3-5小时。服药24小时，36％±5％以原形随尿排出，静注则排出63％±17％，其余为乙酰化衍生物。氨甲苯酸口服后胃肠道吸收率为69％士2％。体内分布浓度依次为肾＞肝＞心＞脾＞肺＞血液等。服药后3小时血药浓度即达峰值，口服按体重7.5mg/kg，峰值一般为4～5ug/ml。口服8小时血药浓度已降到很低水平；静注后有效血药浓度可维恃3～5小时。服药24小时，36％±5％以原形随尿排出，静注则排出63％±17％，其余为乙酰化衍生物。

氨甲苯酸通过化学合成法制得，例如CN102718673A中公开了一种合成制备氨甲苯酸的工艺，其包括以下两步：

(1)对氰基氯苄的水解反应：在搅拌下将80毫升浓硫酸滴加到80毫升水中，然后加入38克对氰基氯苄，升温至120度左右，搅拌反应2-3小时，直至原料完全反应，补加120毫升纯化水，冷却降至室温，再搅拌一小时后过滤析出的白色固体，将所得水解产物重新悬浮于5-6倍量的纯化水中打浆1小时，过滤，水洗抽干得对氯甲基苯甲酸粗品，称湿重48.9克，HPLC检测纯度约为96％，不需精制，直接投入下一步氨化反应；

(2)对氯甲基苯甲酸的氨化：在500毫升三颈瓶中依次加入乌洛托品40克和80毫升纯化水，常温搅拌使溶解澄清，水浴冷却至20度以下加入上步得到的对氯甲基苯甲酸，搅拌半小时，然后开始滴加浓氨水，滴加过程中控制内温不超过25度，氨水滴完后撤去水浴，内温在15-30度搅拌反应2-3小时，薄层监测反应原料对氯甲基苯甲酸完全消失，其中展开条件为二氯甲烷/甲醇＝3/1；然后加入活性炭，搅拌15-30分钟，过滤，脱色处理后，40-50度减压旋蒸去除绝大部分氨和一小部分水分，蒸至pH值在7-8.5之间，有大量白色晶体析出，静止放冷至室温下，过滤析出的晶体，母液投入下一批套用；过滤后称湿品重量为30克左右，然后重新用120毫升氨水溶解，减压蒸氨浓缩，能得到18克左右的氨甲苯酸白色晶体，纯度99％以上，收率在50-60％之间。

此外，CN 105037186 A(201510338012.X)公开了一种氨甲苯酸的制备方法，其包括如下步骤：

1)对氰基卤苄与氨之间进行的氨解反应：向反应容器中加入有机溶剂和对氰基卤苄，室温搅拌使溶解，得到对氰基卤苄溶液；向另一个反应容器中加入乌洛托品和水，室温搅拌使溶解，冰盐浴冷却，内温降至5℃后加入氨水，然后向其中滴加所述对氰基卤苄溶液，滴加过程中控制内温不超过15℃，滴加完毕后于10～80℃搅拌反应5～6小时；反应完毕后，冷却至室温，静置分层后分液，氨水层留待下批套用，含有对氰基苄胺的有机溶剂层直接投入下一步酸水解反应：

2)对氰基苄胺与酸之间进行的酸水解反应：向反应容器中加入水，搅拌条件下滴加酸，然后加入步骤1)中制得的含有对氰基苄胺的有机溶剂层，加热至80℃，停止搅拌，静置分层后分液，上层的有机溶剂层返回步骤1)中套用，下层的酸水层加入到另一个反应容器中，搅拌条件下加热蒸水，待内温到达120℃，停止蒸水，保温回流4h；回流结束后，冷却至90℃，加入水，冷却至室温，再搅拌1h，过滤析出的固体，酸水层留待下批套用，将过滤所得固体加入到水中，搅拌lh，中和至中性，冷却至-5℃，过滤，水洗抽干，得到氨甲苯酸。

周雪萍等(周雪萍，等，氨甲苯酸注射液及其有关物质的HPLC法测定，中国医药工业杂志，2014，45(10)∶956；在本发明中该HPLC法可简称为周雪萍法)在其研究著述中，详细研究了分析氨甲苯酸注射液的有关物质的方法，其中开发出的HPLC法可以有效地用于检测合成工艺中间体对氯甲基苯甲酸，即该文献的图1中的峰2。该文献记载的注射液色谱图(该文献图1之B)显示在对氯甲基苯甲酸处并未检出该工艺杂质(相对保留时间RRT约1.4)；该文献记载的原料药色谱图(该文献图2之B)同样地显示在对氯甲基苯甲酸处并未检出该工艺杂质；但是，在注射液、原料粗品、原料中均在相对保留时间RRT约1.7处，即保留时间约27min处，显示出一个未知的杂质，即图2中指出的RRT1.7杂质。可见，原料中存在的该未知RRT1.7杂质在制剂中仍然明显地存在。

已经发现，许多种来源的氨甲苯酸及其制剂例如注射液中，能够检测到两种杂质，即对甲基苯甲酸和对羧基氯苄，二者有可能是由对二甲苯经氧化、氯化、氨化制备氨甲苯酸时的中间体。

因此，本领域仍然期待有新的方法来对氨甲苯酸原料药或其制剂例如注射液进行有效的质量控制，例如对其中的两种杂质对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的量进行有效的监控。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的方法，来对氨甲苯酸原料药或其制剂例如注射液进行有效的质量控制，例如对其中的两种杂质对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的量进行有效的监控。本发明人已经出人意料地发现，使用本发明的方法可以有效地监控上述两种杂质。本发明因此而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了一种对氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液进行质量控制的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤包括如下操作：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-水以体积比25：15：60为流动相，检测波长为230nm；取系统适用性试验溶液测定，理论板数按氨甲苯酸峰计应不低于3000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度应大于1.5；

(3)溶液制备：

取氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液适量，加流动相溶解或者稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg的溶液，过滤，作为供试品溶液(即，400μg/ml)；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含氨甲苯酸浓度为4μg/ml的溶液，作为对照溶液(即，4μg/ml)；

精密称取对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品适量，分别用流动相溶解并制成两种物质浓度均为4μg/ml的溶液，作为二种杂质的对照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml)；

精密称取氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品各适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、对甲基苯甲酸4μg、对羧基氯苄4μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液(即，400μg/ml+4μg/ml+4μg/ml)；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl、对甲基苯甲酸对照品溶液20μl、对羧基氯苄对照品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，确定各成分的保留时间，并读取各成分峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至对羧基氯苄保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积，当检测到存在对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄相对于氨甲苯酸的百分含量，即得到供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的含量(即，如果对照溶液主峰面积为100，供试品溶液色谱图中杂质对甲基苯甲酸的峰面积为115％，则对甲基苯甲酸相对于氨甲苯酸的百分含量，简称对甲基苯甲酸含量为1.15％；供试品溶液色谱图中杂质对羧基氯苄的峰面积为87％，则对羧基氯苄含量为0.87％)。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述色谱柱的规格是：柱长15～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述色谱柱的规格是：柱长20～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述流动相中还添加1～2w/v％的冰乙酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加1.5w/v％的冰乙酸。已经发现，当在流动相中添加1.5w/v％的冰乙酸时，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为5.0min、11.3min、12.2min。两个杂质峰的出峰时间较晚，这是不利于色谱测定的。还发现，在流动相中添加1.5w/v％的冰乙酸时，在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.35～0.38％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；但是，同样地如果针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在1.82～1.96％范围内，对羧基氯苄的RSD均在1.48～1.53％范围内，显示这两种杂质的精密度不能满足要求。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述流动相中，如果不添加冰乙酸，对甲基苯甲酸、对羧基氯苄二者的分离度小于1.0，不能满足测定要求。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述流动相中还添加0.1～1w/v％的酒石酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加0.1～0.5w/v％的酒石酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加0.25w/v％的酒石酸。已经发现，当在流动相中添加0.25w/v％的酒石酸时，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为4.9min、7.8min、9.1min。两个杂质峰的出峰时间显示地提前，这将是有利于色谱测定的。还发现，在流动相中添加0.25w/v％的酒石酸时，在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.33～0.35％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；另外，针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在0.51～0.54％范围内，对羧基氯苄的RSD均在0.43～0.46％范围内，显示这两种杂质的精密度非常好，完全能够满足测定要求。在此流动相中添加0.25w/v％的酒石酸的色谱方法中，理论板数按氨甲苯酸峰计大于5000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度均大于2.0。但是，完全无法解释的是，当将流动相中的0.25w/v％酒石酸改为0.25w/v％枸橼酸时，其测定结果却仍然与1.5％冰乙酸所得结果基本相同，而远不能达到酒石酸的优异效果。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤中，根据供试品溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液中氨甲苯酸浓度，按外标法以峰面积计算供试品中氨甲苯酸的含量。

进一步，本发明第二方面提供了一种作为药用原料药的氨甲苯酸。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，其是使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的方式进行质量控制的。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，其中使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤包括如下操作：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-水以体积比25∶15∶60为流动相，检测波长为230nm；取系统适用性试验溶液测定，理论板数按氨甲苯酸峰计应不低于3000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度应大于1.5；

(3)溶液制备：

取氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液适量，加流动相溶解或者稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg的溶液，过滤，作为供试品溶液(即，400μg/ml)；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含氨甲苯酸浓度为4μg/ml的溶液，作为对照溶液(即，4μg/ml)；

精密称取对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品适量，分别用流动相溶解并制成两种物质浓度均为4μg/ml的溶液，作为二种杂质的对照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml)；

精密称取氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品各适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、对甲基苯甲酸4μg、对羧基氯苄4μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液(即，400μg/ml+4μg/ml+4μg/ml)；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl、对甲基苯甲酸对照品溶液20μl、对羧基氯苄对照品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，确定各成分的保留时间，并读取各成分峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至对羧基氯苄保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积，当检测到存在对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄相对于氨甲苯酸的百分含量，即得到供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的含量(即，如果对照溶液主峰面积为100，供试品溶液色谱图中杂质对甲基苯甲酸的峰面积为115％，则对甲基苯甲酸相对于氨甲苯酸的百分含量，简称对甲基苯甲酸含量为1.15％；供试品溶液色谱图中杂质对羧基氯苄的峰面积为87％，则对羧基氯苄含量为0.87％)。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，所述色谱柱的规格是：柱长15～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，所述色谱柱的规格是：柱长20～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，所述色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，所述流动相中还添加1～2w/v％的冰乙酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加1.5w/v％的冰乙酸。已经发现，当在流动相中添加1.5w/v％的冰乙酸时，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为5.0min、11.3min、12.2min。两个杂质峰的出峰时间较晚，这是不利于色谱测定的。还发现，在流动相中添加1.5w/v％的冰乙酸时，在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.35～0.38％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；但是，同样地如果针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在1.82～1.96％范围内，对羧基氯苄的RSD均在1.48～1.53％范围内，显示这两种杂质的精密度不能满足要求。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述流动相中，如果不添加冰乙酸，对甲基苯甲酸、对羧基氯苄二者的分离度小于1.0，不能满足测定要求。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，所述流动相中还添加0.1～1w/v％的酒石酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加0.1～0.5w/v％的酒石酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加0.25w/v％的酒石酸。已经发现，当在流动相中添加0.25w/v％的酒石酸时，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为4.9min、7.8min、9.1min。两个杂质峰的出峰时间显示地提前，这将是有利于色谱测定的。还发现，在流动相中添加0.25w/v％的酒石酸时，在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.33～0.35％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；另外，针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在0.51～0.54％范围内，对羧基氯苄的RSD均在0.43～0.46％范围内，显示这两种杂质的精密度非常好，完全能够满足测定要求。在此流动相中添加0.25w/v％的酒石酸的色谱方法中，理论板数按氨甲苯酸峰计大于5000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度均大于2.0。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，其中还包括使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤。

根据本发明第二方面任一实施方案的氨甲苯酸，其中使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤中，根据供试品溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液中氨甲苯酸浓度，按外标法以峰面积计算供试品中氨甲苯酸的含量。

进一步，本发明第三方面提供了一种注射液，其中包括活性成分氨甲苯酸和注射用水。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，其是使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的方式进行质量控制的。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，其中使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤包括如下操作：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-水以体积比25∶15∶60为流动相，检测波长为230nm；取系统适用性试验溶液测定，理论板数按氨甲苯酸峰计应不低于3000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度应大于1.5；

(3)溶液制备：

取氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液适量，加流动相溶解或者稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg的溶液，过滤，作为供试品溶液(即，400μg/ml)；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含氨甲苯酸浓度为4μg/ml的溶液，作为对照溶液(即，4μg/ml)；

精密称取对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品适量，分别用流动相溶解并制成两种物质浓度均为4μg/ml的溶液，作为二种杂质的对照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml)；

精密称取氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品各适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、对甲基苯甲酸4μg、对羧基氯苄4μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液(即，400μg/ml+4μg/ml+4μg/ml)；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl、对甲基苯甲酸对照品溶液20μl、对羧基氯苄对照品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，确定各成分的保留时间，并读取各成分峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至对羧基氯苄保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积，当检测到存在对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄相对于氨甲苯酸的百分含量，即得到供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的含量(即，如果对照溶液主峰面积为100，供试品溶液色谱图中杂质对甲基苯甲酸的峰面积为115％，则对甲基苯甲酸相对于氨甲苯酸的百分含量，简称对甲基苯甲酸含量为1.15％；供试品溶液色谱图中杂质对羧基氯苄的峰面积为87％，则对羧基氯苄含量为0.87％)。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，所述色谱柱的规格是：柱长15～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，所述色谱柱的规格是：柱长20～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，所述色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，所述流动相中还添加1～2w/v％的冰乙酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加1.5w/v％的冰乙酸。已经发现，当在流动相中添加1.5w/v％的冰乙酸时，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为5.0min、11.3min、12.2min。两个杂质峰的出峰时间较晚，这是不利于色谱测定的。还发现，在流动相中添加1.5w/v％的冰乙酸时，在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.35～0.38％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；但是，同样地如果针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在1.82～1.96％范围内，对羧基氯苄的RSD均在1.48～1.53％范围内，显示这两种杂质的精密度不能满足要求。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述流动相中，如果不添加冰乙酸，对甲基苯甲酸、对羧基氯苄二者的分离度小于1.0，不能满足测定要求。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，所述流动相中还添加0.1～1w/v％的酒石酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加0.1～0.5w/v％的酒石酸。在一个实施方案中，所述流动相中还添加0.25w/v％的酒石酸。已经发现，当在流动相中添加0.25w/v％的酒石酸时，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为4.9min、7.8min、9.1min。两个杂质峰的出峰时间显示地提前，这将是有利于色谱测定的。还发现，在流动相中添加0.25w/v％的酒石酸时，在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.33～0.35％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；另外，针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在0.51～0.54％范围内，对羧基氯苄的RSD均在0.43～0.46％范围内，显示这两种杂质的精密度非常好，完全能够满足测定要求。在此流动相中添加0.25w/v％的酒石酸的色谱方法中，理论板数按氨甲苯酸峰计大于5000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度均大于2.0。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，其中还包括使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤。

根据本发明第三方面任一实施方案的注射液，其中使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤中，根据供试品溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液中氨甲苯酸浓度，按外标法以峰面积计算供试品中氨甲苯酸的含量。

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

根据本发明的的氨甲苯酸或其注射液，其中的活性成分是具有下式结构的化合物：

氨甲苯酸主要用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌肿、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等。通常而言氨甲苯酸注射液每瓶中的活性成分含量为0.1g。氨甲苯酸注射液通常通过静脉注射或滴注，一次0.1～0.3g(1支～3支)，一日不超过0.6g(6支)；或遵医嘱。在使用氨甲苯酸注射液时，患者要监护血栓形成并发症的可能性。对于有血栓形成倾向者(如急性心肌梗死)宜慎用。氨甲苯酸注射液一般不单独用于弥散性血管内凝血所致的继发性纤溶性出血，以防进一步血栓形成，影响脏器功能，特别是急性肾功能衰竭。如有必要，应在肝素化的基础上才应用本品。如与其他凝血因子(如因子Ⅸ)等合用，应警惕血栓形成。一般认为在凝血因子使用后8小时再用本品较为妥善。由于氨甲苯酸可导致继发肾盂和输尿管凝血块阻塞，血友病或肾盂实质病变发生大量血尿时要慎用。宫内死胎所致低纤维蛋白原血症出血，肝素治疗较本品为安全。慢性肾功能不全时用量酌减，给药后尿液浓度常较高。治疗前列腺手术出血时，用量也应减少。使用氨甲苯酸，期间，如出现任何不良事件和/或不良反应，请咨询医生。

氨甲苯酸为氨甲苯酸类抗纤维蛋白溶解药。具有与6-氨基乙酸、氨甲环酸相同的作用机理。其立体构形与赖氨酸相似，能竞争性地抑制纤溶酶与纤维蛋白的吸附，保护纤维蛋白，使其不被纤溶酶降解，从而达到止血作用。其抗纤溶活性比6-氨基已酸强4-5倍。氨甲苯酸在临床上通常可用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性或慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌症、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等。药代动力学方面，氨甲苯酸静注后有效血药浓度可维持3-5小时。服药24小时，36％±5％以原形随尿排出，静注则排出63％±17％，其余为乙酰化衍生物。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

在下面的例子中，使用的pH调节剂(在本发明中亦即酸碱调节剂)，如无另外说明，是1M氢氧化钠溶液或者1M盐酸溶液。下文各种试验是为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明技术方案的方法。在下面的试验中，所用到的对甲基苯甲酸、对羧基氯苄对照品，均市售购得，且均符合对照品要示。在下面配液制备各种组合物中，如未另外说明，每批的总配液量为1000瓶的量，但是列明配方时，均以每瓶含氨甲苯酸100mg的量阐明。

一、氨甲苯酸原料药的实例部分

原料药例1、制备氨甲苯酸原料药

(1)对氰基氯苄的氨解：向500mL四口瓶中加入甲苯(300mL)和对氰基氯苄(60g，0.396mol)，室温搅拌使溶解，得到对氰基氯苄甲苯液，备用；向1000mL四口瓶中加入乌洛托品(30g，0.214mol)和纯化水(270mL)，室温搅拌使溶解，冰盐浴冷却至5℃后加入28％氨水(135g，2.223mol)，然后开始向其中滴加对氰基氯苄甲苯液，滴加过程中控制内温不超过15℃，滴完后撤去冰盐浴，使内温在15～30℃搅拌反应3h，水浴加热至70～75℃，保温反应3h，液相色谱分析，对氰基氯苄反应完全；冷却至室温，静置分层，下层的氨水母液下批套用，上层的甲苯液中含有对氰基苄胺，备用。氨水母液的套用方法：向上述氨水母液中通入液氨，直至氨的质量浓度为9～10％，加入乌洛托品(30g)，冷却至5℃，滴加对氰基氯苄(60g)和甲苯(300mL)，可选用上批回收液)，操作同前，反应正常。再套用一次后，蒸出氨水回收，余液蒸馏回收氯化铵。

(2)对氰基苄胺的酸水解：向1000mL四口瓶中加入水(240mL)，搅拌下滴加硫酸(120g)，然后加入步骤1中制得的对氰基苄胺甲苯液，加热至80℃，停止搅拌，静置分层，上层的甲苯层返回步骤1中套用，下层的硫酸层加入500mL四口瓶中，搅拌条件下加热蒸水，待内温到达120℃，停止蒸水，保温回流4h；直至原料完全反应，冷却至90℃，加入纯化水(120mL)，冷却至室温，再搅拌1h，过滤析出的固体，硫酸母液下批套用；将所得的氨甲苯酸硫酸盐固体加入到水(240mL)中，搅拌lh，滴加氨水中和至中性，冷却至-5℃，过滤，水洗抽干，得氨甲苯酸粗品，称湿重85.1克，HPLC检测纯度约为99.6％；用2.5％氨水(550g)溶解，加入活性炭(3g)，搅拌，加热至75℃，保温反应2h，趁热过滤，滤液减压浓缩至200g左右后冷却至0℃，过滤，烘干，得到49g固体氨甲苯酸，HPLC检测纯度约为99.92％；滤液下批套用，三次后蒸水回收氨甲苯酸。

原料药例2、制备氨甲苯酸原料药

(1)对氰基氯苄的水解反应：在搅拌下将80毫升浓硫酸滴加到80毫升水中，然后加入38克对氰基氯苄，升温至120度左右，搅拌反应2-3小时，直至原料完全反应，补加120毫升纯化水，冷却降至室温，再搅拌一小时后过滤析出的白色固体，将所得水解产物重新悬浮于5-6倍量的纯化水中打浆1小时，过滤，水洗抽干得对氯甲基苯甲酸粗品，称湿重48.4克，HPLC检测纯度约为96％，不需精制，直接投入下一步氨化反应。

(2)对氯甲基苯甲酸的氨化：在500毫升三颈瓶中依次加入乌洛托品40克和80毫升纯化水，常温搅拌使溶解澄清，水浴冷却至20度以下加入上步得到的对氯甲基苯甲酸，搅拌半小时，然后开始滴加浓氨水，滴加过程中控制内温不超过25度，氨水滴完后撤去水浴，内温在15-30度左右搅拌反应2-3小时，薄层监测反应原料对氯甲基苯甲酸完全消失，(展开条件：二氯甲烷/甲醇＝3/1)，然后加入活性炭，搅拌15-30分钟，过滤。脱色处理后，40-50度减压旋蒸去除绝大部分氨和一小部分水分，蒸至pH值在7-8.5之间，有大量白色晶体析出，静止放冷至室温下，过滤析出的晶体，母液投入下一批套用；过滤后称湿品重量约为30克左右，然后重新用120毫升氨水溶解，减压蒸氨浓缩，约能得到18克左右的氨甲苯酸白色晶体，纯度99％以上，收率约在50-60％之间。

原料药例3、市售购得，产自江苏常州某公司。

原料药例4、市售购得，产自江苏扬州某公司。

原料药例5、市售购得，产自山西某公司。

原料药例6、来自湖南洞庭药业股份有限公司。

二、氨甲苯酸注射液的实例部分

注射液例1、制备氨甲苯酸注射液

在浓配罐中加入配制量50％的新煮沸的注射用水，加入氨甲苯酸，搅拌溶解；

加入药用炭(0.1％)，搅拌均匀；用苏州砂棒回滤脱炭至澄明后，滤入稀配罐中；

加入注射用水至全量(10ml:100mg)，搅拌15分钟，使其均匀；

用苏州砂棒、0.33μm聚醚砜折叠式滤器回滤；

取样做可见异物检查，同时取样送检测中心测中间体含量和PH值(pH6.5，必要时调节pH值至该值)，各项均合格后，将药液滤入贮液罐；

贮液罐中的药液经0.41μm聚醚砜折叠式滤器过滤，取样做可见异物检查合格后，输入座瓶供灌封；座瓶中通入氮气进行灌封；

在温度为121℃、时间为15分钟的条件下进行杀菌。

本实例使用原料药例1所得原料药进行试验。

注射液例2、制备氨甲苯酸注射液

照注射液例1的方法进行，不同的仅是将其中的氨甲苯酸原料改用原料药例2～6的原料药投料，得到5批注射液。

注射液例3、市售购得，产自长春某药厂。

注射液例4、市售购得，产自常州某药厂。

注射液例5、市售购得，产自徐州某药厂。

注射液例6、湖南洞庭药业股份有限公司市售品。

三、氨甲苯酸原料或其注射液的质量控制方法

方法例1：使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定

操作步骤如下：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱规格：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm)，以甲醇-乙腈-水以体积比25：15：60为流动相，检测波长为230nm；取系统适用性试验溶液测定，理论板数按氨甲苯酸峰计应不低于3000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度应大于1.5；

(3)溶液制备：

取氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液适量，加流动相溶解或者稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg的溶液，过滤，作为供试品溶液(即，400μg/ml)；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含氨甲苯酸浓度为4μg/ml的溶液，作为对照溶液(即，4μg/ml)；

精密称取对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品适量，分别用流动相溶解并制成两种物质浓度均为4μg/ml的溶液，作为二种杂质的对照品溶液(即，4μg/ml、4μg/ml)；

精密称取氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品各适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、对甲基苯甲酸4μg、对羧基氯苄4μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液(即，400μg/ml+4μg/ml+4μg/ml)；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl、对甲基苯甲酸对照品溶液20μl、对羧基氯苄对照品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，确定各成分的保留时间，并读取各成分峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至对羧基氯苄保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积，当检测到存在对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄相对于氨甲苯酸的百分含量，即得到供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的含量(即，如果对照溶液主峰面积为100，供试品溶液色谱图中杂质对甲基苯甲酸的峰面积为115％，则对甲基苯甲酸相对于氨甲苯酸的百分含量，简称对甲基苯甲酸含量为1.15％；供试品溶液色谱图中杂质对羧基氯苄的峰面积为87％，则对羧基氯苄含量为0.87％)。

照以上方法例1测定原料药例1～6的氨甲苯酸和注射液例1～6的氨甲苯酸注射液，令人遗憾的是，各样品中对甲基苯甲酸、对羧基氯苄二者的分离度均在0.86～0.90范围内，不能令人满意。

方法例2：使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定

参照方法例1，不同的仅是在三元系流动相中还添加1.5w/v％的冰乙酸。测定原料药例1～6的氨甲苯酸和注射液例1～6的氨甲苯酸注射液。

结果显示：

各样品中氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别平均大约为5.0min、11.3min、12.2min，两个杂质峰之间的分离度在1.5～1.7范围内，勉强能够接受；但是出峰时间较晚，这是不利于色谱测定的；

在进行精密度试验时，取同一批氨甲苯酸样品溶液(浓度为0.4mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按氨甲苯酸峰面积计算，RSD为通常在0.35～0.38％范围内，显示氨甲苯酸具有优良的精密度；但是，同样地如果针对供试品溶液、各杂质对照品溶液、系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，对甲基苯甲酸的RSD均在1.82～1.96％范围内，对羧基氯苄的RSD均在1.48～1.53％范围内，显示这两种杂质的精密度不能满足要求。

根据以上结果可知，当在注射液中添加少量冰乙酸时，尽管两个杂质之间的分离度勉强能够接受，但是它们的精密度差。

方法例3：使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定

参照方法例1，不同的仅是在三元系流动相中还添加0.25w/v％的酒石酸。测定原料药例1～6的氨甲苯酸和注射液例1～6的氨甲苯酸注射液。

结果显示：氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄三者的保留时间分别约为4.9min、7.8min、9.1min，两个杂质峰的出峰时间显示地提前；各原料药或注射液测定的氨甲苯酸峰精密度RSD在0.33～0.35％范围内、对甲基苯甲酸精密度RSD均在0.51～0.54％范围内，对羧基氯苄精密度RSD均在0.43～0.46％范围内，表明这两种杂质的精密度非常好，完全能够满足测定要求；在此添加0.25w/v％酒石酸的色谱方法中测定，理论板数按氨甲苯酸峰计大于5000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度均大于2.0。但是，在补充试验中，当将流动相中的0.25w/v％酒石酸改为0.25w/v％枸橼酸时，其测定结果却仍然与方法例2中的使用1.5％冰乙酸所得结果基本相同，而远不能达到酒石酸的优异效果，这是完全无法解释的。在补充试验中，将色谱柱的柱长改为20cm或30cm，柱内径4.6mm、填料粒径5μm，其余方法条件与方法例3相同，结果显示各项指标与方法例3基本相同。

方法例4：使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定

参照方法例1，不同的仅是在三元系流动相中还添加0.1w/v％的酒石酸。测定原料药例1～6的氨甲苯酸和注射液例1～6的氨甲苯酸注射液。结果与方法例3的基本上相同，各成分之间分离度好，精密度高。

方法例5：使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定

参照方法例1，不同的仅是在三元系流动相中还添加0.5w/v％的酒石酸。测定原料药例1～6的氨甲苯酸和注射液例1～6的氨甲苯酸注射液。结果与方法例3的基本上相同，各成分之间分离度好，精密度高。

方法例6：使用高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量

在上述方法例3、4、5中，测定原料药例1～6的氨甲苯酸和注射液例1～6的氨甲苯酸注射液供试品中的氨甲苯酸含量。对于每一批供试品，根据供试品溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液中氨甲苯酸浓度，按外标法以峰面积计算供试品中氨甲苯酸的含量。结果显示：使用全部的方法测定全部原料药中氨甲苯酸含量均在99.0～101.0％范围内；使用全部的方法测定全部注射液中氨甲苯酸含量均在标示量(即理论基础配液投料量)的98.0～103.0％范围内。显示出优良的方法学性能。

产业适用性

以上所述，仅为本发明的优选实施例，不能解释为以此限定本发明的范围，凡在本发明的权利要求书要求保护的范围内所做出的等同的变形和改变的实施方式均在本发明所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.对氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液进行质量控制的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其中使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的步骤包括如下操作：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-水以体积比25：15：60为流动相，检测波长为230nm；取系统适用性试验溶液测定，理论板数按氨甲苯酸峰计应不低于3000，氨甲苯酸、对甲基苯甲酸、对羧基氯苄各自之间的分离度应大于1.5；

(3)溶液制备：

取氨甲苯酸原料药或氨甲苯酸注射液适量，加流动相溶解或者稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg的溶液，过滤，作为供试品溶液；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含氨甲苯酸浓度为4μg/ml的溶液，作为对照溶液；

精密称取对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品适量，分别用流动相溶解并制成两种物质浓度均为4μg/ml的溶液，作为二种杂质的对照品溶液；

精密称取氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品、对羧基氯苄对照品各适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有氨甲苯酸0.4mg、对甲基苯甲酸4μg、对羧基氯苄4μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl、对甲基苯甲酸对照品溶液20μl、对羧基氯苄对照品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，确定各成分的保留时间，并读取各成分峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至对羧基氯苄保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积，当检测到存在对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中对甲基苯甲酸和/或对羧基氯苄相对于氨甲苯酸的百分含量，即得到供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄的含量。

3.根据权利要求1的方法，所述色谱柱的规格是：柱长20～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

4.根据权利要求1的方法，所述色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

5.根据权利要求1的方法，所述流动相中还添加1～2w/v％或者1.5w/v％的冰乙酸。

6.根据权利要求1的方法，所述流动相中还添加0.1～0.5w/v％或者0.25w/v％的酒石酸。

7.根据权利要求1的方法，其中还包括使用上述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤。

8.根据权利要求7的方法，其中使用所述高效液相色谱法测定供试品中的氨甲苯酸含量的步骤中，根据供试品溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液色谱图中氨甲苯酸峰面积、系统适用性试验溶液中氨甲苯酸浓度，按外标法以峰面积计算供试品中氨甲苯酸的含量。

9.作为药用原料药的氨甲苯酸，其是使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的方式进行质量控制的。

10.一种注射液，其中包括活性成分氨甲苯酸和注射用水，其是使用高效液相色谱法对供试品中的对甲基苯甲酸和对羧基氯苄进行含量测定的方式进行质量控制的。