CN105925668A - 棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法 - Google Patents

棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法，属于生物技术领域。利用海陆F2定位群体构建的近等基因混池，筛选获得具有多态性的引物,而后检测隐性基因混池的9个单株、P‑1、P‑2以及F1的DNA，逐一记录它们的带型。据此，统计隐性混池的9个单株与隐性亲本P‑1的带型一致的个体数，计算拟合率。选出与P‑1带型拟合率在60%以上，且F1带型为显性带或共显性带的多态性引物，然后用这少量的似然引物检测F2分离群体，统计带型，软件分析，即获得与该质量基因连锁的SSR引物。实施例显示，该方法使利用F2定位群体筛选目标连锁引物的范围缩减达90%以上；可快速锁定与目的质量基因连锁的SSR引物，有效地减轻了基因定位的工作量，极大地提升了质量基因在染色体的定位效率。

Description

棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法
一、技术领域
本发明涉及棉花质量基因在染色体的快速定位方法，属于生物技术领域。
二、背景技术
质量突变基因在染色体的定位是一项大海捞针的工作。在质量基因定位方法中，目前应用最为广泛的是BSA(Bulked Segregation Analysis)法，也称分离体分组混合分析法、混合分组分析法、集团分离分析法等。该方法首次由Michelmore等(1991)提出，并成功地在莴苣中筛选出与目的质量基因相连锁的标记。由于BSA建池时使用了特定的分离群体，并且在分组时仅对目标性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上应主要在目标基因区段存在差异，因此两基因池又被称为近等基因池。它排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。BSA法克服了很多作物难以得到近等基因系的限制，并且比近等基因系法省时省力，是一种非常实用的质量基因定位方法，应用极为广泛。
至于棉花，因其基因组大、染色体多，AD染色体组共有26对染色体。利用BSA法进行染色体定位：若采用陆陆杂交F2群体，在混池间可以获得的多态性引物很少；而采用海陆杂交F2定位群体，因其群体多态性丰富，在混池间易获得较多的多态性引物。迄今利用陆-陆杂交群体与海-陆杂交群体，在棉花质量突变体的基因定位中均有报道；但海陆杂交分离群体应用得更加广泛(景超等，2011；董承光等，2007；Yin JM et al.2009；刘吉焘等，2013；李峰利等，2014)。然而，利用海陆杂交F2群体构建的近等基因混池，虽然更容易筛选到较多的多态性引物，也有更大的可能性获得与目的基因连锁的分子标记；但以每个多态性引物逐一检测F2定位群体，而后筛选与目的基因连锁的引物，最终确定与目的基因连锁的引物，其工作量很大。故此，本发明拟在BSA法的基础上，提供一种关于棉花单位点质量突变基因在染色体定位的更加快捷的新方法，为提升棉花质量突变基因的定位效率提供技术支撑。
参考文献：
[1]Michelmore RW，Paran I，Kesseli RV.Identification ofmarkers linkedto disease resistance genes by bulked segregant analysis:A rapid method todetect markers in specific genomic regions using segregating populations.ProcNatlAcad Sci USA,1991.88(21)：9828-983
[2]景超，马晓杰，狄佳春，陈旭升.陆地棉超矮杆突变基因初步定位.遗传，2011，33(12):1393-1397
[3]董承光,丁业掌，郭旺珍，张天真.海岛棉Gl2 e显性无腺体基因的精细定位.科学通报,2007，52(20)：2374-2378
[4]Yin JM,Chen XS,Xiao SH,Xu NY,Die JC,Liu JG,Wu QJ.Molecular mappingof a new red mutant gene(Rs)in upland cotton.Plant Breeding，2009，128,(4)：416-419
[5]刘吉焘，马晓杰，狄佳春，陈旭升.棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位.江苏农业学报，2013，29(3)：480-484
[6]李峰利，狄佳春，赵亮，陈旭升.陆地棉皱缩叶突变体基因wr3的初步定位.遗传，2014，36(12)：1256-1260
三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种涉及棉花质量基因在染色体的快速定位方法,快速锁定与目的基因连锁的SSR引物，为提升质量基因在染色体定位的效率提供技术支持。
技术方案
一种棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法，包括：
1)F2定位群体的构建：利用海岛棉、陆地棉杂交F1，自交获得F2分离群体；棉花为大颗作物，但用于初步定位群体的大小一般不少于90个单株。其目的基因拟合一对质量基因 (即单位点质量基因)控制的遗传方式。
2)DNA的提取：采用棉株小真叶提取亲本及杂交F1、F2群体的DNA，如是人工合成的外源质量基因，也可直接以种子提取DNA。
3)F2群体质量基因检测：
如是人工构建的外源基因，因已知该基因序列，可设计特征引物对个体DNA做PCR扩增，在F2群体检测每个个体的目的质量基因，确定F2定位群体中外源基因的理论分离比例；
若是天然质量突变基因，在温室或大田依据该突变体的表型性状来鉴定群体中每一个体的显、隐性质量基因的表达，确定F2定位群体中突变基因的理论分离比例；
4)混池构建：在F2群体中筛选其中10棵显性基因的个体、10棵隐性基因的个体，取其等量DNA混合，构建目的基因的显性混池与隐性混池；
5)利用覆盖棉花26条染色体的234对核心引物，引物编号见表5 (注：经本发明筛选获得的234对SSR核心引物分布于棉花26对染色体上，每染色体各9对SSR引物，均是来自Cotton Marker Database，网址http://www.cottonmarker.org/公布的引物)。对两混池做PCR扩增，筛选在两混池间具有多态性的引物；
6)以混池获得的多态性引物，对隐性池的单株、隐性亲本P-1、显性亲本P-2以及F1的DNA样本，做PCR扩增，而后做PAGE凝胶电泳，记录隐性池单株以及P-1、P-2、F1的带型；
计数与隐性亲本P-1条带一致的个体有多少，计算拟合率，公式如下：
拟合率＝与隐性亲本P-1条带一致的个体数/总个体数×100％；
而后筛选与P-1带型拟合率在60％以上，且F1带型为共显性带或显性带的引物；即为与目的质量基因最大可能连锁的目标引物；
将上述与目的质量基因最可能连锁的目标引物检测F2群体的基因型，与“隐性亲本”带型相同的个体基因记为“1”，与“显性亲本”带型相同的记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”；通过JionMap4.0软件做连锁分析，确定与目的质量基因连锁的SSR引物，根据目标SSR引物所在的染色体，即将该质量基因初步定位在某一特定染色体上。
所述方法中，以混池获得的多态性引物，对隐性池的9个单株(注：采用隐性池的9个单株是为了点样操作方便：9个单株+P-1、P-2、F1，共占12个孔，而PCR扩增仪为96孔(8×12)，这样可以提高实验工效)、隐性亲本P-1、显性亲本P-2以及F1的DNA样本进行PCR扩增。
所述方法既适合棉花质量基因的染色体定位，也适合其他作物单位点质量突变基因的染色体定位中应用。
有益效果
本发明涉及棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法，在BSA技术的基础上，通过检测隐性基因混池9个单株、P-1、P-2以及F1的带型，计数与隐性亲本P-1条带一致的个体有多少，计算拟合率。筛选与P-1带型拟合率在60％以上，且F1带型为显性带或共显性带的引物。由此，可以筛选最大似然连锁的SSR引物，这少量的引物即是与目的质量基因最有可能连锁的引物。
据此，可将目标连锁引物的筛选范围急剧缩小，大大减少了以F2群体检测连锁引物的工作量；进而快速锁定与质量基因连锁的目标SSR引物。该方法使质量突变基因在染色体定位的工作量急剧减少，定位效率大大提高；并利用实施例证明该方法在实践上是切实可行的。
通过实施例显示，该方法使利用F2分离群体筛选连锁目标引物的范围缩小了90％以上；可快速锁定与目的质量基因连锁的SSR引物，有效地减轻了基因定位的工作量，极大地提升了质量基因在染色体的定位效率。
附图说明
图1、GK12与“胜利1号”杂交F2群体部分单株的Bt基因分离情况(注：泳道13、15、18、22、26、27、29、31、36、37、39、40、43无Bt特征条带，其他泳道有Bt特征条带)
图2、GK12的Bt抗虫基因在Chr.20的连锁遗传图
图3、DP33B与“胜利1号”杂交F2群体部分单株的Bt基因分离情况(注：泳道5、12、13、14、15、17、27、28、34、38、39、41无Bt特征条带，其他泳道有Bt特征条带)
图4、DP33B的Bt抗虫基因在Chr.26的连锁遗传图
具体实施方式
一般说来，成功的外源基因转化事件，其导入受体的外源基因大多以单位点方式整合，分离后代呈单基因控制的质量性状遗传方式。棉花导入外源Bt抗虫基因，使棉花产生了抗虫性。下面就以2个抗虫棉品种的Bt抗虫基因在染色体定位为实施例，来验证本发明在棉花质量基因定位中的有效性。
(一)国抗棉12号(GK12)的Bt抗虫基因定位
1.1试验材料
以非抗虫海岛棉亲本胜利1号_ (公知公用品种,见《棉花优良品种》，58页)为父本，国抗棉GK12_ (公知公用品种，见《中国棉花品种志》，222页)为母本，杂交得[GK12×胜利1号]F1，F1自交得基因定位分离群体F2。
1.2试验方法
1.2.1抗虫基因鉴定与群体质量分离规律调查
取样材料为双亲、F1、F2分离群体的种子，每粒种子作为1个样本单位。种子DNA的提取采用匡猛等(2010)的方法。
Bt基因特异性检测引物参照王奕海等(2009)的报道，国产Bt基因的设计片段大小为456bp。特征引物序列如下：
F:5’–CATCTTCACTCGGTAACATCG-3’；
R:5’–ATACGTGCCAAGTGCCAACC-3’。
分子标记的PCR扩增反应在PTC-200(MJ research)上进行。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性40s；56℃退火45s；72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。 扩增产物做8.0％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳：电泳缓冲液为1×TBE，200V恒压电泳。电泳结束后，参照张军等(2000)的方法进行染色。
统计各群体的有Bt个体、无Bt个体数量；而后对F2分离群体进行χ2适合性测验，确定抗虫基因的质量遗传方式。
1.2.2多态性引物筛选与抗虫基因定位
在F2群体，选取有Bt、无Bt个体各10个，取等量DNA混合。利用本实验室前期获得的分布于棉花26对染色体上的234对SSR核心引物(这些引物具有良好多态性，相对平均分布于棉花26对染色体上，每染色体平均9对引物)，先筛选F2近等基因混池的多态性引物。
而后用混池获得的多态性引物，对P-1、P-2、F1与隐性基因池的9个单株(无Bt)的DNA样本做PCR扩增，PAGE凝胶电泳。
以混池获得的多态性引物，对隐性池的9个单株(无Bt)、P-1、P-2以及F1的DNA样本，做PCR扩增，而后做PAGE凝胶电泳(注：采用隐性池的9个单株是为了点样操作方便：9个单株+P-1、P-2、F1，共占12个孔，而PCR扩增仪为96孔(8×12)，这样可以提高实验工效)。记录9个单株以及P-1、P-2、F1的带型。
计数与隐性亲本P-1条带一致的个体有多少，计算拟合率。公式如下：与隐性亲本P-1条带一致的个体数/总个体数×100％。
而后筛选与P-1带型拟合率在60％以上，且F1带型为共显性带或显性带的引物。
这少量的引物即是与目的质量基因最有可能连锁的引物。据此，可将目标连锁引物的范围急剧缩小，大大减少了以F2群体检测连锁引物的工作量。
将目标引物检测F2群体，统计多态性条带，与“隐性亲本”带型相同的个体基因记为“1”，与“显性亲本”带型相同的的记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”。
采用Join Map4.0软件进行分子标记的连锁分析和位点排序，通过JionMap4.0软件做连锁分析，根据目标SSR引物所在的染色体，确定Bt基因在染色体上的位置。
2、结果与分析
2.1、GK12的Bt基因F2代的分离规律
定位群体为[GK12×胜利1号]F2分离群体。利用特异Bt基因引物检测其海陆杂交分离F2群体部分单株的结果见图1。由图可见：具有Bt基因的单株在456bp处出现目标条带，显示该群体所含的抗虫基因为国产Bt基因。
F2群体Bt基因的分离结果见表1，其群体大小为92个个体。由表可见：GK12的Bt基因在F2分离群体也拟合3:1的理论分离比例，显示该Bt基因呈一对显性基因控制的质量遗传方式，即Bt抗虫基因在染色体上属于单位点插入；因此可利用SSR分子标记技术进行该质量基因的染色体定位。
表1、GK12和胜利1号杂交后代抗性分离情况
注：χ 2 0.05(1) ＝3.84
2.2构建“有Bt-无Bt”近等基因混池
筛选F2群体典型具有Bt基因的单株、没有Bt基因的单株各10个，取其等量DNA混合，构建“有Bt-无Bt”两近等基因混池。利用本实验室前期筛选获得的234对核心引物，通过对 “有Bt-无Bt”两近等基因混池进行差异标记筛选，共得到37对多态性引物(见表2)。
2.3目标引物的快速锁定
如采用利用传统的染色体定位方法，需要对以上37对引物，每对引物都通过F2定位群体进行筛选，而后确定与Bt抗虫基因连锁的目标引物，其工作是相当大的。本发明确定一个连锁引物的快速筛选标准：
即通过对隐性混池的9个单株以及P-1(隐性亲本)、P-2(显性亲本)、F1的DNA检测，记录9个单株以及P-1(隐性亲本)、P-2(显性亲本)、F1的带型，统计隐性混池的9个单株与隐性亲本P-1条带一致的个体数，据此计算拟合率。
筛选与P-1带型拟合率在60％以上，且F1带型为显性带或共显性带的多态性引物，即为最大似然目标引物。
根据该选择标准，在37对多态性标记中，只有2个SSR引物同时符合2个筛选条件要求，它们是位于第15染色体的NAU3040与位于第20染色体的NAU2579(见表2)。可以看出，本发明将连锁多态性引物的筛选范围从37对SSR引物快速缩减为2对，其缩减幅度达94.6％。
而后用这2对多态性引物检测F2作图群体的92个体的基因型，结果发现引物NAU2579与Bt抗性基因连锁，两者的遗传距离为3.3cM。已知引物NAU2579位于棉花第20染色体上；由此将Bt基因快速锁定在棉花第20染色体上。
表2、隐性混池9个单株筛选目标引物
注：与“无Bt亲本”带型相同的个体基因记为1，与“有Bt亲本”带型相同的的记为2，共显性杂合带型记为3。最大似然引物：即符合“F1的带型为显性带或共显性带，且拟合率在60％以上”条件的引物。
2.3国产Bt基因的遗传图谱构建
后续关于目的基因遗传图谱的构建，采用传统的方法略加改进。前述试验已将国产抗虫棉的Bt基因定位在染色体Chr.20；那么根据该引物在染色体Chr.20所在的位置，依据已公布的棉花遗传图谱(Zhao,L.et al，2012)，合成该引物上下距离50cM区间的其他引物。经过对双亲本的筛选，将获得的多态性引物检测F2群体每个单株的基因型，通过JoinMap4.0软件进行连锁遗传分析，结果表明共有13对引物与目的基因Bt相连锁，分别是NAU5307、cgr6022、BNL2570、NAU2698、NAU3531、NAU5013、BNL1253、NAU3907、NAU2579、NAU3813、NAU6219、BNL119、NAU3368。位于目的基因Bt两侧的分子标记分别为NAU2579和NAU3813，其中标记NAU2579与目的基因Bt的遗传距离为1.7cM，标记NAU3813与目的基因Bt的遗传距离为7.3 cM(见图2)。
(二)DP33B(新棉33B)的Bt抗虫基因定位
1.1试验材料
研究拟采用海陆杂交F2分离群体作为基因定位群体。选用非抗虫海岛棉亲本胜利1号为父本、DP33B(公知公用品种，见《中国棉花品种志》，390页)为母本，杂交得F1[DP33B×胜利1号]，F1自交得F2分离群体。
1.2试验方法
1.2.1分离群体Bt基因鉴定与群体质量分离规律
取样材料为双亲、F1、F2分离群体的种子，每粒种子作为1个样本单位。种子DNA的提取采用匡猛等(2010)的方法。Bt基因特异性检测引物参照王奕海等(2009)的报道，进行PCR扩增。国外Bt基因的设计片段大小为310bp。特征引物序列如下：
F:5’–AGGGAACCTTCATCGTGG-3’；
R:5’–ATACGTGCCAAGTGCCAACC-3’。
SSR分子标记的PCR扩增反应及PAGE胶染色方法同实施例1。统计各群体的有Bt个体、无Bt个体数量；而后对F2分离群体进行χ2适合性测验。
1.2.2多态性标记筛选与目的基因定位
在F2群体，选取有Bt、无Bt个体各10个，取等量DNA混合，组成两个近等基因混池。利用本实验室的234对SSR核心引物，先筛选F2近等基因混池的多态性差异标记。用混池获得的多态性引物，检测P-1、P-2、F1与隐性池的9个单株的DNA样本，做PCR扩增，PAGE凝胶电泳。统计多态性条带，与“胜利1号”带型相同的个体基因记为“1”，与“DP33B”带型相同的的记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”。采用Join Map4.0软件进行分子标记的连锁分析和位点排序，确定Bt基因在染色体上的位置。
2、结果与分析
2.1、DP33B的Bt基因在F2世代的分离规律
定位群体为[DP33B×胜利1号]F2分离群体， 群体大小为91个个体。F2部分单株的Bt基因检测见图3。由图可见：具有Bt基因的单株在310bp位置出现特征条带，显示该抗虫基因为美式Bt抗虫基因。
F2群体Bt基因的分离结果见表3。由表可见：DP33B的Bt抗虫基因在F2群体的分离：抗虫个体为73个、非抗虫个体为18个，其分离比例拟合3:1的理论比例，显示该Bt性状由一对显性质量基因控制。
表3、DP33B和胜利1号杂交F2抗性基因分离情况
注：χ 2 0.05(1) ＝3.84
以上经典遗传学研究已经显示：DP33B中的Bt抗虫基因在染色体上也属于单一位点整合方式；因此可利用SSR分子标记技术进行基因定位。筛选F2群体典型具有Bt基因的单株、没有Bt基因的单株各10个，取其等量DNA混合，构建“有Bt-无Bt”两近等基因混池。
2.2目标引物的快速锁定
利用234对核心引物，通过对定位群体F2的“有Bt-无Bt”两近等基因混池进行差异标记筛选，共得到20对多态性引物。而后用20多态性标记对P-1、P-2、F1以及隐性基因混池的9个单株，逐一过筛，结果发现只有2个引物符合本发明确定的筛选标准——即与隐性亲本条带的拟合率在60％以上，且F1的带型为3型。它们是位于第26染色体的引物NAU4925与NAU2912(见表4)。
可以看出，利用本方法将混池获得的20对多态性引物快速缩减为2对，其缩减幅度达90.0％。而后以这2对多态性引物检测F2作图群体的每个个体的基因型，结果发现引物NAU2912与Bt抗性基因连锁，两者的遗传距离为29.5cM。由此，将抗虫棉DP33B的Bt基因初步定位在棉花第26染色体上。
表4、隐性混池9个单株筛选目标引物
2.3、美式Bt基因的遗传图谱构建
已知NAU2912位于Chr.26的目标引物，合成距离其上下50cM区间的其他引物。经过对双亲本的筛选，对其中具有多态性的引物检测F2群体每个单株的基因型。通过JoinMap4.0软件进行连锁遗传分析，结果显示共有14对引物与目的基因Bt相连锁，分别是BNL3537、BNL3482、cgr5793、cgr6471、CIR085、HAU2027、NAU3236、NAU4912、dPL0380、NAU2912、cgr5787、dPL0796、NAU3920、NAU4089，位于目的基因Bt两侧的分子标记分别为NAU2912和cgr5787。其中标记NAU2912与目的基因的遗传距离为13.2cM，标记cgr5787与目的基因的遗传距离为14.7cM。图4就是该Bt基因的连锁遗传图谱。
参考文献：
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表5、234对SSR核心引物
SSR引物名称 所在染色体 SSR引物名称 所在染色体 SSR引物名称 所在染色体
NAU1067 1 NAU1042 5 BNL2590 9
NAU3911 1 NAU3325 5 NAU2591 9
NAU2083 1 JESPR197 5 NAU2723 9
NAU2419 1 NAU2140 5 NAU5166 10
NAU5107 1 NAU2561 5 NAU3917 10
NAU2182 1 NAU3273 5 NAU3454 10
NAU3690 1 NAU2714 6 NAU2935 10
NAU2095 1 BNL3359 6 BNL1665 10
NAU3254 1 NAU2967 6 NAU5316 10
NAU2896 2 NAU2611 6 NAU3122 10
NAU2858 2 NAU2971 6 NAU1182 10
NAU5383 2 NAU2128 6 BNL2960 10
NAU5384 2 NAU2580 6 BNL1231 11
BNL3971 2 NAU3206 6 NAU3480 11
NAU1072 2 NAU3900 6 BNL1066 11
NAU3485 2 NAU933 7 NAU2599 11
NAU3189 2 NAU3918 7 BNL1408 11
BNL1897 2 NAU2686 7 NAU3284 11
BNL3259 3 NAU3380 7 BNL3431 11
JESPR231 3 MUCS382 7 NAU1148 11
NAU1070 3 MUCS308 7 NAU2257 11
NAU1179 3 NAU5439 7 NAU2202 12
BNL2443 3 NAU5491 7 NAU3401 12
NAU3639 3 NAU2308 7 NAU3897 12
NAU3479 3 NAU3590 8 NAU4020 12
NAU3172 3 NAU3793 8 NAU3662 12
NAU3083 3 CIR343 8 NAU3713 12
BNL3089 4 NAU4080 8 BNL598 12
NAU3592 4 NAU3964 8 NAU2030 12
BNL4047 4 NAU1369 8 JESPR300 12
NAU3491 4 NAU2407 8 NAU2285 13
BNL530 4 JESPR232 8 NAU2038 13
BNL4049 4 NAU920 8 NAU2300 13
NAU3009 4 BNL686 9 NAU2871 13
NAU5236 4 JESPR274 9 NAU4104 13
NAU1151 4 BNL1162 9 BNL4029 13
NAU1137 5 NAU2832 9 NAU2893 13
BNL3452 5 NAU1360 9 NAU3723 13
NAU2494 5 BNL1317 9 BNL1707 13
续表5、234对SSR核心引物
SSR引物名称 所在染色体 SSR引物名称 所在染色体 SSR引物名称 所在染色体
NAU3464 14 NAU3017 18 NAU3437 22
NAU3573 14 BNL1079 18 JESPR220 22
NAU5465 14 BNL3558 18 NAU3392 22
NAU5027 14 NAU2094 18 NAU3100 23
NAU3913 14 NAU3011 18 NAU1025 23
BNL1059 14 NAU3685 18 NAU3732 23
NAU4009 14 NAU3656 19 BNL3511 23
NAU5499 14 NAU2233 19 NAU3967 23
NAU3903 14 NAU3372 19 NAU936 23
NAU3346 15 BNL852 19 NAU3829 23
NAU3714 15 BNL3811 19 NAU5189 23
BNL1667 15 NAU3698 19 NAU864 23
NAU2985 15 NAU2650 19 BNL1646 24
NAU3496 15 NAU3183 19 NAU5335 24
NAU3576 15 NAU2503 19 NAU3224 24
NAU2901 15 NAU2776 20 NAU2439 24
NAU3040 15 NAU5307 20 BNL3860 24
BNL2440 15 BNL2570 20 NAU3786 24
NAU3424 16 NAU2579 20 JESPR308 24
NAU2597 16 BNL119 20 NAU3010 24
NAU5152 16 NAU4014 20 BNL2597 24
NAU4956 16 NAU2888 20 BNL827 25
NAU2627 16 NAU3368 20 MUSS519 25
NAU5061 16 BNL3646 20 NAU2641 25
JESPR297 16 NAU3740 21 NAU3298 25
NAU2974 16 BNL3279 21 BNL3806 25
NAU3608 16 NAU3493 21 BNL3264 25
NAU2898 17 NAU2361 21 BNL3103 25
NAU3292 17 NAU3585 21 NAU905 25
NAU3257 17 NAU3156 21 BNL3594 25
NAU2325 17 NAU3240 21 NAU3271 26
NAU2909 17 MUSS532 21 NAU4925 26
NAU3800 17 NAU2653 21 NAU4089 26
BNL1606 17 NAU2634 22 NAU3920 26
BNL2496A 17 NAU2120 22 NAU2912 26
NAU2691 17 NAU2291 22 NAU2696 26
NAU2980 18 NAU3539 22 BNL3537 26
NAU3843 18 NAU3633 22 NAU3795 26
NAU4871 18 NAU2162 22 NAU3032 26
注:以上引物、编号的序列见Cotton Marker Database(http://www.cottonmarker.org/)。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法
<130> 0
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213>
<220>
<221> 国产Bt基因引物F
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 1
catcttcact cggtaacatc g 21
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<221> 国产Bt基因引物R
<222> (1)..(20)
<223>
<400> 2
Ala Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Cys Cys
20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 国外Bt基因引物F
<222> (1)..(18)
<223>
<400> 3
agggaacctt catcgtgg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 国外Bt基因引物R
<222> (1)..(20)
<223>
<400> 4
atacgtgcca agtgccaacc 20

Claims (6)

1.一种棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法，包括：
1）F2定位群体的构建：利用海岛棉、陆地棉杂交F1，自交获得F2分离群体；
2）DNA的提取：采用棉株小真叶提取亲本及杂交F1、F2群体的DNA，如是人工合成的外源质量基因，也可直接以种子提取DNA；
3）F2群体质量基因检测：
如是人工构建的外源基因，因已知该基因序列，可设计特征引物对个体DNA做PCR扩增，在F2群体检测每个个体的目的质量基因，确定F2定位群体中外源质量基因的理论分离比例；
若是天然质量突变基因，在温室或大田依据该突变体的表型性状来鉴定群体中每一个体的显、隐性质量基因的表达，确定F2定位群体中质量基因的理论分离比例；
4）混池构建：在F2群体根据表型或特异引物鉴定质量基因的分离情况，在该F2群体中筛选其中10棵显性基因的个体、10棵隐性基因的个体，取其等量DNA混合，构建目的基因的显性混池与隐性混池；
5）利用覆盖棉花26条染色体的234对核心引物，引物来自Cotton Marker Database，网址http://www.cottonmarker.org/公布的引物，其引物编号为NAU1067、NAU3911、NAU2083、NAU2419、NAU5107、NAU2182、NAU3690、NAU2095、NAU3254、NAU2896、NAU2858、NAU5383、NAU5384、BNL3971、NAU1072、NAU3485、NAU3189、BNL1897、BNL3259、JESPR231、NAU1070、NAU1179、BNL2443、NAU3639、NAU3479、NAU3172、NAU3083、BNL3089、NAU3592、BNL4047、NAU3491、BNL530、BNL4049、NAU3009、NAU5236、NAU1151、NAU1137、BNL3452、NAU2494、NAU1042、NAU3325、JESPR197、NAU2140、NAU2561、NAU3273、NAU2714、BNL3359、NAU2967、NAU2611、NAU2971、NAU2128、NAU2580、NAU3206、NAU3900、NAU933、NAU3918、NAU2686、NAU3380、MUCS382、MUCS308、NAU5439、NAU5491、NAU2308、NAU3590、NAU3793、CIR343、NAU4080、NAU3964、NAU1369、NAU2407、JESPR232、NAU920、BNL686、JESPR274、BNL1162、NAU2832、NAU1360、BNL1317、BNL2590、NAU2591、NAU2723、NAU5166、NAU3917、NAU3454、NAU2935、BNL1665、NAU5316、NAU3122、NAU1182、BNL2960、BNL1231、NAU3480、BNL1066、NAU2599、BNL1408、NAU3284、BNL3431、NAU1148、NAU2257、NAU2202、NAU3401、NAU3897、NAU4020、NAU3662、NAU3713、BNL598、NAU2030、JESPR300、NAU2285、NAU2038、NAU2300、NAU2871、NAU4104、BNL4029、NAU2893、NAU3723、BNL1707、NAU3464、NAU3573、NAU5465、NAU5027、NAU3913、BNL1059、NAU4009、NAU5499、NAU3903、NAU3346、NAU3714、BNL1667、NAU2985、NAU3496、NAU3576、NAU2901、NAU3040、BNL2440、NAU3424、NAU2597、NAU5152、NAU4956、NAU2627、NAU5061、JESPR297、NAU2974、NAU3608、NAU2898、NAU3292、NAU3257、NAU2325、NAU2909、NAU3800、BNL1606、BNL2496A、NAU2691、NAU2980、NAU3843、NAU4871、NAU3017、BNL1079、BNL3558、NAU2094、NAU3011、NAU3685、NAU3656、NAU2233、NAU3372、BNL852、BNL3811、NAU3698、NAU2650、NAU3183、NAU2503、NAU2776、NAU5307、BNL2570、NAU2579、BNL119、NAU4014、NAU2888、NAU3368、BNL3646、NAU3740、BNL3279、NAU3493、NAU2361、NAU3585、NAU3156、NAU3240、MUSS532、NAU2653、NAU2634、NAU2120、NAU2291、NAU3539、NAU3633、NAU2162、NAU3437、JESPR220、NAU3392、NAU3100、NAU1025、NAU3732、BNL3511、NAU3967、NAU936、NAU3829、NAU5189、NAU864、BNL1646、NAU5335、NAU3224、NAU2439、BNL3860、NAU3786、JESPR308、NAU3010、BNL2597、BNL827、MUSS519、NAU2641、NAU3298、BNL3806、BNL3264、BNL3103、NAU905、BNL3594、NAU3271、NAU4925、NAU4089、NAU3920、NAU2912、NAU2696、BNL3537、NAU3795、NAU3032，采用这234对核心引物对两混池做PCR扩增，筛选在两混池间具有多态性的引物；
6）以混池获得的多态性引物，对隐性池的单株、隐性亲本P-1、显性亲本P-2以及F1的DNA样本，做PCR扩增，而后做PAGE凝胶电泳，记录隐性池单株以及P-1、P-2、F1的带型；
计数与隐性亲本P-1带型一致的个体有多少，计算拟合率，公式如下：
拟合率=与隐性亲本P-1条带一致的个体数/总个体数×100%；
而后筛选与P-1带型拟合率在60%以上，且F1带型为共显性带或显性带的引物；即为与目的质量基因最大可能连锁的目标引物；
7）将上述与目的质量基因最大可能连锁的目标引物检测F2群体的基因型，与“隐性亲本”带型相同的个体基因记为“1”，与“显性亲本”带型相同的的记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”；通过JionMap4.0软件做连锁分析，确定与目的质量基因连锁的SSR引物，根据目标SSR引物所在的染色体，即将质量基因定位在某一特定染色体上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，F2定位群体的的大小不少于90个单株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以混池获得的多态性引物，对隐性池的9个单株、隐性亲本P-1、显性亲本P-2以及F1的DNA样本进行PCR扩增。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用棉株小真叶或种子提取亲本及杂交F1、F2群体的DNA。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用棉株小真叶或种子提取亲本及杂交F1、F2群体的DNA。
6.权利要求1-5所述方法在其他作物单位点质量突变基因的染色体定位中的应用。
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