CN105920621A - 一种基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧ct成像纳米探针及其制备方法 - Google Patents

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史红媛
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黄楚森
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Abstract

本发明公开了一种基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针，其特征在于，以Au@BSA作为探针载体，通过酰胺化反应，将其与功能基团NHA连接。与现有技术相比，本发明采用BSA包裹制备得到Au@BSA作为纳米探针载体，具有生物相容性好，高稳定性且较高的X线吸收系数等优点，有利于靶向纳米探针应用于活体CT成像。本申请以硝基咪唑作为肿瘤乏氧的靶向基团构建功能性纳米探针，将提高探针的敏感性，为肿瘤乏氧的评估及监测提供可靠的手段。

Description

一种基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针及其制备 方法
技术领域
本发明涉及CT成像纳米探针技术，尤其是涉及一种能够靶向肿瘤乏氧状态的CT成像纳米探针及其制备方法。
背景技术
乏氧是各种实体瘤普遍存在的现象。由于肿瘤失控性的生长和增殖消耗大量营养和氧气，导致氧气的需求量远远大于供应量，使肿瘤内呈乏氧状态。乏氧与肿瘤的恶行程度、侵袭性及预后等多种因素有关。另外，肿瘤细胞在乏氧环境下对放射治疗的敏感性会有较大程度的下降。因此对肿瘤乏氧进行非侵入性的显像、评估及监测，对肿瘤的早期诊断、制定治疗方案、评估治疗疗效及提高预后具有十分重要的意义。因此，临床上迫切需要一种非侵袭性且具有较高空间和时间分辨率的成像方法对肿瘤乏氧进行显像。
在肿瘤乏氧成像研究中，硝基咪唑类化合物是乏氧成像分子探针应用最广泛的靶向基团。目前，PET和光学成像是应用硝基咪唑基团作为分子探针研究乏氧成像较多的成像技术。但是考虑到PET成像的高辐射，难以在肿瘤病人治疗过程中反复监测。而光学成像虽具有较高的检测敏感度，但受限于空间分辨力，难以反映病灶的解剖学信息并且对组织的穿透能力较弱等缺点限制了其在临床的应用。因此，仍需构建新型的分子探针实现肿瘤的乏氧成像。近年来，具有较高X射线衰减系数且生物相容性较好的金属元素被越来越多的用作CT成像对比剂。如Au、Dy、Bi、Yb等金属元素，由于具有较高的原子序数所以对X射线具有较大的衰减系数和K边缘能量。与传统的碘对比剂相比，这些金属元素具有更大的优势。其中，金纳米粒子具有较高的X线吸收系数、良好的稳定性以及生物相容性等特点，已经广泛应用于分子影像探针和诊断治疗学纳米探针的构建中。本发明利用具有良好生物相容性的BSA制备得到Au@BSA作为CT纳米探针载体，并利用硝基咪唑基团作为肿瘤乏氧的靶向基团，构建具有肿瘤靶向乏氧CT成像功能的纳米探针。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针的制备方法，以高灵敏性实现活体肿瘤的乏氧靶向CT成像。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针，其特征在于，以Au@BSA作为探针载体，通过酰胺化反应，将其与功能基团NHA连接。
上述基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针的制备方法采用以下步骤：
(1)室温条件下，将HAuCl4溶液和BSA溶液混合均匀，在持续磁力搅拌下，逐滴加入NaBH4水溶液，反应完全后将得到的产物透析并冷冻干燥制备得到Au@BSA纳米粒子；
(2)乏氧功能基团NHA的合成：首先利用6-溴己酸乙酯把2-硝基咪唑烷化，再在浓盐酸条件下把乙烷基裂解掉，得到表面带有羧基的NHA；
(3)通过EDC/NHS活化剂将NHA上的羧基活化，与Au@BSA表面上的氨基相连，制备得到Au@BSA-NHA。
步骤(1)中HAuCl4和NaBH4的质量比是1:5～10。
步骤(2)的具体步骤为：
首先在单口烧瓶内加入乙腈，磁力搅拌下加入KCO3、2-硝基咪唑和6-溴己酸乙酯，将上述混合物加热至60℃反应6天；反应结束后加入KCO3使反应物的pH值调至7～8，之后用真空旋转蒸发仪悬蒸，将上述有机层液体清洗并用无水硫酸钠干燥后得到浅黄色油状液体，即得中间产物乙基-(2-咪唑基)己酸；将得到的中间产物乙基-(2-咪唑基)己酸溶解在浓盐酸中，室温搅拌过夜，最后将上述反应液体悬蒸得最终产物NHA。
与现有技术相比，本发明采用BSA包裹制备得到Au@BSA作为纳米探针载体，具有生物相容性好，高稳定性且较高的X线吸收系数等优点，有利于靶向纳米探针应用于活体CT成像。本申请以硝基咪唑作为肿瘤乏氧的靶向基团构建功能性纳米探针，将提高探针的敏感性，为肿瘤乏氧的评估及监测提供可靠的手段。
附图说明
图1为制备得到的Au@BSA-NHA的TEM照片。
图2为Au@BSA、NHA和Au@BSA-NHA紫外可见光谱图。
图3定量分析不同浓度下的Au@BSA-NHA在常氧和乏氧条件下的细胞吸收量(Au@BSA作为对照)。
图4为肿瘤小鼠注射Au@BSA-NHA前和注射后36h的活体CT图像。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
以下实施例中所采用的试剂包括：水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)、硼氢化钠(NaBH4)、2-硝基咪唑、6-溴己酸乙酯购买于上海安耐吉化学公司。99％冻干牛血清蛋白(BSA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例1：Au@BSA纳米粒子的制备
将冻干的牛血清白蛋白(BSA)(788mg,0.012mmol)配制成浓度为26mg/mL的BSA溶液，在持续磁力搅拌下迅速加入浓度为30mM的氯金酸溶液(HAuCl4·4H2O)。向上述混合液内逐滴缓慢加入NaBH4水溶液(2mL，50mg/ml)，并缓慢持续搅拌2h。之后将得到的产物透析并冷冻干燥后放4℃冰箱保存待用。
实施例2：Au@BSA-NHA纳米探针的制备
(1)首先在50mL单口烧瓶内加入30ml乙腈，磁力搅拌下加入4.9gKCO3(35.4mmol)，2.0g(17.7mmol)2-硝基咪唑和4.15g(18.6mmol)6-溴己酸乙酯，将上述混合物加热至60℃反应6天。反应结束后加入KCO3使反应物的pH值调至7～8，之后用真空旋转蒸发仪悬蒸，将上述有机层液体清洗并用无水硫酸钠干燥后得到浅黄色油状液体，即得中间产物乙基-(2-咪唑基)己酸。称取4.5g中间产物在10mL浓盐酸中，室温搅拌过夜。最后将上述反应液体悬蒸得最终产物NHA。
(2)称取162mg(0.7mmol)NHS和682mg(3.6mmol)EDC溶解在5ml去离子水中，加入162mg(0.7mmol)NHA。将上述反应物室温摇床4h以活化NHA上的羧基。待反应结束后将反应物逐滴缓慢加入上述Au@BSA溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后将产物透析并冷冻干燥。
所制得的Au@BSA-NHA纳米探针的TEM如图1所示。
图2的紫外可见光谱图证明NHA成功地连接到Au@BSA纳米粒子上。
实施例3：Au@BSA-NHA体外CT成像
将Au@BSA-NHA配制成不同浓度梯度的水溶液，分别置于200μL EP管中。使用GE公司宝石CT(Discovery CT750HD)进行扫描，扫描参数：选择FOV＝25.0cm，层厚＝0.625mm，球管管电压100kV，管电流80mA。扫描结束后在后处理工作站(AW4.4；GE HealthCare,USA)测量每一浓度溶液的CT值，每个样品分别测量三次，取平均值作为该样品的CT值。
实施例4：检验Au@BSA-NHA体外乏氧靶向的能力
对数生长期的BxPC-3细胞计数后，在两块6孔细胞培养板的每个孔中接种3×105个细胞在37℃，5％CO2条件下孵育过夜。弃掉旧的培养基，重新加入含不同浓度的Au@BSA-NHA的新鲜培养基(浓度梯度为50和100μg/mL)，将两块6孔板分别在常氧状态(95％O2)及乏氧状态下(1％O2)共孵育24h。孵育结束后，去除培养液，PBS洗涤、离心后用ICP-AES测细胞内Au的量，比较细胞在常氧和乏氧状态下对Au@BSA-NHA的吞噬量，同时与Au@BSA作对比，如图3所示。
实施例5：肿瘤活体靶向CT成像活体实验
人胰腺癌BxPC-3裸鼠皮下肿瘤模型建立成功后，待肿瘤直径达约0.5～0.8cm时(接种后大约10天)，腹腔注射100μL戊巴比妥钠麻醉后，尾静脉注射300μL(300mg Au/kg)Au@BSA-NHA，分别在注射前和注射后1，3，5，7，12，24，36和48h后行CT扫描，动态观察肿瘤内密度的变化。每个时间点扫3只鼠，扫描结束后测肿瘤部位的CT值。扫描参数：选择FOV＝25.0cm，层厚＝0.625mm，球管管电压100kV，管电流80mA。同时相同剂量下注射无靶向作用的Au@BSA作为对照。
实验例6：检验Au@BSA-NHA乏氧成像的灵敏性
利用与胰腺癌肿瘤乏氧水平不同的人纤维肉瘤HT-1080皮下肿瘤模型作对比，观察Au@BSA-NHA对两种肿瘤模型的CT成像差异。CT扫描方案见实施例5。
小鼠肿瘤活体CT成像见图4。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (4)

1.一种基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针，其特征在于，以Au@BSA作为探针载体，通过酰胺化反应，将其与功能基团NHA连接。
2.根据权利要求1所述的基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：
(1)室温条件下，将HAuCl4溶液和BSA溶液混合均匀，在持续磁力搅拌下，逐滴加入NaBH4水溶液，反应完全后将得到的产物透析并冷冻干燥制备得到Au@BSA纳米粒子；
(2)乏氧功能基团NHA的合成：首先利用6-溴己酸乙酯把2-硝基咪唑烷化，再在浓盐酸条件下把乙烷基裂解掉，得到表面带有羧基的NHA；
(3)通过EDC/NHS活化剂将NHA上的羧基活化后，与Au@BSA表面上的氨基相连，制备得到Au@BSA-NHA。
3.根据权利要求2所述的基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中HAuCl4和NaBH4的质量比是1:5～10。
4.根据权利要求2所述的基于金纳米粒子的靶向肿瘤乏氧CT成像纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：
首先在单口烧瓶内加入乙腈，磁力搅拌下加入KCO3、2-硝基咪唑和6-溴己酸乙酯，将上述混合物加热至60℃反应6天；反应结束后加入KCO3使反应物的pH值调至7～8，之后用真空旋转蒸发仪悬蒸，将上述有机层液体清洗并用无水硫酸钠干燥后得到浅黄色油状液体，即得中间产物乙基-(2-咪唑基)己酸；将得到的中间产物乙基-(2-咪唑基)己酸溶解在浓盐酸中，室温搅拌过夜，最后将上述反应液体悬蒸得最终产物NHA。
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