CN105920048B - 一种乌贼墨制剂与顺铂组合物在制备乳腺癌化疗药物中的应用 - Google Patents
一种乌贼墨制剂与顺铂组合物在制备乳腺癌化疗药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有乳腺癌化疗增效活性的乌贼墨制剂的制备方法及其应用,属于生物工程技术领域;本发明制备方法的步骤为:取乌贼墨汁,加入PBS,充分研磨后,进行超声波处理,然后离心去沉淀,于上清液中加入木瓜蛋白酶,水浴孵育,冷却后,离心去沉淀,上清液中加入氯仿与正丁醇混合液,充分混合后离心,取上层黄色清液,重复混合离心2~3次,合并黄色清液,采用旋转蒸发仪浓缩,浓缩液中加入无水乙醇,静置后离心,取沉淀,喷雾干燥后粉碎成细末,填入硬胶囊即可;本发明的乌贼墨制剂能抑制乳腺癌细胞活力与转移,还能通过抑制顺铂诱导的细胞自噬而协同增强顺铂促进三阴乳腺癌细胞的凋亡而实现杀伤作用,可用于肿瘤化疗的辅助治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种乌贼墨制剂与顺铂组合物在制备乳腺癌化疗药物中的应用,该制剂能增强顺铂对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤效果,属于生物工程技术领域。
背景技术
在医学上,癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤,一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤,是一种严重危害人们健康的常见病、多发病,统计结果显示,恶性肿瘤是仅次于心脑血管疾病的人类第二大死因。对于恶性肿瘤的治疗,常规疗法有手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗、免疫疗法、中医中药治疗等,目前常用的化疗药物都有较强的副作用,疗效也不尽理想,如顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、门冬酰胺、阿糖胞苷、长春新碱、6-硫嘌呤、阿霉素等,而紫杉醇等天然抗肿瘤药物不仅价格高昂,且其原料属于稀有保护树种,来源稀缺。
乌贼本名乌鲗,又称花枝、墨斗鱼或墨鱼,属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科,与章鱼和鱿鱼(又称枪乌贼)近缘。乌贼科动物,种类繁多,常见的有:金乌贼(SepiaesculentaHoyle,别名:乌鱼、墨鱼)、虎斑乌贼(SepiapharaonisEhrenberg,别名:花旗、花西、墨姆)、白斑乌贼(Sepia LatimanusQuoy et Gaimard,别名:花斑墨)、拟目乌贼(SepiaLycidasGray、别名:眼墨、花鸡姆、墨公)、罗氏乌贼(SepiarobsoniSasaki)、曼氏无针乌贼(Sepiellamaindronide Rochebrune,别名:日本无针乌贼、花拉子、麻乌贼、墨鱼、目鱼、疴血乌贼、血墨)等。乌贼的营养丰富,除可食用外,还具有很好的药用价值。
乌贼像其他的头足类一样,通过喷射黑色的墨汁防御外敌,乌贼的墨汁,由细小黑色颗粒构成的粘稠状的混悬液,含有多种活性成分,具有较高药用价值,早在《本草拾遗》中就有“腹中墨,主治血刺心痛”的记载。上世纪90年代,日本学者(Sasaki J,Ishita K,Takaya Y,et al.Anti-tumor activity ofsquid ink[J].Journal of NutritionalScience and Vitaminology,1997,43(4):455)从乌贼墨中分离出一种具有很好抗肿瘤作用的提取物。然后,乌贼墨逐渐成为研究者的关注热点,近年来,乌贼墨中的提取物所具有的功能活性被研究者们广泛开发研究,比如,抗肿瘤、抗氧化、降血压、抗菌性、抗溃疡、止血和延缓衰老的作用等等。科学家们对其抗肿瘤活性进行研究,发现其具有多种抗肿廇机制,比如乌贼墨有提高免疫功能,诱生细胞因子,诱导癌细胞凋亡,抑制癌细胞生长的作用等等。在国内研究乌贼墨抗肿瘤作用的学者有很多,《中国药师》2003年第6卷第10期,李孝东和袁建华所著的“乌贼墨抗肿瘤机制研究进展”,《福建中医学院学报》2004年第14卷第1期,黄枚所著的“乌贼墨抗癌活性的实验研究”,《中国海洋药物杂志》2012年第31卷第5期,张倩和张建民所著的“乌贼墨抗肿瘤活性研究进展”,都充分显示了乌贼墨在抗肿瘤药物开发中具有十分显著的潜在价值,对充分利用海洋资源、扩大药源也有深远意义。
中国发明“鱿鱼墨汁提取物的制备及其用于制造预防和治疗人类肿瘤的药物及食品”,申请号200410032014.8公开了鱿鱼墨汁提取物对癌细胞有显著抑制作用的提示,但其主要作用是用于预防恶性肿瘤的癌前病变,对用于化疗增效活性药物还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有乳腺癌化疗增效活性的乌贼墨制剂的制备方法及其应用,由于乌贼墨制剂能抑制乳腺癌细胞活力与转移,还能通过抑制化疗药物顺铂诱导的细胞自噬而协同增强顺铂促进三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡而实现杀伤作用,从而提升顺铂对乳腺癌细胞的杀伤效果,可用于肿瘤化疗的辅助治疗。
为实现上述发明的目的,本发明采取的技术方案如下:
一种具有乳腺癌化疗增效活性的乌贼墨制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)取冷冻乌贼墨囊于4℃解冻,取出墨汁,加入1~3倍体积冰冷的磷酸盐缓冲液PBS,PBS的pH值为 7.2,浓度为0.01M,充分研磨后,进行超声波处理,处理时间5s,间隔10s,次数20次;
(2)超声波处理的悬混液于4℃搅拌浸泡48~72小时,然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(3)离心液去沉淀,于上清液中加入木瓜蛋白酶,浓度至0.15%,55℃水浴孵育60min;
(4)再于100℃水浴加热20min,冷却后, 4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(5) 上述离心液去沉淀,于上清液中加入1/4倍体积氯仿与正丁醇混合液,混合液的体积比为1:1,充分混合,4℃静置20min;
(6)然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm,移出上层黄色清液备用;
(7)重复(5)、(6)步骤2~3次,合并黄色清液,采用旋转蒸发仪浓缩至1/4体积;
(8)浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇,4℃静置60min;
(9)于4℃离心10min,离心机转速为5000rpm,取沉淀,120℃喷雾干燥;
(10)将干燥后的粗粉粉碎成细末,填入硬胶囊,每粒0.20~0.30g。
在乌贼墨制剂和顺铂单独或联合作用下,进行以下参数检测以评估乌贼墨制剂对顺铂乳腺癌细胞杀伤效果的协同增效作用。
利用中效原理结合CCK8细胞活力检测法,分析乌贼墨制剂及顺铂使用剂量,结果表明,顺铂和乌贼墨提取物中效浓度分别为4.9μg/ml和1659.6μg/ml,两药合用指数小于1,表明,乌贼墨制剂对顺铂的抗肿瘤具有较强的协同增效作用,见图1。
利用平板克隆形成技术、细胞划痕技术以及蛋白质印记技术,检测在乌贼墨制剂或/顺铂作用下,MDA-MB-231细胞的增殖能力、迁移与转移能力,结果表明乌贼墨制剂明显增强了顺铂对该乳腺癌细胞的增殖、迁移与转移的抑制作用,同时,乌贼墨制剂自身对该细胞的增殖、迁移与转移能力也具有较好的抑制效果,见图2、图3、图4。
利用分子生物学技术分析三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡情况,结果表明,乌贼墨制剂与顺铂均能很好的介导该癌细胞发生凋亡,并且两药合用,促凋亡效果更佳,见图5、图6、图7、图8。
利用分子生物学技术检测该乳腺癌细胞自噬情况,结果发现,乌贼墨制剂对该细胞的自噬没发生影响,但顺铂诱导了乳腺癌细胞内高水平自噬,然而,在乌贼墨制剂的干预下,该自噬作用被有效的抑制,见图9、图10、图11。
本发明的有益效果是:
1. 乳腺癌细胞MDA-MB-231对顺铂产生的耐药作用与顺铂诱导产生的细胞自噬有关;
2. 乌贼墨制剂介导乳腺癌细胞凋亡,但对自噬无影响。表明乌贼墨制剂对乳腺癌细胞不能产生保护效应,且产生有效的杀伤效果;
3. 乌贼墨制剂能通过抑制顺铂诱导的细胞自噬降低耐药性而增强顺铂对乳腺癌细胞的杀伤作用;
4. 乌贼墨制剂能增强顺铂对乳腺癌细胞增殖与转移的抑制作用;
5. 由于乌贼墨制剂对乳腺癌细胞的杀伤作用弱于顺铂,且能提升顺铂对乳腺癌细胞的杀伤效果,因此,乌贼墨制剂可以作为化疗增效药物或增敏药物,用于肿瘤化疗的辅助治疗。
综上所述,乌贼墨制剂既能抑制乳腺癌细胞活力与转移,还能通过抑制化疗药物顺铂诱导的细胞自噬而协同增强顺铂促进三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡而实现杀伤作用。
附图说明
图1乌贼墨制剂与顺铂的合用指数;
图2乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞活力的抑制效果,其中abcd p<0.05,ABC p<0.01;
图3乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制效果,其中abcd p<0.05,ABCD p<0.01;
图4乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞转移关键基因表达的抑制效果 ,其中深色为MMP-2,浅色为MMP-9,abc p<0.05,AB p<0.01;
图5 乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞凋亡的促进作用,其中深色为早期凋亡率,浅色为总凋亡率,abcd p<0.05,ABC p<0.01;
图6乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞caspase 3基因表达的促进作用,其中abcd p<0.05,ABCD p<0.01;
图7乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞bcl-2基因表达的抑制作用,其中abc p<0.05,ABC p<0.01;
图8乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞bax基因表达的促进作用,其中abc p<0.05,ABC p<0.01;
图9乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞自噬的抑制或促进作用,其中abc p<0.05,AB p<0.01;
图10乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞LC蛋白活化的促进或抑制作用,其中abc p<0.05,AB p<0.01;
图11乌贼墨制剂与顺铂的单用或合用对MDA-MB-231细胞beclin-1基因表达的促进或抑制作用,其中ab p<0.05,AB p<0.01。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明,这些实例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围;
实施例1
一种具有乳腺癌化疗增效活性的乌贼墨制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)取冷冻乌贼墨囊于4℃解冻,取出墨汁,加入1倍体积冰冷的磷酸盐缓冲液PBS,PBS的pH值为 7.2,浓度为0.01M,充分研磨后,进行超声波处理,处理时间5s,间隔10s,次数20次;
(2)超声波处理的悬混液于4℃搅拌浸泡48小时,然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(3)离心液去沉淀,于上清液中加入木瓜蛋白酶,浓度至0.15%,55℃水浴孵育60min;
(4)再于100℃水浴加热20min,冷却后, 4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(5) 上述离心液去沉淀,于上清液中加入1/4倍体积氯仿与正丁醇混合液,混合液的体积比为1:1,充分混合,4℃静置20min;
(6)然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm,移出上层黄色清液备用;
(7)重复(5)、(6)步骤2~3次,合并黄色清液,采用旋转蒸发仪浓缩至1/4体积;
(8)浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇,4℃静置60min;
(9)于4℃离心10min,离心机转速为5000rpm,取沉淀,120℃喷雾干燥;
(10)将干燥后的粗粉粉碎成细末,填入硬胶囊,每粒0.20g。
实施例2
一种具有乳腺癌化疗增效活性的乌贼墨制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)取冷冻乌贼墨囊于4℃解冻,取出墨汁,加入3倍体积冰冷的磷酸盐缓冲液PBS,PBS的pH值为 7.2,浓度为0.01M,充分研磨后,进行超声波处理,处理时间5s,间隔10s,次数20次;
(2)超声波处理的悬混液于4℃搅拌浸泡72小时,然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(3)离心液去沉淀,于上清液中加入木瓜蛋白酶,浓度至0.15%,55℃水浴孵育60min;
(4)再于100℃水浴加热20min,冷却后, 4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(5) 上述离心液去沉淀,于上清液中加入1/4倍体积氯仿与正丁醇混合液,混合液的体积比为1:1,充分混合,4℃静置20min;
(6)然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm,移出上层黄色清液备用;
(7)重复(5)、(6)步骤2~3次,合并黄色清液,采用旋转蒸发仪浓缩至1/4体积;
(8)浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇,4℃静置60min;
(9)于4℃离心10min,离心机转速为5000rpm,取沉淀,120℃喷雾干燥;
(10)将干燥后的粗粉粉碎成细末,填入硬胶囊,每粒0.30g。
实施例3
一种具有乳腺癌化疗增效活性的乌贼墨制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)取冷冻乌贼墨囊于4℃解冻,取出墨汁,加入2倍体积冰冷的磷酸盐缓冲液PBS,PBS的pH值为 7.2,浓度为0.01M,充分研磨后,进行超声波处理,处理时间5s,间隔10s,次数20次;
(2)超声波处理的悬混液于4℃搅拌浸泡60小时,然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(3)离心液去沉淀,于上清液中加入木瓜蛋白酶,浓度至0.15%,55℃水浴孵育60min;
(4)再于100℃水浴加热20min,冷却后, 4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(5) 上述离心液去沉淀,于上清液中加入1/4倍体积氯仿与正丁醇混合液,混合液的体积比为1:1,充分混合,4℃静置20min;
(6)然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm,移出上层黄色清液备用;
(7)重复(5)、(6)步骤2~3次,合并黄色清液,采用旋转蒸发仪浓缩至1/4体积;
(8)浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇,4℃静置60min;
(9)于4℃离心10min,离心机转速为5000rpm,取沉淀,120℃喷雾干燥;
(10)将干燥后的粗粉粉碎成细末,填入硬胶囊,每粒0.25g。
在乌贼墨制剂和顺铂单独或联合作用下,进行以下参数检测以评估乌贼墨制剂对顺铂乳腺癌细胞杀伤效果的协同增效作用。
利用中效原理结合CCK8细胞活力检测法,分析乌贼墨制剂及顺铂使用剂量,结果表明,顺铂和乌贼墨提取物中效浓度分别为4.9μg/ml和1659.6μg/ml,两药合用指数小于1,表明,乌贼墨制剂对顺铂的抗肿瘤具有较强的协同增效作用,见图1。
利用平板克隆形成技术、细胞划痕技术以及蛋白质印记技术,检测在乌贼墨制剂或/顺铂作用下,MDA-MB-231细胞的增殖能力、迁移与转移能力,结果表明乌贼墨制剂明显增强了顺铂对该乳腺癌细胞的增殖、迁移与转移的抑制作用,同时,乌贼墨制剂自身对该细胞的增殖、迁移与转移能力也具有较好的抑制效果,见图2、图3、图4。
利用分子生物学技术分析三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡情况,结果表明,乌贼墨制剂与顺铂均能很好的介导该癌细胞发生凋亡,并且两药合用,促凋亡效果更佳,见图5、图6、图7、图8。
利用分子生物学技术检测该乳腺癌细胞自噬情况,结果发现,乌贼墨制剂对该细胞的自噬没发生影响,但顺铂诱导了乳腺癌细胞内高水平自噬,然而,在乌贼墨制剂的干预下,该自噬作用被有效的抑制,见图9、图10、图11。
Claims (3)
1.一种乌贼墨制剂与顺铂的组合物在制备乳腺癌化疗药物中的应用,乌贼墨制剂具有化疗增效或增敏的作用,乌贼墨制剂的制备方法为:
(1)取冷冻乌贼墨囊于4℃解冻,取出墨汁,加入1~3倍体积冰冷的磷酸盐缓冲液PBS,充分研磨后,进行超声波处理;
(2)超声波处理的悬混液于4℃搅拌浸泡48~72小时,然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(3)离心液去沉淀,于上清液中加入木瓜蛋白酶,浓度至0.15%,55℃水浴孵育60min;
(4)再于100℃水浴加热20min,冷却后, 4℃离心60min,离心机转速为8000rpm;
(5) 上述离心液去沉淀,于上清液中加入1/4倍体积氯仿与正丁醇混合液,充分混合,4℃静置20min;
(6)然后4℃离心60min,离心机转速为8000rpm,移出上层黄色清液备用;
(7)重复(5)、(6)步骤2~3次,合并黄色清液,采用旋转蒸发仪浓缩至1/4体积;
(8)浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇,4℃静置60min;
(9)于4℃离心10min,离心机转速为5000rpm,取沉淀,120℃喷雾干燥;
(10)将干燥后的粗粉粉碎成细末,填入硬胶囊,每粒0.20~0.30g。
2.根据权利要求1所述一种乌贼墨制剂与顺铂的组合物在制备乳腺癌化疗药物中的应用:其特征在于:步骤(1)所述磷酸盐缓冲液PBS的pH值为 7.2,浓度为0.01M;所述超声波处理的处理时间5s,间隔10s,次数20次。
3.根据权利要求1所述一种乌贼墨制剂与顺铂的组合物在制备乳腺癌化疗药物中的应用:其特征在于:步骤(5)所述氯仿与正丁醇混合液的体积比为1:1。
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