CN105900829A

CN105900829A - 一种基于离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法

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Publication number: CN105900829A
Application number: CN201610237241.7A
Authority: CN
Inventors: 李光友; 徐建民; 陆钊华; 吴世军
Original assignee: Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2036-04-15
Also published as: CN105900829B

Abstract

本发明公开了一种基于离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法。本发明方法以尾叶桉为母本，细叶桉为父本，得到尾细桉人工杂交种为育种和注入的材料，通过改进种子承载盘的厚度和大小，以及优化离子注入条件，快速实现植物变异，最终由优化育苗和管理技术、选择合适测定指标和标准实现目的性状和持续育种材料的快速选择，在较短时间内获得尾细桉人工杂交种优良变异品系的方法。本发明提高了尾细桉人工杂交种的正向变异频率，苗期正向变异株率可达到28.3%且损伤轻，变异性状稳定，当代可以利用，大大缩短育种周期。

Description

一种基于离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法

技术领域

本发明属于林业生物技术育种及林木培育领域，特别涉及一种基于离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法。

背景技术

桉树属于桃金娘科(Myrtaceae)，原产于澳洲及其邻近岛屿，近百年来被引种到世界各地的热带、亚热带地区。桉树既可绿化造林，也能作为重要的工业用材树种、优良制浆造纸原料，具有良好的社会、生态和经济效益。桉树适生于阳光充足、温暖湿润、肥沃疏松的立地，能耐干旱和瘠薄，在中国华南地区低山、丘陵广泛种植，适应铁质砖红壤、赤红壤、山地赤红壤等多种立地类型。桉树经引种、人工杂交改良、无性繁殖及推广应用在中国近三十年取得重大进展，成效显著、影响深远。桉树无性系人工林满足了中国当前社会对于木材和多种效益的巨大需求，但生态和抗逆性要求在实现桉树无性系林业的今天需要桉树新品系不断推陈出新，通过人工杂交产生新品系结合各种技术手段才能快速获得目的品系及真正兼顾多种效益，实现人工林的健康利用和可持续发展。

常规的桉树遗传改良包括自然和人工杂交选育，其过程繁杂、建立试验林面积大，时间长、技术要求高、受环境影响大，因此决定了新品系推出迟缓，常常需要十数年即三个轮伐期左右。

人工杂交种基于离子注入的快速育种方法在于通过选择优良亲本产生更多具有目的基因的优良子代，处理后人工杂种子代表现为：(1)有益变异频率可达到1%以上且损伤轻；(2)变异的类型多，易选择到目的品种；(3)变异性状易稳定，缩短育种周期。通过非常规生物育种和优选培育技术实现快速正向突变后代的高保存率和高入选率。

目前应用人工杂交种基于离子注入快速育种方法的研究较少，相应的方法以及条件还不成熟。人工杂交种中可能有好的目标品系，通过离子注入后可能获得更好的变异诸如抗病和更抗风，从而选择得到需要选育的品种。但是离子注入的缺陷在于与天然林中一步就能选择到好的新品种一样存在运气成份。因此如何改进现有技术，扩大变异频率，获得能在极端环境（如台风区）健康成长的桉树新品种具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，通过广泛栽培和调查种源/家系测定林，找到适合人工杂交的优良尾叶桉和细叶桉亲本，根据遗传学原理获得表现优良的子代，基于N⁺离子注入方法提高优良子代变异频率和种子萌发率，结合优化育种和栽培技术方法，最终快速选择到稳定可靠的尾细桉杂交优株以形成新的无性系。该技术方法以尾细桉人工杂交种子为优先入选育种材料，选取合适注入离子浓度进行处理，获得萌发率高和变异频率大的子代并育苗培植，按入选标准选择正向变异苗木，结合优化育苗管理措施和大田生长选择标准，在短时间内选育出目的新品种，满足生产要求，降低台风和病虫害危害风险，提高生态效益，实现人工林可持续发展。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于N⁺离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法，包括以下步骤：

1)亲本选择：以尾叶桉为母本，细叶桉为父本；

2)种子的收集和准备

每年9月～12月，用细叶桉优树花粉对尾叶桉进行人工授粉，收集得到人工杂交种子；

3)种子承载盘的制作

种子承载盘为铝盘，厚度为2.1～3.0 mm，盘大小为(6.5～7)×(6.5～7)cm²，实际注入区域面积为(5.5～6)×(5.5～6)cm²；在注入区域内粘上胶条，优选双面胶，以粘附不同品系种子；

4)种子离子注入处理

在磁场强度为1.0×10^-2～4.0×10^-2 T，电流强度为1～3A，50 kev～80 kev，1×10¹⁵ e/cm²～5×10¹⁵e/cm²剂量的条件下，抽注入室真空度至10^-5～10^-3Pa，优选的，抽注入室真空度至10^-3Pa。注入N⁺离子，收集并保存注入后种子，用于播种；

5)播种育苗

播种时间为每年9～11月，将种子播种于育苗塑料盘，于荫棚中培养；盘中播种基质为过15～30目筛的黄心土，种子均匀播于盘中，上覆细沙土；

6)营养袋育苗

待苗高1～2cm时将其移栽到营养袋中进行培养；营养袋育苗基质为泥炭土、珍珠岩、椰糠和黄心土按体积比（1～1.5）：（1～1.5）：2：2混合得到；将营养袋育苗基质装入袋中，每袋植1苗；

7)造林，苗期及林分突变优株的选择方法

苗高15～22 cm时将其用于出圃造林或继续留圃观察、取样和测定；对移入营养袋2个月以上的苗木，进行根、茎、叶等器官损伤率的测定，同时对突变株进行正、负向选择，将正向突变株及对照苗上山造林，将半个轮伐期5年作为生长期突变株选择标准，确定育种结果的稳定性，获得优良家系或单株，将优良家系保存作为多世代育种材料，而单株材料则通过扦插、嫁接或组培形成新无性系，为无性系扩繁做准备。

优选的，步骤（1）中，母本尾叶桉为印度尼西亚Mt. Egon的14534种源，父本细叶桉为澳大利亚昆士兰州North of Laura的13659种源。这两个种源经早期测定确认为各自树种中的优良种源。

本发明研究中对下述种源进行了筛选，母本种源包括尾叶桉13010、14532、14533、14534、17572和17565，通过早期试验发现14534种源无论生长及离子注入后的效果都好于其它种源；父本种源包括13659和13398，以13659生长和处理效果较好。因此优选出尾叶桉14534种源为母本，细叶桉13659种源为父本。

优选的，步骤2)中，每年9月～12月，将事先收集的细叶桉优树花粉授于套袋的去除雄蕊的尾叶桉花蕾柱头上，获得尾细桉杂交种子，于翌年3～5月收集蒴果和人工杂交种子，按种源/家系分别收集。

优选的，收集的种子必须成熟、饱满，并过筛去除所有未成为种子的蒴果内丝状杂质，仅将种子小粒集中收集供下一步使用。一般含杂质的1 kg桉树种子可育苗20万株左右，成熟种子为深褐色，纯净种子千粒重2～3 g；所述的筛子的孔径为50目。

为防止由于种子放置时间太长而影响播种出苗率，种子收集后在低温冰箱内保存，温度设置为4 ℃，5～7年种子仍有较高活力，但播种或注入前需要进行发芽率试验，以免育苗量不能满足造林试验。

步骤3)中种子承载盘的制作：选用铝板，厚度为2.1～3.0 mm，盘大小为(6.5～7)×(6.5～7)cm²，实际注入区域面积为(5.5～6)×(5.5～6)cm²；在注入区域内粘上胶条，优选双面胶，以粘附不同品系种子。

现有技术中，承载盘厚度为0.8～2.0 mm，相对偏薄，种子容易受注入伤害；如果承载盘太厚，又会影响种子的注入效果。本发明优选出厚度为2.1～3.0 mm的铝板，这样能达到良好的注入效果，又避免了种子受到注入伤害，得到最优的处理程度。现有技术中，承载盘中的实际注入区域面积为5×5 cm²，面积相对较小，在同一剂量下处理的种子较少；如果需要处理大批量种子时，使用现有的承载盘则费时费力。所以本发明将承载盘大小优选为(6.5～7)×(6.5～7)cm²，实际注入区域面积为(5.5～6)×(5.5～6)cm²。

优选的，步骤3）中制作种子承载盘的铝盘表面或四周光滑平整，其中盘中央增加到6×6 cm²的种子摊放处理空间，可以增加一次性种子注入量且注入板受照射度更均匀，由此节约了注入总时间。同时在摊放种子前在铝盘中央粘贴双面胶，防备种子移动或多品系种子混杂；注入时备多个承载盘，分别承放不同品系种子，相同浓度注入时1次可同时注入多个品系。所述的承载盘只使用单面，在铺放种子前需在盘中注入区域内粘贴双面胶，既能隔离不同杂交种，也能防止注入时种子产生跳离而混入它品种中，胶要平整贴好，不能有气泡，注入面朝上。

优选的，所述的离子注入处理每承载盘种子量不高于1000粒，一般为500～1000粒，能够满足苗期测定、留圃苗测定和至少三个地点的试验林营建苗量，亦能满足1～2次不同年份的试验重复和种子复检；所述承载盘，同一盘上所有种子注入剂量相同。

根据三个点试验或三次试验离子注入效果，每次需250粒种子左右，则同一剂量需要750粒，扣除不发芽或处理致死的种子后，1000粒基本符合试验量，而6×6cm²承载盘根据种子大小不能再超过1000粒，否则会重叠造成少量种子不能被注入，影响实验效果。

优选的，优选方案即注入N⁺浓度为3×10¹⁵ e/cm²，此浓度处于造成萌发率、器官损伤度和苗期正向突变株率极差值最大的两个注入浓度中间，能获得最佳效果。优选方案最终获得的尾细桉人工杂交种萌发率达到74.04%、地径的器官损伤度可达-201.57%、苗期正向突变株率为28.30%和5年生林木正向突变株率为15.66%。而对比例中所用的7个N⁺浓度，包括1×10¹⁴，1×10¹⁵，1×10¹⁶，5×10¹⁶，1×10¹⁷，2×10¹⁷，3×10¹⁷ N⁺/cm²，平均值计算得到萌发率为33%，地径损伤度为-119.30～23.60%，苗期正向突变株率为2.56%，5年生时林分正向突变株为1.47%，远远低于本发明最佳方案的结果。

优选的，步骤4）注入后种子滞留腔体冷却10分钟后移出，用薄刀片小心触底刮落承载盘上种子至编号封口袋中，保存待用。

优选的，步骤5）中，所述的播种时间是与造林季节相适应，采用10月份播种；播种前1天喷淋1wt‰的高锰酸钾溶液对育苗塑料盘和播种基质进行消毒，按每盘均匀撒播250～300粒同一品系种子；播种后仍喷淋1wt‰的高锰酸钾溶液于育苗塑料盘进行消毒，直至苗盘土完全湿润为止。

步骤5），将种子均匀播于盘的黄心土中，上覆一层细沙土，整个育苗塑料盘在覆细沙后总高度低于盘0.8～1.2 cm。这样做的好处是，防止基质溢出来，防止造成苗根裸露，引起倒伏；此外，如果沙与盘面或容器面一样高时会影响浇水效果。

优选的，步骤5）育苗塑料盘下有6～8个直径0.5～1 cm的排水孔以方便排水；播种后的育苗塑料盘放置在高为15～20cm的平台。放置在高台的原因是，一方面防止积水，另一方面不受地面昆虫影响，还能在下面形成通风层，不易感染病菌。

优选的，荫棚培养条件为遮荫度50～70%、湿度70～90%和温度20～25℃。荫棚采用支架上覆盖塑料薄膜和网膜，塑料薄膜和遮荫网合并具有保温、保湿和防护功能，防止雨水、强阳光或低温等对苗木生长早期造成伤害。

优选的，步骤5）中对播种盘及种子每天早晚以花洒喷淋1～2次清水，以保持盘湿润不积水为度，待种子出苗苗高1～2 cm，真叶2～3对时移入营养袋。

优选的，步骤5）和6）的培养过程中采用1wt‰的甲基托布津水溶液、1wt‰的的高锰酸钾溶液或1wt‰的多菌灵水溶液交替进行消毒。

所述经离子注入后的播种种子应该保留一半防出苗率低时进行补播或用于检验。

所述播种种子还包括未注入的、未除杂质或其它注入杂交种分别作为对照。

步骤6）中，待苗高1～2cm时将其移栽到营养袋中进行培养；营养袋育苗基质为泥炭土、珍珠岩、椰糠和黄心土按体积比（1～1.5）：（1～1.5）：2：2混合得到；将营养袋育苗基质装入袋中，基质低于袋面0.4～0.6 cm，每袋植1苗。

优选的，步骤6）所用的营养袋的大小为正面宽10cm、侧面宽8cm、高10cm的黑色或白色塑料袋，下方有小孔防止育苗时积水。这是桉树苗木最适的袋子规格，不能再小。

优选的，步骤6）移栽袋苗培养30～40天后撤除荫棚的膜及网，浇施1～1.5wt‰的尿素或1～1.5wt‰的复合肥水溶液，经90～120天以上生长期，在翌年3～4月份苗高达到18～22cm时进行造林。

优选的，尿素水溶液为1wt‰的尿素水溶液。

优选的，复合肥水溶液为1wt‰的复合肥水溶液。

所述的复合肥优选为含有1.5 wt% N、1.5 wt% P和1.5 wt% K的复合肥。

优选的，步骤6）移苗培育的营养袋苗每袋重0.15～0.20kg（装有本发明的营养袋育苗基质），容易运输或包装，节约成本。这是桉树容器育苗最合适的小袋子规格，该规格下，同一车装载量就更多。通过以最小的袋（装有本发明的营养袋育苗基质）达到同样的生长效果，且运输和包装相对容易；在相同产苗量的前提下，使运费减少，用土量减少；成本相同时则产苗量增多，达到节约成本的目的。

现有技术中，人们通常播种于苗床上，播种苗在苗床上因分布不均匀而易染猝倒病和灰霉，易受草和昆虫影响；此外，不用营养袋直接在苗床上播种（稀播）让其长高到20cm，待造林季节挖起苗直接上山造林，这样做会让苗的根系受到很大影响。

本发明采用塑料盘播种和营养袋育苗的优点在于：品系或株间互不影响；便于病虫害管理；容器袋的根系完好且有土保湿，便于移动，从而使得移苗成活率提高11%和保存率提高7.5%。

优选的，移入袋后，晴天每天需要喷水2～3次，分别为上午9点、下午6点，另1次可根据情况定在中午1点左右，以保持幼苗叶片湿润不萎蔫为度；太阳光照强、温度高于30℃时，需在薄膜上加遮阳网，10～17点每隔1小时膜外喷水1次，阴天可于下午5点喷1次或根据苗情不喷，雨天不喷。

优选的，移栽45～55天后，消毒液浓度可增至3wt‰～6wt‰，施肥液浓度可增至3wt‰～5wt‰，此时晴天或阴天可揭开薄膜炼苗，雨天可打开薄膜两端通气。

所述移袋操作的时间，广州优选在每年的10月下旬至11月中旬，雷州半岛及海南由于阳光充足，育苗时间长，优选在每年3月中旬至11月中旬；移栽1周后幼苗开始生根，此时幼苗已进入稳定期，2周后大量生根或苗木发根齐全，此时认为移栽成活，之后根系伸长，侧根增多，逐渐形成成熟完整的根系；移栽3～4个月后苗高达15～22cm时，可出圃造林。

优选的，步骤7）中：苗木移入营养袋培养2～6个月，测定苗木损伤度，苗木损伤度采用公式：损伤度（%）=（对照值-处理值）/对照值×100；确定各器官的损伤范围，将正向和负向变异苗木分开保存，正向突变苗和对照苗用于上山造林。

所述的损伤度是指注入苗苗期变化，损伤度为负表示正向变异，损伤度为正表示负向变异。采用本发明的离子注入条件后，与对比例的7种注入剂量的平均结果相比较，结果如下：叶长由-61.09～14.61%变为-101.43～-65.57%，叶宽损伤度由-74.26～14.17%变为-133.42～-81.38%；地径损伤度由-119.30～23.60%变为-267.11～-127.74%；树高损伤度从-121.70～10.72%变为-257.16～-145.36%；根长损伤度由-23.38～18.25%变为-57.63～-34.17%；侧根数损伤度由-48.67～14.28%变为-87.36～-54.15%，正向变异明显增强，苗期正向突变株率由2.56%提高到28.30%。

优选的，步骤7）中：利用正向突变株和对照株生长指标，采用突变临界值标准即对照平均值加上两倍标准差，在中大径材培育林半个轮伐期5年生时对林分内的突变株定位、正向突变率和年均材积生长量进行计算，收集优良材料为今后之用。

其中造林用苗选择正向变异苗和未注入的对照苗相比较，正向变异苗可提高造林成活率10%～15%和5年生时林木保存率提高6%～12%。利用选择标准：对照平均值加上2倍标准差，在林木5年生时不同家系内选择出正向突变株由1.47%增加到15.66%。

本发明以半个轮伐期就是5年作为生长期突变株选择标准。

以往的研究通常是将3年生时作为生长期突变株选择标准，但是显然已经不符合现在国家或广东省发展桉树要求培养大径材和维护生态的目标。本发明以半个轮伐期也就是5年作为生长期突变株选择标准，此时桉树生长基本稳定，其性状可充分用来进行结果的分析。

通过造林后5年生对林分的调查发现：经注入后尾细桉人工杂交种家系5年生平均表现，达到32.77 m³/hm².a，接近当前雷州半岛表现最好的尾细桉无性系37.64 m³/hm².a水平，而保存率则比尾细桉对照提高8.65%，通过注入家系内优株的无性系化，其生长水平完全可以超过当前最好的尾细桉无性系；尾细桉人工杂交种的正向突变株率按对照平均值加上2倍标准差的选择标准，在5年生时最高可达28.3%，这些突变稳定的优株是今后繁育无性系和持续育种的材料。

本发明的有益效果是：

（1）本发明以优选尾细桉人工杂交种子为材料，基于离子注入提高种子萌发率和变异频率，提高正向突变的入选率和保存率，满足台风多发区域对抗风无性系的需求，实现快速获得既抗风又速生的尾细桉无性系。相对尾细桉人工杂交种而言，作为亲本尾叶桉和细叶桉，其注入后平均萌发率分别为47.62%和50.58%，均低于本发明尾细桉杂交种的74.04%；

（2）改进种子承载盘的厚度和大小，由每块25 cm²增加到36 cm²，增加注入面积44%，满足研究对种子大量处理的要求和降低负向变异带来的实验风险，同时节约注入时间和提高效率；

（3）与早期研究比较，本发明方法将磁场强度由1.5×10^-2 T 增至3.0×10^-2 T，电流强度由1 A增至2A，注入能量由30 KeV增加至50～80 KeV，注入剂量改变为早期注入时家系最高突变率和最低突变率剂量的中间水平，即1×10¹⁵e/cm²～5×10¹⁵ e/cm²，最优为3×10¹⁵ e/cm²，能保证在达到同样注入效果的前提下，促进正向变异频率、提高种子萌发率和降低苗木损伤度；

（4）播种塑料盆和营养袋易于搬运，部分苗病害后易于处理隔离、不易传染、播种后快速统计出苗情况，容易补播；移苗培育的营养袋苗每袋重0.15～0.20kg，容易运输或包装，节约成本；优选轻型沙土和营养袋育苗方式进行快速育苗培植，实现了提高苗质和保证苗量的快速化育苗，可提高苗木保存率15%；

（5）本发明的注入苗变异谱宽，易选择到目的品种，一定程度丰富了育种材料的遗传资源，能快速达到或超过当前同林龄最好尾细桉无性系37.64 m³/hm².a的生长水平；

（6）本发明采用对照平均值加上2倍标准差作为突变优株的选择标准，易于操作，便于测定和重复检验，有利于今后分子标记等方法精确变异定位时的选择效率和缩小检测范围；另外以上选择标准是在负向变异的差苗或受损严重苗死亡后，相对提高了在对照中无损伤所有成活苗采用相同方法的选择标准；

（7）本发明提高了尾细桉人工杂交种的正向变异频率，苗期正向变异株率可达到28.3%且损伤轻，变异性状稳定，当代可以利用，大大缩短育种周期。

附图说明

图1是实施例2的种子承载盘及纯净种子；

图2是实施例3用的播种塑料盘（A）及种子萌发4周后的图（B）；

图3是实施例3的支架下营养袋及移栽苗图；

图4是实施例3的移栽1周后的营养苗生长图；

图5是实施例3的注入育种苗表型变异明显对比图；

图6是实施例3的出圃造林（A）或留圃苗期测定的诱变育种注入苗（B）；

图7是实施例3的5年生突变优树；

图8是离子注入机。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例 1 母本和父本种子的选择

（1）选取母本和父本花粉，确定种源

母本尾叶桉确定为来自印度尼西亚Mt. Egon的14534优良种源，父本细叶桉花粉来自于澳大利亚昆士兰州North of Laura的13659优良种源；这两个种源经早期测定确认为各自树种中的优良种源。

（2）种子的收集和准备，以及对照的处理

每年9月～12月，是尾叶桉开花季节，将事先收集的细叶桉优树花粉授于套袋的去除雄蕊的尾叶桉花蕾柱头上，获得尾细桉杂交种子，于翌年3～4月收集蒴果和人工杂交种子，按种源/家系分别收集。收集的种子必须成熟、饱满，并过筛去除所有未成为种子的蒴果内丝状杂质，仅将种子小粒集中收集供下一步使用。为防止由于种子放置时间太长而影响播种出苗率，种子收集后在低温冰箱内保存；

所述的尾细桉种子可以包含有杂质，也可为经过筛选的纯净种子，纯净种子无杂质影响，可提高保存质量、种子萌发率和降低病源菌感染的可能性。种子来源于优树人工授粉后的蒴果，成熟期（国内一般为4～5月）的果经采集并自然干燥后收集种子；一般含杂质的1 kg桉树种子可育苗20万株左右，成熟种子为深褐色，纯净种子千粒重2～3 g；所述的筛子其孔径为50目；

所述的种子保存的低温干燥环境一般优选在具除湿功能冰箱中，温度设置为4 ℃，5～7年种子仍有较高活力，但播种或注入前需要进行发芽率试验，以免育苗量不能满足造林试验；

所述的离子注入处理每承载盘种子量一般不少于500～1000粒，能够满足苗期测定、留圃苗测定和至少三个地点的试验林营建苗量，亦能满足1～2次不同年份的试验重复和种子复检；所述承载盘，同一盘上所有种子注入剂量相同；

对照包括母株自由授粉种子、父本自由授粉种子，以及其它杂交种，确定种源及组合类型。

（3）种子处理

对收集种子进行过筛50目并去除所有杂质，获得纯净种子，千粒重2～3 g。

（4）种子贮藏

将收集种子按号包装成袋，密封，4℃冰箱长期保存或尽快注入或播种。

实施例 2 种子承载盘的制作和种子放置处理

（1）铝承载盘制作

选择铝板，厚度2.25 mm，盘大小剪切为6.5×6.5 cm²；铝盘表面或四周光滑平整，其中盘中央增加到6×6 cm²的种子摊放处理空间，也就是实际注入区域面积为6×6 cm²，可以增加一次性种子注入量且注入板受照射度更均匀，由此节约了注入总时间。

（2）承载盘处理

在注入区域内粘上双面胶，以粘附或隔离不同品系种子；注入时备多个承载盘，分别承放不同品系种子，相同浓度注入时1次可同时注入多个品系；见图1。

（3）种子放置

将承载盘注入区域内纯净种子按500～1000粒平铺其上，在注入处理前有运输过程需要按品系装袋，不得混杂。

实施例 3 一种基于 N ⁺ 离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法

采用尾细桉杂交种进行实验，早期注入：郑州9月；播种育苗：广州，10月～翌年4月进行：

（1）注入方式

2.25 mm厚、6×6 cm²承载盘载尾细桉人工杂交等注入种子置于真空的N离子注入机内，离子注入条件为: 国产高能离子注放机，磁场强度为3.0×10^-2 T，电流强度为2A，注入束流量程为2.5(μA)，50～80 KeV，3×10¹⁵ e/cm²剂量，注入靶室的真空度抽至10^-3Pa，以N⁺离子注入，此时注入时间需要1～2 h；

如果采用1×10¹⁵ e/cm²剂量，则注入时间短，处理效果不佳；如果采用1×10¹⁶ e/cm²剂量，则注入时间长达3小时以上。

（2）注入后种子收集

相同浓度下按不同家系号分别注入、收集，干燥保存。

（3）播种前准备

播种塑料盘选择大小为18 cm×13 cm×6cm，盘下有8个直径0.5～1cm的排水孔，亦采用塑料碗下边开排水孔播种，碗直径大小为15 cm。

（4）育苗基质装盘与消毒

在苗圃准备足够空间放置装有过20目筛黄心土的播种塑料盘，将育苗基质装满塑料盘后置于高20cm平台上，便于喷施或多余水流走，在播种前1天用1 wt‰的高锰酸钾水溶液浇透消毒，盖上薄膜备用；支撑薄膜及遮荫网的支架高100cm，支架宽度80～100cm，塑料薄膜具有保温保湿功能，遮荫网是在苗木生长稳定后移除塑料薄膜后起部分遮荫功能，防止强阳光造成苗木失水。

（5）播种

每播种盘播种1个品系，种子播种数量300粒，出苗整齐时可以满足3个不同地点的试验林营建以及留圃苗的苗期测定。通过控制在遮荫度60～70%、湿度75～90%、温度20～25 ℃的条件下，将种子均匀撒入盘中，1周后种子开始萌发，30～40天出苗整齐，期间需要喷洒防灰霉病的1 wt‰多菌灵水溶液；播种用塑料盘(图2A)及种子萌发4周后的图(图2B)见图2；

结果显示：播种后种子平均萌发率为74.04%，苗器官损伤度叶长在-101.43～-65.57%范围，叶宽损伤度在-133.42～-81.38%范围，地径损伤度在-267.11～-127.74%范围，树高损伤度在-257.16～-145.36%范围，根长损伤度在-57.63～-34.17%范围，侧根数损伤度在-87.36～-54.15%范围，正向变异明显增强，苗期正向突变株率达到28.30%。

（6）营养袋的选择

所述营养袋的大小为正面宽10cm、侧面宽8cm、高10cm的白色塑料袋，下方有小孔防止育苗时积水。

（7）育苗基质的准备

将泥炭土、珍珠岩、椰糠和黄心土按体积比1：1：2：2混合均匀，得到育苗基质。

（8）移栽

移栽在阴天，在遮荫度50～70%、湿度75～90%、温度20～25 ℃的条件下，将步骤（5）中播种塑料盘里1～2cm高幼苗起离盘，再用竹签在每营养袋基质中央插1小孔，孔深0.5～1.0cm，将幼苗轻轻植入孔中，再用竹签在幼苗一侧压实，移栽完后喷清水定根，然后用1 wt‰的高锰酸钾溶液喷雾消毒，最后盖上薄膜保湿，得到保湿的幼苗；其中支架下营养袋及移栽苗图见图3；移栽1周后的营养苗生长图见图4。

（9）苗期管理

于移栽后第3天对步骤（8）中保湿的幼苗进行第二次消毒，之后每周消毒1次；消毒采用1 wt‰的甲基托布津水溶液、1 wt‰的高锰酸钾溶液或1 wt‰的多菌灵水溶液交替消毒；晴天每天喷水2～3次，分别为上午9点，下午6点，广州晴天中午温高注意喷水，以保持幼苗叶片湿润不萎蔫为准，太阳光照强，温度高于30 ℃时，需要在薄膜上加盖遮荫网，10点～17点每隔2小时膜外喷水1次，保持遮荫度50～70%、湿度75～90%、温度20～25 ℃的条件；阴天可于下午5点喷1次或根据苗情不喷，雨天不喷；移栽20天后浇施1.5 wt‰的尿素，移栽45～55天后，消毒浓度可增加到6 wt‰，追肥浓度可增加到4 wt‰，此时晴天或阴天可揭开薄膜练苗，雨天也可以打开薄膜两端通气。

（10）移栽后生长情况

移栽1周即开始生根，此时幼苗已进入稳定期，2周后大量生根或苗木发根齐全，此时认为移栽成活，之后根系伸长，侧根增多，逐渐形成成熟完整的根系，成活率达到95.0%；观察和登记变异显著之苗木，做好标记并采样保存，注入后育种苗表型变异明显好、中、差对比图见图5；移栽4个月苗高达15～20 cm时，出圃造林或留圃待测，见图6，其中图6-A为出圃造林，图6-B为留圃苗期测定的诱变育种注入苗。

（11）造林后生长数据

选择营养袋苗造林，造林成活率为95.65%，5年生时林木保存率82.34%，利用选择标准：对照平均值加上2倍标准差，可以在林木5年生时不同家系内选择出正向突变株率为15.66%。5年生突变优树效果图见图7。

对比例 1

采集亲本的尾叶桉和细叶桉种子（非杂交），利用实施例3的方法进行N⁺离子注入，然后继续利用实施例3的方法进行培养。

结果如下：尾叶桉和细叶桉注入后平均萌发率分别为47.62%和50.58%，均低于尾细桉杂交种的74.04%。

对比例 2

利用尾巨桉种子进行基于 N ⁺ 离子注入的快速育种方法

早期的注入：北京9月；播种育苗：广州，10月～翌年4月进行：

（1）选择注入条件

1.75 mm厚、5×5 cm²承载盘载注入种子置于真空、具MEVVA源的离子注入机（见图8）内，选择N⁺源，离子注入条件为: 俄罗斯科学院西伯利亚分院强电研究所制造的Titan脉冲式全元素离子源，采用磁场强度为为1.5×10^-2 T，电流强度为1A，加速电压30KeV，注入束流量程为2.0(μA)，脉冲频率25 Hz、脉冲宽度为400μs，气体离子即N⁺的单独注入，脉冲式注入，注入剂量为7种，分别为1×10¹⁴，1×10¹⁵，1×10¹⁶，5×10¹⁶，1×10¹⁷，2×10¹⁷，3×10¹⁷ N⁺/cm²。

（2）注入后种子收集

相同浓度下按不同家系号分别注入、收集，干燥保存。

（3）播种前准备

播种塑料盘选择大小为18 cm×13 cm×6cm，盘下有8个直径0.5～1cm的排水孔。

（4）育苗基质装盘与消毒

在苗圃准备足够空间放置装有过15目筛黄心土的播种塑料盘，将育苗基质装满塑料盘后置于高20cm平台上，便于喷施或多余水流走，在播种前1天用1wt‰的高锰酸钾水溶液浇透消毒，盖上薄膜备用；支撑薄膜及遮荫网的支架高100cm，支架宽度80～100cm，塑料薄膜具有保温保湿功能，遮荫网是在苗木生长稳定后移除塑料薄膜后起部分遮荫功能，防止强阳光造成苗木失水。

（5）播种

每播种盘播种1个品系，种子播种数量250粒，出苗整齐时可以满足3个不同地点的试验林营建以及留圃苗的苗期测定。通过控制在遮荫度50～70%、湿度75～90%、温度20～25℃的条件下，将种子均匀撒入盘中，1周后种子开始萌发，30～40天出苗整齐，期间需要喷洒防灰霉病的1 wt‰多菌灵水溶液。

（6）营养袋的选择

（7）育苗基质的准备

将泥炭土、珍珠岩、椰糠和黄心土按体积比1︰1︰2︰2混合均匀，得到育苗基质。

（8）移栽

移栽在阴天，在遮荫度50～70%、湿度75～90%、温度20～25 ℃的条件下，将步骤（5）中播种塑料盘里1～2cm高幼苗起离盘，再用竹签在每营养袋基质中央插1小孔，孔深0.5～1.0 cm，将幼苗轻轻植入孔中，再用竹签在幼苗一侧压实，移栽完后喷清水定根，然后用1 wt‰的高锰酸钾溶液喷雾消毒，最后盖上薄膜保湿，得到保湿的幼苗。

（9）苗期管理

于移栽后第3天对步骤（8）中保湿的幼苗进行第二次消毒，之后每周消毒1次；消毒为采用1 wt‰甲基托布津水溶液、1 wt‰的高锰酸钾溶液或1 wt‰多菌灵水溶液交替消毒；晴天每天喷水2～3次，分别为上午9点，下午6点，广州晴天中午1～2点时注意喷水，以保持幼苗叶片湿润不萎蔫为准，太阳光照强，温度高于30 ℃时，需要在薄膜上加盖遮荫网，10点～17点每隔2小时膜外喷水1次，保持遮荫度50～70%、湿度75～90%、温度20～25 ℃的条件；阴天可于下午5点喷1次或根据苗情不喷，雨天不喷；移栽20天后浇施1.5 wt‰的尿素，移栽45～55天后，消毒浓度可增加到5 wt‰，追肥浓度可增加到3 wt‰，此时晴天或阴天可揭开薄膜练苗，雨天也可以打开薄膜两端通气。

（10）移栽后生长情况

移栽1周即开始生根，此时幼苗已进入稳定期，2周后大量生根或苗木发根齐全，此时认为移栽成活，之后根系伸长，侧根增多，逐渐形成成熟完整的根系，成活率达到75.5%；观察和登记变异显著之苗木，做好标记并采样保存；移栽4个月苗高达15～20 cm时，出圃造林或留圃待测。

（11）造林后生长数据

选择营养袋苗造林，造林成活率为90.42%，5年生时林木保存率67.66%，利用选择标准：对照平均值加上2倍标准差，可以在林木5年生时不同家系内选择出正向突变株率为1.47%。

鉴于7种剂量加上3个地点且每个点均有数十个杂种类型，工作量浩大，为便于统计且7种剂量注入家系基本为尾巨桉，因此这里只将不同号按注入和未注入进行分类，没有再按剂量来统计。所以最终的结果诸如造林成活率、保存率及突变选择株均为上述7种注入剂量的一个混合值。结果显示：播种后尾巨桉平均萌发率33%，苗器官损伤度叶长在-61.09～14.61%范围，叶宽损伤度在-74.26～14.17%范围，地径损伤度在-119.30～23.60%范围，树高损伤度在-121.70～10.72%范围，根长损伤度在-23.38～18.25%范围；侧根数损伤度在-48.67～14.28%范围，苗期正向平均突变株率为2.56%。从上面的平均值来看，7种剂量下获得的注入结果远远低于实施例的结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于N⁺离子注入尾细桉人工杂交种的快速育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）亲本选择：以尾叶桉为母本，细叶桉为父本；

2）种子的收集和准备：用细叶桉花粉对尾叶桉进行人工授粉，收集得到人工杂交种子；

3）种子承载盘的制作：种子承载盘为铝盘，厚度为2.1～3.0 mm，盘大小为(6.5～7)×(6.5～7) cm²，实际注入区域面积为(5.5～6)×(5.5～6)cm²；在注入区域内粘上胶条，以粘附不同品系种子；

4)种子离子注入处理：在磁场强度为1.0×10^-2～4.0×10^-2 T，电流强度为1～3A，50 kev～80 kev，1×10¹⁵ e/cm²～5×10¹⁵e/cm²剂量的条件下，抽注入室真空度至10^-5～10^-3Pa，注入N⁺离子，收集并保存注入后种子，用于播种；

5)播种育苗：将种子播种于育苗塑料盘，于荫棚中培养；盘中播种基质为黄心土，种子均匀播于盘中；

6)营养袋育苗：待苗高1～2cm时将其移栽到营养袋中进行培养；营养袋育苗基质为泥炭土、珍珠岩、椰糠和黄心土按体积比（1～1.5）：（1～1.5）：2：2混合得到；将营养袋育苗基质装入袋中，每袋植1苗；

7)造林，苗期及林分突变优株的选择方法：苗高15～22 cm时将其用于出圃造林或继续留圃观察、取样和测定；对移入营养袋2个月以上的苗木，进行苗木器官损伤率的测定，同时对突变株进行正、负向选择，将正向突变株及对照苗上山造林，将半个轮伐期5年作为生长期突变株选择标准，确定育种结果的稳定性，获得优良家系或单株，将优良家系保存作为多世代育种材料，而单株材料则通过扦插、嫁接或组培形成新无性系，为无性系扩繁做准备。

2.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤1）中，母本尾叶桉为印度尼西亚Mt. Egon的14534种源，父本细叶桉为澳大利亚昆士兰州North of Laura的13659种源。

3.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤4）注入后种子滞留腔体冷却10分钟后移出，将种子保存待用。

4.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤5）中播种前1天喷淋0.8～1.2wt‰的高锰酸钾溶液对育苗塑料盘和播种基质进行消毒，按每盘均匀撒播250～300粒同一品系种子；播种后继续喷淋0.8～1.2wt‰的高锰酸钾溶液于育苗塑料盘进行消毒，以苗盘土完全湿润为度。

5.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤5）育苗塑料盘下有小孔，防止水积滞盘中；荫棚培养条件为遮荫度50～70%、湿度70～90%和温度20～25℃。

6.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤5）中对播种盘及种子适时喷水，以保持盘湿润不积水为度，待种子出苗苗高1～2 cm，真叶2～3对时移入营养袋。

7.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤5）和6）的培养过程中采用0.8～1.2wt‰的甲基托布津水溶液、0.8～1.2wt‰的的高锰酸钾溶液或0.8～1.2wt‰的多菌灵水溶液交替进行消毒。

8.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤6）移栽袋苗培养30～40天后撤除荫棚的膜及网，浇施1～1.5 wt‰尿素或1～1.5 wt‰的复合肥水溶液，苗高达到18～22cm时进行造林。

9.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤7）中：苗木移入营养袋培养2～6个月，测定苗木损伤度，确定各器官的损伤范围，将正向和负向变异苗木分开保存，正向突变苗和对照苗用于上山造林。

10.根据权利要求1所述的快速育种方法，其特征在于：步骤7）中：利用正向突变株和对照株生长指标，采用对照平均值加上两倍标准差作为突变临界值标准，在中大径材培育林半个轮伐期5年生时对林分内的突变株定位、正向突变率和年均材积生长量进行计算，收集优良材料为今后之用。