CN105891412A - 一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，特点是在PVC底板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，该结合垫上包被有所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体一胶体金标记物，该硝酸纤维素膜上分别包被有弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液构成的检测线和兔抗鸡卵黄抗体构成的质控线，优点是灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速、准确性高。

Description

一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫化学检测技术，尤其是涉及一种基于卵黄抗体的胶体金免疫层析技术用以快速检测环境、食品、人和动物各种组织，血液及粪便样品中弗氏柠檬酸杆菌的检测试纸条及其制备方法。

背景技术

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)是一种革兰氏阴性短杆菌，为需氧或兼性厌氧菌，是沙门氏菌族中柠檬酸杆菌属的代表菌。柠檬酸杆菌属包括3个种及1个生物群——弗氏柠檬酸杆菌，无丙二酸盐柠檬酸杆菌，差异柠檬酸杆菌和无丙二酸盐柠檬酸杆菌生物群1，分为11个基因种。弗氏柠檬酸杆菌为该属中的模式菌种，是一种条件致病菌，广泛分布于自然界中，为人和动物肠道的正常菌群，和大肠菌群一样，可视作粪便污染的卫生学指标。在一定的条件下，弗氏柠檬酸杆菌是一种“人-兽-鱼”共患病病原菌，当机体抵抗力下降时，可引起腹泻、尿路感染、创面感染、关节炎和败血症等。弗氏柠檬酸杆菌也可存在于食物中导致食物中毒。目前，国内也陆续报道了一些由弗氏柠檬酸杆菌引起的畜类及养殖鱼类的疾病，孙洋等报道了该菌可导致东北虎出血性腹泻病；在水产动物方面，李华等报道了该菌可导致河蟹的肝胰腺、鳃、肌肉轻度水肿，最终引起败血症而死亡；陈翠珍等从中华绒螯蟹分离到该菌，证明了该菌对中华绒螯蟹的致病性；沈锦玉等从红螯螯虾中分离到该菌，病虾的尾部呈肉质样肿胀、烂尾等症状；胡广洲等从患暴发性败血症中华鳖体内分离到该菌；梁利国等报道了该菌可导致三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉组织水肿，并有大量浑浊的积液，严重者肌肉糜烂并伴有腐臭的气味，最终死亡；陆爱君等从草鱼肠道分离到该菌，并证明其对小鼠和斑马鱼均具有致病性。高正勇等从大鲵中分离到弗氏柠檬酸杆菌，患病大鲵头部肿大，腹部肿大轻度腹水，皮下有出血点等症状，人工感染试验证明其对大鲵和鲫鱼都有致病性。每年由于弗氏柠檬酸杆菌引起的水产类疾病给养殖业带来了巨大损失，因此，若能确定病因，及时对症下药，势必能给养殖产业减少损失。同时，弗氏柠檬酸杆菌的快速检测在医学方面也具有重要意义，能为预防和临床治疗急性腹泻提供参考依据。

目前，病原体的检测方法主要有分离培养、电镜观察、PCR、ELISA、色谱分析等，这些方法多耗时耗力，需要专用场地和仪器设备，需要专业人员操作。对于弗氏柠檬酸杆菌感染，根据微生物检测标准需先对其进行增菌实验，挑选特定菌株用全自动微生物分析仪分析鉴定，整个过程操作繁琐，而且需要专业人员在无菌条件下进行，结果也需数天才能获得，不利于对病源的确定及病情的及时控制。

胶体金免疫层析试验(gold-immunochromatography assay GICA)是20世纪80年代开始发展起来的新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，基于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低等优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测各种病原和有毒有害物质的试纸条。但是，目前国内外还没有公开任何关于弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条及其制备方法的相关研究报道。

鸡卵黄抗体即卵黄中的免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk，IgY)，是针对特定抗原的，具有持续效价的高亲和力抗体。用鸡做宿主来产生抗特定抗原的IgY，饲养简单，无需采血，只需使用少量抗原即可产生大量抗体，从卵黄中提取的IgY纯度高、含量大。在疾病的检测、诊断方面，IgY因免疫学特性独特，动物种系发生学距离远，其特异性和针对性较哺乳动物抗体更强，应用于免疫诊断中，可减少假阳性的出现，从而提高检测的特异性，是近年来新兴的研究领域。但是，目前国内外还没有公开任何关于弗氏柠檬酸杆菌IgY的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于胶体金免疫层析技术的特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低并且操作简便的弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条及其制备方法，满足了现场快速检测的需求。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条，所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体(IgY)包被的质控线。

所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-40nm的胶体金溶液按5-7μg：1mL混合，在pH5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h去除未结合的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物。

一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品垫的制备

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐温-20的0.01M pH 7.2的PBS缓冲液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；

(2)特定包被的结合垫的制备

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐温-20的0.01M pH 7.2的PBS缓冲液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；

(3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备

将弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成检测线，将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤维膜，真空冷冻干燥1-1.5h，真空封装，4℃保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；

(4)试纸条的制备

将步骤(1)得到的样品垫、步骤(2)得到的特定包被的结合垫、步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条，真空封装，4℃保存。

所述的弗氏柠檬酸杆菌抗原的制备方法如下：取实验室-80℃保存的弗氏柠檬酸杆菌菌种，在琼脂培养基中划线活化，30℃倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用牛肉膏蛋白胨液体培养基按1∶100稀释到三角烧瓶中，30℃，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其OD600值，当其OD600值达到0.4-0.6时停止培养。将培养的菌液在4℃进行5000rpm离心10min，弃上清，下层沉淀用pH 7.2的0.01M PBS重悬洗涤，再次5000rpm离心10min，沉淀用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的沉淀即为弗氏柠檬酸杆菌抗原。

所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：

(1)抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的制备

将上述弗氏柠檬酸杆菌抗原与无菌生理盐水混合得到弗氏柠檬酸杆菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5％，然后37℃恒温水浴灭活24h，即得到灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原；取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原用生理盐水稀释后和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为4×10⁹CFU，15-20天后，将灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为2×10⁹CFU，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，然后收集鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价＞1∶20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体；

(2)胶体金标记抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体

将抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-40nm的胶体金溶液5-7μg：1mL混合，在pH 5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h去除未结合的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，0.02wt％叠氮化钠的pH 7.2的0.01M PBS重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。

用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体的具体方法如下：称取适量步骤(1)分离得到的卵黄，按质量比1∶9加入pH 5.0的0.05M的乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4℃静置过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40％，4℃搅拌6h，10000g离心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40％，4℃搅拌过夜，10000g离心20min，沉淀用少量pH 7.2的0.01M的PBS缓冲液重悬后，在PBS缓冲液中透析即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体。

步骤(2)中胶体金制备方法如下：将100mL 0.01wt％的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅拌边加入1-2mL 1wt％柠檬酸三钠迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至100mL，无菌密封，4℃避光保存。

所述的检测线距离所述的结合垫6-8mm；所述的质控线距离所述的吸水垫6-8mm，所述的检测线和所述的质控线的宽度分别为0.8-1mm，两条线相距为5mm。

所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方如下：牛肉膏3-5g、蛋白胨15g、NaCl 5g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；

所述的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方如下：牛肉膏3-5g、蛋白胨15g、NaCl 5g、琼脂20g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；

所述的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.2g，500μL吐温-20，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；

所述的PBS缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.2，高压灭菌；

所述的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2.604g、冰乙酸1.095g，补足双蒸水至1L，调pH至5.0，高压灭菌。

所述的弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液的包被量为1-2μL/cm；所述的兔抗鸡卵黄抗体的包被量为1-2μL/cm，所述的弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液是将所述的弗氏柠檬酸杆菌抗原用PBS重悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液。

本发明选用弗氏柠檬酸杆菌超声波菌液作为检测线，抗弗氏柠檬酸杆菌特异性卵黄抗体作为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有弗氏柠檬酸杆菌。通过待检样品中的弗氏柠檬酸杆菌与包被于硝酸纤维膜上的弗氏柠檬酸杆菌抗原共同竞争结合抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物。若待检样品中弗氏柠檬酸杆菌的量高于试纸条的检测限，抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物与样品中弗氏柠檬酸杆菌全部结合，从而不与固定在硝酸纤维膜上的菌液结合而不出现红色条带而显阳性；若待检样品中不含弗氏柠檬酸杆菌或其量低于试纸条的检测限，抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物不能与样品中弗氏柠檬酸杆菌全部结合，这样金标抗体在层析过程中会被固定在硝酸纤维素膜上的菌液结合而出现红色条带而显阴性。因此，若待测样品试纸条的检测线和质控线同时出现红色条带，则判断为阴性样品；若待测样品试纸条检测线不出现红色条带，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品；若质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。

与现有技术相比，本发明的优点在于

1、检测快速：整个检测过程只需5-10分钟，能够满足现场检测的需要。

2、检测准确率高、特异性强：本反应与其他细菌没有交叉反应，检测准确性能达到95％以上，与操作复杂的ELISA水平基本相同。

3、携带方便，操作简便：本发明改变了对弗氏柠檬酸杆菌的检测必须由专业人员才能进行检测的局限性，使各个养殖场及医院均可即时、即地进行检测。

4、本发明的检测试纸条制备工艺简单，成本低廉，不需要任何特殊仪器、设备。

5、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在4℃可有效保存半年以上。

附图说明

图1为本发明试纸条的结构示意图，图中1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸收垫，5为检测线，6为质控线，7为PVC底板；

图2为本发明试纸条的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例1

一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条，如图1所示，该试纸条由PVC底板7和在PVC底板7上依次搭接的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3及吸水垫4；结合垫2上包被有抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜3上分别设置有由弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液包被的检测线5和由兔抗鸡卵黄抗体(IgY)包被的质控线6。

上述抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-40nm的胶体金溶液按5-7μg：1mL混合，在pH 5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h去除未结合的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物。

具体实施例2

快速检测弗氏柠檬酸杆菌胶体金试纸条的制备方法，如图2所示，其具体操作步骤如下：

(1)弗氏柠檬酸杆菌的制备

所述的弗氏柠檬酸杆菌抗原的制备方法如下：取实验室-80℃保存的弗氏柠檬酸杆菌菌种，在琼脂培养基中划线活化，30℃倒置培养24h后挑取单菌落接种子含5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用牛肉膏蛋白胨液体培养基按1∶100稀释到三角烧瓶中，30℃，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其OD600值，当其OD600值达到0.4-0.6时停止培养。将培养的菌液在4℃进行5000rpm离心10min，弃上清，下层沉淀用pH 7.2的0.01M PBS重悬洗涤，再次5000rpm离心10min，沉淀再次用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的沉淀即为弗氏柠檬酸杆菌抗原。

(2)抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的制备

将上述弗氏柠檬酸杆菌抗原与无菌生理盐水混合得到弗氏柠檬酸杆菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5％，然后37℃恒温水浴灭活24h，即得到灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原；取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原用生理盐水稀释后和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为4×10⁹CFU，15-20天后，将灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为2×10⁹CFU，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，进行三次免疫后收集鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价＞1∶20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体。卵黄抗体的纯化的具体方法如下：称取适量卵黄，按质量比1∶9加入pH 5.0的0.05M乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4℃静置过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40％，4℃搅拌6h，10000g离心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40％，4℃搅拌过夜，10000g离心20min，取沉淀用少量pH 7.2的0.01M PBS溶液重悬，在PBS溶液中透析即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体；

(3)胶体金标记抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的方法

用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金。用新制的去离子水配制100mL 0.01wt％的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅拌边加入1-2mL 1wt％柠檬酸三钠溶液后迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至100mL，无菌密封，4℃避光保存；

将抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-40nm的胶体金溶液按5-7μg：1mL混合，在pH 5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt％的牛血清蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h去除未结合的卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，0.02wt％叠氮化钠的pH 7.2的0.01M PBS重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。

(4)结合垫的包被

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐温-20的pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中30min后，37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；

(5)样品垫的处理

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐温-20的pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中30min后取出，37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；

(6)硝酸纤维膜的包被

将弗氏柠檬酸杆菌抗原用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成检测线，包被量为1-2μL/cm；将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成质控线，包被量为1-2μL/cm，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，真空冷冻干燥1-1.5h，真空封装，4℃保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；所述的弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液是将所述的弗氏柠檬酸杆菌抗原用PBS重悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液。

(7)试纸条组装

将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维膜(3)、吸水垫(4)按图2所示的顺序依次粘附在PVC底板(7)上，PVC底板作为支撑载体，由下及上是由玻璃纤维纸组成的样品吸收区，然后是吸附了胶体金所标记的卵黄抗体的玻璃纤维层，其次是硝酸纤维素膜，最上一层是吸水层，由滤纸组成，外面用胶带封住，成为手持部分。各层之间均有1.5mm左右的重叠交叉。将试纸条切成4-6mm宽的小条，真空封装，4℃保存。

其中步骤(1)中采用的所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方如下：牛肉膏3-5g、蛋白胨15g、NaCl 5g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；所述的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方如下：牛肉膏3-5g、蛋白胨15g、NaCl 5g、琼脂20g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；

步骤(2)中的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2.604g、冰乙酸1.095g，补足双蒸水至1L，调pH至5.0，高压灭菌。

步骤(3)中采用的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、KH₂PO₄0.2g，500μL吐温-20，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌。

步骤(1)(2)(3)(4)、(5)中采用PBS缓冲液配制方法是：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.2g补足双蒸水至1L，调节pH至7.2，高压灭菌。

具体实施例3

胶体金试纸条对临床样品的检测，具体步骤如下：

从当地超市购买中华绒螯蟹、梭子蟹、虾、草鱼、鲫鱼等各种鱼类样品以及本地各池塘水样，解剖取其肠，鳃和肝等样品共41份，将PBS缓冲液滴加于组织样品上，破碎组织，2000-3000rpm离心5min后取上清液，将检测试纸条插入待检样品中，10分钟后观察结果：若只在检测试纸条的质控区出现一条红线者为阳性结果，即样品中带有弗氏柠檬酸杆菌；若试纸条的检测线和质控线同时出现红线者为阴性结果，即样品中不含有弗氏柠檬酸杆菌。每个样品做5次重复，所有临床样品检测结果用酶联免疫吸附法(ELISA)进行比较。

检测结果见表1，我们可以看到在收集的41份样品中，只有1份草鱼样品和1份鲫鱼样品在试纸条检测结果中呈阳性，对于其余各种鱼类样品均为阴性结果。所有样品ELISA检测结果均为阴性，检测样品只有2份样品检测结果与ELISA结果发生冲突，其余均与ELISA结果相同，说明两者具有高度一致性，试纸条比ELISA灵敏度更好，能检测出ELISA不能检测到的阳性样品。由此可见，这种研发的弗氏柠檬酸杆菌胶体金试纸条是可行的，我们可以通过胶体金试纸条对各养殖场中的发病鱼类进行检测确定病因，从而对症下药，及时防治，防止病情扩大，减少养殖户损失，也可以作为在苗种引进时的一种初步筛选工具，这种胶体金试纸条方便实用，非常适合现场检测。同时，由于弗氏柠檬酸杆菌是一种“人-畜-鱼”共患病病原菌，因此，这种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条也可以广泛应用于各大医院进行急诊。

表1弗氏柠檬酸杆菌试纸条检测临床样品结果

+：试纸条只出现质控线一条红线，为阳性结果；

-：试纸条出现两条红线，为阴性结果。

具体实施例4

胶体金试纸条的灵敏度检测，具体步骤如下：

按具体实施例2中步骤(1)的方法，将活化培养的菌液用牛肉膏蛋白胨液体培养基以10的倍数进行梯度稀释，将10^-6，10^-7，10^-8，10^-9稀释的菌液在LB固体培养基平板上进行涂布，每个稀释度涂三个平板，30℃倒置培养48h后进行菌落计数，确定弗氏柠檬酸杆菌菌液浓度。用PBS缓冲液将培养的弗氏柠檬酸杆菌稀释成10³CFU/mL，10⁴CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁸CFU/mL。吸取弗氏柠檬酸杆菌菌液(100μL)滴加于检测试纸条的样品垫上，静置10分钟后观察结果。以检测线消失的最低检测浓度为其最低检测极限。每种浓度做5次重复。

检测结果见表2，我们可以看出在弗氏柠檬酸杆菌浓度为10³CFU/mL，10⁴CFU/mL时试纸条上均出现两条线，检测结果为阴性，而当弗氏柠檬酸杆菌浓度为10⁵CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁸CFU/mL时，检测线消失，只有质控线出现一条红色条带，检测结果为阳性。因此，弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的检测极限为10⁵CFU/mL。

表2弗氏柠檬酸杆菌试纸条灵敏度检测结果

+：试纸条只出现质控线一条红线，为阳性结果；

-：试纸条出现两条红线，为阴性结果。

具体实施例5

弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的特异性检测，其具体步骤如下：

将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和弗氏柠檬酸杆菌分别稀释至10⁷CFU/mL，用制备的试纸条分别检测这6种细菌，每种细菌做5个重复，10分钟后观察结果。若试纸条只在质控线出现一条红色条带，则检测结果为阳性，若试纸条的检测区和质控区都分别出现一条红色条带，则检测结果为阴性。

检测结果见表3，我们可以看出用试纸条检测铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌时，在试纸条的检测线和质控线分别都出现了一条红色条带，即检测结果为阴性；而用试纸条检测弗氏柠檬酸杆菌时只在试纸条的质控区出现了一条红色条带，检测结果为阳性。由此可见，这种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条具有良好的特异性，它不与铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌发生交叉反应。

表3弗氏柠檬酸杆菌试纸条特异性检测结果

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体(IgY)包被的质控线。

2.根据权利要求1所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条，其特征在于所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-40nm的胶体金溶液按5-7μg：1mL混合后，在pH 5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物。

3.一种根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品垫的制备

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐温-20的pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；

(2)特定包被的结合垫的制备

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐温-20的pH7.2的0.01M PBS缓冲液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；

(3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备

将弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液用点膜仪将其包被子硝酸纤维素膜上形成检测线；将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，真空冷冻干燥1-1.5h，真空封装，4℃保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；

(4)试纸条的制备

将步骤(1)得到的样品垫、步骤(2)得到的特定包被的结合垫、步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条，真空封装，4℃保存。

4.根据权利要求3所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的弗氏柠檬酸杆菌抗原的制备方法如下：取实验室-80℃保存的弗氏柠檬酸杆菌菌种，在牛肉膏固体培养基中划线活化，30℃倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用牛肉膏液体培养基按1∶100稀释到三角烧瓶中，30℃，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其OD600值，当其OD600值达到0.4-0.6时停止培养。将培养的菌液在4℃进行5000rpm离心10min，弃上清，下层沉淀用pH 7.2的0.01M PBS重悬洗涤，再次5000rpm离心10min，沉淀再次用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的沉淀即为弗氏柠檬酸杆菌抗原。

5.根据权利要求4所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：

(1)抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的制备

将上述弗氏柠檬酸杆菌抗原与无菌生理盐水混合得到弗氏柠檬酸杆菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5％，然后37℃恒温水浴灭活24h，即得到灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原；取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原用生理盐水稀释后和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为4×10⁹CFU，15-20天后，将灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为2×10⁹CFU，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，然后收集鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价＞1∶20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体；

(2)胶体金标记抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体

将抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-40nm的胶体金溶液按5-7μg：1mL混合，在pH 5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，0.02wt％叠氮化钠的pH 7.2的0.01M PBS缓冲液重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。

6.根据权利要求5所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体的具体方法如下：称取适量步骤(1)分离得到的卵黄，按体积比1∶9加入pH 5.0的0.05M的乙酸-7酸钠缓冲液，搅拌均匀后4℃静置过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40％，4℃搅拌6h，10000g离心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40％，4℃搅拌过夜，10000g离心20min，沉淀用少量pH7.2的0.01M的PBS缓冲液重悬后，在PBS缓冲液中透析即得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体。

7.根据权利要求5所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于步骤(2)中胶体金制备方法如下：将100mL 0.01wt％的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅拌边加入1-2mL 1wt％柠檬酸三钠迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至100mL，无菌密封，4℃避光保存。

8.根据权利要求5所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的检测线距离所述的结合垫6-8mm；所述的质控线距离所述的吸水垫6-8mm，所述的检测线和所述的质控线的宽度分别为0.8-1mm，两条线相距为5mm。

9.根据权利要求3所述的一种弗氏柠檬酸杆菌检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液的包被量为1-2μL/cm；所述的兔抗鸡卵黄抗体的包被量为1-2μL/cm，所述的弗氏柠檬酸杆菌超声波破碎液是将所述的弗氏柠檬酸杆菌抗原用PBS重悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液。