CN105879027B

CN105879027B - 核酸配体修饰的金纳米-石墨烯复合材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105879027B
Application number: CN201410209071.2A
Authority: CN
Inventors: 林家骅; 黄志清; 杨令延; 范兰兰; 曾于庭
Original assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2034-05-16
Also published as: CN105879027A

Abstract

本发明公开一种核酸配体修饰的金纳米‑石墨烯复合材料及其制备方法和应用，所述复合材料包含核酸配体修饰的金纳米粒子和氧化石墨烯，其中所述氧化石墨烯表面负载有所述核酸配体修饰的金纳米粒子。本发明的核酸配体修饰的金纳米‑石墨烯复合纳米材料水溶性和生物兼容性好，没有明显生物毒副作用，且对癌细胞尤其是乳腺癌具有极佳的靶向性，可以作为乳腺癌光热疗试剂，在生物医学领域具有良好的应用价值。此外，本发明的制备流程简单，操作方便，成本低。

Description

核酸配体修饰的金纳米-石墨烯复合材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种核酸配体修饰的金纳米-石墨烯复合材料用于乳腺癌光热疗的制备方法，属于生物医学材料领域。

背景技术

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，早在2006年我国因乳腺癌死亡的病例已经超过美国，目前我国女性乳腺癌发病率依然有逐年上升的趋势。统计资料显示，2011年美国女性患乳腺癌的病例高达23万，为女性恶性肿瘤发病率第一。预计到2020年，全球患乳腺癌患者中将会有超过75％的病例出现在发展中国家。乳腺癌已经成为女性健康的头号杀手，为减少乳腺癌对我国社会及经济造成的严重影响，开展针对乳腺癌新型药物和治疗方法的研究具有十分重要的社会意义。

光热疗法是一种运用自然能量的治疗方法，相对于传统化学药物疗法及放射疗法，光热疗法并不会造成系统性影响且诱发的毒副作用较低。临床试验结果显示，与正常细胞相比癌细胞对温度升高较为敏感，正常细胞在其周围温度超过48℃后会才会死亡，而癌细胞在温度大于42℃时即有死亡现象的出现。当癌细胞所处环境温度范围在42-45℃时，细胞内许多生物酶类或结构蛋白功能将会改变，导致细胞生长及细胞分化受到影响，进而诱发细胞死亡。实现具有光热疗功能的纳米材料在肿瘤医疗领域的应用必须满足下列条件：1.对目标癌细胞具有靶向性；2.所需光源具有良好穿透性；3.具有较高光热转换效率；4.水溶性好；5.生物安全性高。

近红外光(near-infrared region，NIR)波长范围为700-900nm，此范围位于水与血红素光吸收量较低的波长，因此以NIR进行光热疗法治疗癌症，可减少对正常细胞的伤害。氧化石墨烯和金纳米粒子是目前NIR光热疗法较常用的光热转换纳米材料，相关研究成果认为这两种材料均具有较高的生物安全性。一般而言，金纳米粒子通过调整合成条件来改变材料形状及其粒径大小，以确保金纳米材料的波长符合NIR辐射的吸收范围，但是金纳米材料制作成本较高。氧化石墨烯除了具有NIR光热转换特性外，其生产成本低、物化性质稳定且具有良好的亲水性。此外，由于氧化石墨烯两基面都可以吸附物质，使得它在承载金属纳米粒子或其他化学物质的载药量优于其他纳米材料。因此氧化石墨烯用于承载金纳米粒子所得到的氧化石墨烯-金属复合材料对肿瘤光热疗法有良好的应用前景。

光热疗法使用的局限在于：环境温度的提升除了对癌细胞有杀伤作用外，高温对正常细胞也会造成一定程度的影响。因此如何提高纳米材料对癌细胞的靶向性成为纳米技术在光热疗领域应用亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌光热治疗的核酸配体修饰的金纳米-石墨烯复合纳米材料及其制备方法。

本发明的第一方面，提供一种纳米复合材料，所述纳米复合材料包含核酸配体修饰的金纳米粒子和氧化石墨烯，其中所述氧化石墨烯表面负载有所述核酸配体修饰的金纳米粒子。

本发明的纳米复合材料，也称为核酸配体修饰的金纳米-石墨烯复合材料。

在另一优选例中，所述氧化石墨烯的平均粒径为0.2-0.8微米。

在另一优选例中，所述金纳米粒子的平均粒径为8-20纳米。

在另一优选例中，所述核酸配体的序列如SEQ NO:1-3所示。

本发明的第二方面，提供第一方面所述的纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(a)将核酸配体与金纳米粒子混合反应得到所述核酸配体修饰的金纳米粒子；

(b)将所述步骤(a)得到的所述核酸配体修饰的金纳米粒子与所述氧化石墨烯反应，使所述氧化石墨烯表面负载所述核酸配体修饰的金纳米粒子得到第一方面所述的纳米复合材料。

本发明的第三方面，提供一种药物组合物，包含：

第一方面所述的纳米复合材料；以及

药学上可接受的载体。

本发明的第四方面，提供第一方面所述的纳米复合材料或第三方面所述的药物组合物的应用，用于：

(1)制备预防和/或治疗肿瘤的药物；

(2)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞的增殖；

(3)体外非治疗性地诱导肿瘤细胞的凋亡；

在另一优选例中，所述治疗包括抑制肿瘤细胞的增殖和/或诱导肿瘤细胞的凋亡。

在另一优选例中，所述肿瘤选自：肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤。

在另一优选例中，所述治疗为光热治疗。

本发明的第五方面，提供一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的增殖或诱导肿瘤细胞的凋亡的方法，将第一方面所述的纳米复合材料或第三方面所述的药物组合物与所述肿瘤细胞接触，从而抑制肿瘤细胞的增殖或诱导肿瘤细胞的凋亡。

在另一优选例中，所述接触为培养接触。

本发明的第六方面，提供一种治疗肿瘤的方法，对需要的对象给予安全有效量的第一方面所述的纳米复合材料或第三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述治疗为光热治疗。

在另一优选例中，所述需要的对象为非人哺乳动物或人，较佳地，为人、小鼠或大鼠。

为提高乳腺癌光热疗法所用试剂的治疗效率，并降低其制造成本，本发明提供了一种核酸配体修饰的金纳米-石墨烯复合纳米材料及其制备方法，利用氧化石墨烯的特殊性质，在氧化石墨烯上负载核酸配体及其修饰的金纳米粒子，使其对乳腺癌细胞表现出优越的靶向特性和良好的光热疗效果，用于乳腺癌光热治疗。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明纳米复合材料(GO-Au-Aptamer Nanoparticals，GO-Au-Apt NPs)合成示意图；

图2为本发明合成的氧化石墨烯(GO)的TEM图(A)及拉曼光谱图(B)；

图3为本发明的材料理化性质特征图，其中A为核酸配体-金纳米粒子(Aptamer-Au，Apt-Au)的TEM图，B为本发明纳米复合材料TEM图，C为本发明纳米复合材料TEM图，D为本发明纳米复合材料AFM图，E为本发明纳米复合材料厚度分析数据，F为本发明纳米复合材料紫外吸收光谱图；

图4为免疫荧光技术检测MCF7细胞与EA.hy926细胞的MUC1蛋白表达图；

图5为Western Blotting技术检测MCF7细胞与EA.hy926细胞的MUC1蛋白表达图；

图6为LDH检测法对本发明纳米复合材料生物毒性评估结果图；

图7为本发明纳米复合材料升温效果图，其中A为不同浓度纳米复合材料于近红外808nm激发光3W3分钟条件下升温曲线，B为2nM纳米复合材料与氧化石墨烯于近红外808nm激发光3W3分钟条件下升温对比曲线，C为0.2nM纳米复合材料与MCF7细胞孵育24小时，洗脱除去未结合的纳米复合材料的培养介质，于近红外808nm激发光3W5分钟条件下升温曲线；

图8为异硫氰酸荧光素标记本发明纳米复合材料于MCF7细胞与EA.hy926细胞靶向功能检测图；

图9为采用本发明纳米复合材料和氧化石墨烯分别孵育MCF7细胞与EA.hy926细胞24小时，洗脱除去未结合的纳米复合材料和氧化石墨烯，于近红外808nm激发光3W5分钟条件下光热治疗，继续孵育12小时(A)或24小时(B)后LDH检测法检测结果图；

图10为本发明纳米复合材料分别孵育MCF7细胞与EA.hy926细胞24小时，洗脱除去未结合的纳米复合材料，于近红外808nm激发光3W5分钟条件下光热治疗，继续孵育24小时后Western Blotting技术检测抗凋亡蛋白Bcl-2与凋亡蛋白Bax表达比值变化图。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外研发出一种氧化石墨烯表面负载有核酸配体修饰的金纳米粒子形成的纳米复合材料，具有较佳的水溶性和生物相容性，对癌细胞尤其是乳腺癌具有极佳的靶向性，可以作为乳腺癌光热疗试剂。在此基础上，完成了本发明。

MUC1蛋白

MUC1蛋白是由muc1基因表达的一种高糖基化(糖化大于50％)、高分子量蛋白，又称附膜蛋白。它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和肿瘤的发生与转移等方面都起到重要的作用。

MUC1蛋白是广泛表达在多种肿瘤细胞膜上的糖蛋白，已确定在多种肿瘤细胞中高表达，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等。由于MUC1与多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后有密切的关系，有其特有的结构和功能特点，并在多种肿瘤屮有过量表达，使其有可能成为一种广谱的肿瘤标记物和多种肿瘤治疗的靶标分子。例如，由于MUC1在乳腺肿瘤组织中的异常表达，使其成为一种重要的乳腺肿瘤生物学标志物。MUC1广泛分布并异常丰富地表达于乳腺癌细胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击靶点，也是光热纳米材料药物的靶向位点。

核酸配体

核酸配体是指利用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)，该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。将特定肿瘤细胞的核酸配体应用于氧化石墨烯载药系统的制备上，可以大幅提高肿瘤的光热治疗效率。

金纳米粒子

金纳米粒子是指金的微小颗粒，通常直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。通常由氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。

本发明中，优选的金纳米粒子的平均粒径为8-20nm，更优选地为10-18nm。

本发明中，所述平均粒径是指在TEM谱图中随机选取20个金纳米粒子测量粒径后计算得到的平均值，其中粒径＝(a+b)/2，其中a为选取的金纳米粒子的长径、b为选取的金纳米粒子的短径。

氧化石墨烯

氧化石墨烯是石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物，氧化石墨烯是单一的原子层，可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，因此，其结构跨越了一般化学和材料科学的典型尺度。氧化石墨烯可视为一种非传统型态的软性材料，具有聚合物、胶体、薄膜，以及两性分子的特性。氧化石墨烯长久以来被视为亲水性物质，因为其在水中具有优越的分散性，但是，相关实验结果显示，氧化石墨烯实际上具有两亲性，从石墨烯薄片边缘到中央呈现亲水至疏水的性质分布。因此，氧化石墨烯可如同界面活性剂一般存在界面，并降低界面间的能量。

本发明中，优选的氧化石墨烯的平均粒径为0.2-0.8微米，较佳地为0.3-0.7微米。

本发明中，所述平均粒径是指在TEM谱图中随机选取20个氧化石墨烯测量粒径后计算得到的平均值，其中粒径＝(a+b)/2，其中a为选取的氧化石墨烯的长径、b为选取的氧化石墨烯的短径。

纳米复合材料

本发明提供的纳米复合材料，包含核酸配体修饰的金纳米粒子和氧化石墨烯，其中所述氧化石墨烯表面负载有所述核酸配体修饰的金纳米粒子。

较佳地，所述核酸配体的序列如下所示：

SEQ NO:1：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTG-3’；

SEQ NO:2：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACGGCACTCACTCTTTGTTAAGTGGTCTGCTTCTTAACCTTCATCGACACGGTGGCTTA-3’；

SEQ NO:3：

5’-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGCTTTTTTTT-3’。

在另一优选例中，纳米复合材料的厚度为12-20nm。

制备方法

本发明提供了一种可以将金纳米粒子与氧化石墨烯结合制备纳米复合材料的方法，该方法使用核酸配体(DNA单链)将分别制备的金纳米粒子和氧化石墨烯结合在一起，所涉及的纳米复合材料合成过程如图1所示。具体过程分为四个部分：氧化石墨烯的制备；金纳米粒子制备；金纳米粒子与核酸配体的结合形成核酸配体修饰的金纳米粒子；核酸配体修饰的金纳米粒子被氧化石墨烯负载形成纳米复合材料。

本发明的制备方法，包括以下步骤：

(a)将核酸配体与金纳米粒子混合反应得到所述核酸配体修饰的金纳米粒子(核酸配体-金纳米粒子)；

(b)将所述步骤(a)得到的所述核酸配体修饰的金纳米粒子与所述氧化石墨烯反应，使所述氧化石墨烯表面负载所述核酸配体修饰的金纳米粒子得到第一方面所述的纳米复合材料(氧化石墨烯-金-核酸配体)。

药物组合物

本发明还提供一种药物组合物，包含本发明的纳米复合材料；以及药学上可接受的载体。

“药学上可用的载体”是指一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的纳米复合材料以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。可药用的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂

润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明的纳米复合材料和药物组合物可以是多种形式，可以通过如胶囊、片剂、颗粒剂、溶液状、粉剂、散剂或糖浆等形式口服给药或以注射剂的形式非口服给药，本发明的纳米复合材料和药物组合物可以存在于适宜的固体或液体载体中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。上述制剂可通过常规制药方法制备。

本发明的纳米复合材料和药物组合物可用于哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻或胃肠道等途径给药。最优选的给药途径为口服。

本发明的纳米复合材料和药物组合物对肿瘤细胞尤其是乳腺癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、多发性骨髓瘤细胞表现出优越的靶向特性和良好的光热疗效果，可以作为治疗肿瘤的光热疗试剂。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的有益之处在于：

(1)本发明提供一种新型的氧化石墨烯表面负载有核酸配体修饰的金纳米粒子构成的纳米复合材料及包含该材料的药物组合物；

(2)本发明的纳米复合材料水溶性和生物兼容性好，没有明显生物毒副作用；

(3)本发明的纳米复合材料及药物组合物对癌细胞尤其是乳腺癌具有极佳的靶向性，可用于制备预防和/或治疗尤其是光热治疗肿瘤的药物。

(4)本发明的制备方法简单，操作方便，成本低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

氧化石墨烯的制备

将90ml H₂SO₄(95.0-97.0％)与10ml H₃PO₄(95.0-97.0％)在双口瓶内混合均匀；加入0.75g石墨粉形成混合液。

将混合液水浴加热至50℃，再缓慢加入4.5g高锰酸钾；于50℃下反应12小时。

停止加热后，冰浴条件下，缓慢加入100ml去离子水；加入32％双氧水，直到溶液变成黄色。

以磷酸盐缓冲液(PB，10mM，pH7.4)将溶液置换至pH接近7，离心35000g，30分钟，将大、小片氧化石墨烯分离，取上清液。

图2是合成的氧化石墨烯(GO)的TEM图(A)及拉曼光谱图(B)。TEM结果显示所合成的氧化石墨烯大小均匀，平均粒径为0.56±0.1μm。拉曼光谱显示在1350cm^-1与1590cm^-1处有明显峰值，即D带与G带，表明石墨烯被氧化，得到氧化石墨烯。

利用可见紫外吸收光谱测定上清液Abs₂₂₉＝0.276；经冷冻干燥测定氧化石墨烯的浓度为1.74mg/mL。

实施例2

金纳米粒子制备

将所有实验用玻璃器皿，如圆底瓶、量筒和搅拌子等，用王水浸泡5-10分钟，以蒸馏水冲洗干净。

圆底瓶内加入50ml4mM柠檬酸钠，加热搅拌溶液至均匀沸腾。

保持柠檬酸钠溶液在均匀沸腾状态下将0.1M四氯金酸溶液500μl迅速加入，溶液颜色逐渐变化；持续搅拌8分钟后停止加热，移去加热搅拌装置并将圆底瓶冷却处理。

冷却后的金纳米粒子溶液存放于洁净干燥的血清瓶中，血清瓶外包裹铝箔避光，存放于4℃冰箱。

经检测，合成的金纳米粒子浓度为15nM。

实施例3

核酸配体修饰的金纳米粒子的制备

取100μM核酸配体(序列如SEQ NO:1所示)20μl置于微量离心管中，再加入实施例2制备的15nM的金纳米粒子1ml，均匀混合后，静置反应。反应2小时后，加入17μl50mM NaCl；再反应2小时后，加入67μl50mM NaCl。

反应过夜，即完成制备核酸配体修饰的金纳米粒子，浓度为15nM，在金纳米粒子上，核酸配体修饰密度为2.0。

进一步纯化：离心35000g，20分钟，去除上清液，以5mM PB(pH7)溶解；重复三次纯化，再利用Abs520nm(金纳米粒子特征吸收峰)，将核酸配体修饰的金纳米粒子的浓度定回至15nM。

图3中A为透射电子显微镜检测所合成的核酸配体修饰的金纳米粒子(核酸配体-金纳米粒子，Aptamer-Au，Apt-Au))图像，结果显示金纳米粒子连接核酸配体后分布及粒径大小均匀，平均粒径为13.86±2.1nm。

实施例4

纳米复合材料的制备

取1576.1μl去离子水置于微量离心管中，再依序加入350×(倍)GO(6.09mg/ml)57.14μl和150nM核酸配体修饰的金纳米粒子266.7μl均匀混合后，避光反应。

反应1小时后，加入100mM PB(pH7)100μl。

反应1小时后，即完成于2ml的5mM PB环境下10×GO(0.174mg/ml)吸附上20nM核酸配体修饰的金纳米粒子。

图3中B-F为纳米复合材料理化性质分析结果，其中，B-C图为纳米复合材料TEM(透射电子显微镜)结果图片，显示纳米复合材料分散均匀，有较多的金纳米-核酸配体吸附于氧化石墨烯表面；D-E图为纳米复合材料AFM(原子力显微镜)结果图片，显示纳米复合材料厚度均匀，平均厚度为17nm；F图为纳米复合材料可见紫外分光光谱检测结果，其在520nm有明显金离子吸收峰。

实施例5

乳腺癌细胞光热疗效果检测

为验证本发明金纳米粒子-氧化石墨烯复合材料对乳腺癌细胞的光热疗效果，选用了MCF7细胞(人类乳腺癌细胞)及EA.hy926细胞(人脐静脉细胞融合细胞)进行试验。

5.1MUC1蛋白表达检测

分别培养MCF7及EA.hy926细胞，取生长状态良好的两种细胞，分别使用PBS清洗2次，每次5分钟。4％多聚甲醛溶液室温固定细胞30分钟，PBS清洗2次，每次5分钟。于免疫荧光封闭液中室温封闭1小时。两种细胞分别孵育兔抗MUC1蛋白抗体(PBS稀释1000倍)，并于4℃放置过夜。PBS清洗3次，每次10分钟，以除去未结合的MUC1抗体。添加抗兔-488标记荧光二抗(PBS稀释1000倍)，于室温孵育2小时。添加Hoechst33342(PBS稀释2000倍)标记细胞核，于室温孵育15分钟。PBS清洗3次，每次10分钟。于荧光显微镜下拍照观察。其中MCF7细胞为MUC1蛋白阳性，EA.hy926细胞为MUC1蛋白阴性(图4)。

接着分别提取两种细胞总蛋白，并通过Western Blotting技术检测两种细胞总蛋白中MUC1含量。配制12％及4％聚丙烯酰胺凝胶，恒压100V条件下对总蛋白电泳分离，并通过湿转法将蛋白转移到固相载体PVDF膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2小时后，添加兔抗MUC1蛋白抗体(TBS稀释1000倍)，室温摇床孵育过夜，TBST清洗3次，每次10分钟，除去未结合一抗。添加HRP-抗兔二抗(TBS稀释1000倍)，室温摇床孵育2小时，TBST清洗3次，每次10分钟，除去未结合二抗。曝光拍照，β-actin蛋白作为对照。结果发现MCF7细胞有MUC1蛋白表达，而EA.hy926细胞无MUC1蛋白表达(图5)。

5.2生物毒性评价

对本发明纳米复合材料生物毒性进行评估。取生长状态良好的MCF7细胞接种于96孔细胞培养板，约5000细胞/孔。培养过夜后，加入不同浓度复合材料(细胞培养液稀释)，浓度范围为0.002-0.2nM(Au)。继续培养24小时后，加入MTT，继续培养4小时，弃去上清，加DMSO各100μl，室温震荡10分钟后于多功能微孔板检测仪检测OD490，并计算细胞活力变化。结果发现在复合材料最高浓度为2nM条件下，细胞活力在82.67％，证明纳米复合材无明显生物毒性(图6)。

5.3光热转换效果检测

分别使用808nm激发光于3W条件下对不同浓度纳米复合材及细胞培养液进行光照，每10秒记录温度变化，并绘制升温曲线(图7A)，结果显示浓度越高，材料升温效果越明显。相同条件下对比2nM纳米复合材料(GO-Au-Apt)及氧化石墨烯(GO)光热转换能力，绘制升温曲线(图7B)，结果显示GO-Au-Apt比GO有较好的光热转化能力。0.2nM GO-Au-Apt与MCF7细胞孵育24小时，PBS清洗，除去未结合的GO-Au-Apt，于808nm激发光于3W条件下检测温度变化(图7C)，结果显示结合GO-Au-Apt后，MCF7细胞有明显的升温现象。

5.4对乳腺癌细胞靶向功能检测

使用异硫氰酸荧光素(罗丹明B)修饰纳米复合材料，取0.2nM分别与MCF7及EA.hy926细胞于37℃环境下孵育24小时，PBS清洗3次，每次10分钟，除去未结合的纳米复合材料。于荧光显微镜下拍照观察，结果显示MCF7细胞中有较多的罗丹明B的阳性信号，而EA.hy926细胞中几乎检测不到(图8)，说明本发明的纳米复合材料对乳腺癌细胞具有较好的靶向能力。

5.5纳米复合材料光热疗效果检测

取生长状态良好的MCF7与EA.hy926细胞，分别接种于96孔细胞培养板，孵育0.2nM金纳米粒子-氧化石墨烯复合材料24小时后，进行PBS洗脱，除去未结合的纳米材料。通过近红外808nm激发光于3W5分钟的条件下分别对两种细胞进行光热疗处理，继续孵育12小时或24小时后通过MTT细胞活力检测法检测两种细胞活力变化情况，结果如图9所示，其中9A为热疗后孵育12小时后细胞活力变化，图9B为热疗后孵育24小时后细胞活力变化。

统计分析发现MCF7细胞活力变化相对EA.hy926细胞具有显著性差异，说明本发明修饰核酸配体的纳米复合材料对乳腺癌细胞具有较强的光热疗杀伤作用。

5.6光热疗后细胞凋亡相关蛋白表达检测

取生长状态良好的MCF7与EA.hy926细胞，分别接种于24孔细胞培养板，孵育0.2nM金纳米粒子-氧化石墨烯复合材料24小时后，进行PBS洗脱，除去未结合的纳米材料。通过近红外808nm激发光于3W5分钟的条件下分别对两种细胞进行光热疗处理，继续孵育24小时后分别提取细胞总蛋白进行Western Blotting检测抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax表达比值变化(图10)。

结果显示光热疗后MCF7细胞中Bcl-2/Bax蛋白表达比值明显低于EA.hy926细胞，意味着光热疗对乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白影响更明显，有效促进乳腺癌细胞的凋亡。

实施例6

纳米复合材料的制备及检测

采用实施例3和4的方法制备纳米复合材料，不同之处在于，采用序列如下的核酸配体取代序列如SEQ NO:1所示的核酸配体：

SEQ NO:2：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACGGCACTCACTCTTTGTTAAGTGGTCTGCTTCTTAACCTTCATCGACACGGTGGCTTA-3’；或

SEQ NO:3：

5’-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGCTTTTTTTT-3’。

采用实施例5的方法对制备的复合材料进行检测，不同之处在于采用肝癌细胞(Hep3B细胞)进行试验，结果表明核酸配体的纳米复合材料对肝癌细胞具有较强的光热疗杀伤作用，有效促进肝癌细胞的凋亡。

由以上实施例可知，本发明的核酸配体并不限于实施例中所用的配体，针对治疗的肿瘤，如肝癌、胃癌、卵巢癌或白血病，可应用相应的核酸配体修饰纳米金，并载于氧化石墨烯表面制备纳米复合材料，用于预防和/或治疗相应的肿瘤，具有较好的靶向功能，降低对正常细胞的毒副作用，提高治疗效率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种纳米复合材料，其特征在于，所述纳米复合材料包含核酸配体修饰的金纳米粒子和氧化石墨烯，其中所述氧化石墨烯表面负载有所述核酸配体修饰的金纳米粒子，其中，所述核酸配体的序列如SEQ NO:1所示，

所述纳米复合材料的厚度为12-20nm，

所述氧化石墨烯的平均粒径为0.56±0.1微米，

所述核酸配体修饰的金纳米粒子的平均粒径为13.86±2.1纳米，

所述纳米复合材料采用包括以下步骤的方法制备：

(b)将所述步骤(a)得到的所述核酸配体修饰的金纳米粒子与所述氧化石墨烯反应，使所述氧化石墨烯表面负载所述核酸配体修饰的金纳米粒子得到所述的纳米复合材料。

2.如权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述氧化石墨烯的平均粒径为0.56微米。

3.如权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述核酸配体修饰的金纳米粒子的平均粒径为13.86纳米。

4.如权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(b)将所述步骤(a)得到的所述核酸配体修饰的金纳米粒子与所述氧化石墨烯反应，使所述氧化石墨烯表面负载所述核酸配体修饰的金纳米粒子得到权利要求1所述的纳米复合材料，

其中，所述核酸配体的序列如SEQ NO:1所示。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：

权利要求1所述的纳米复合材料；以及

药学上可接受的载体。

6.如权利要求1所述的纳米复合材料或权利要求5所述的药物组合物的应用，其特征在于，用于：

(1)制备预防和/或治疗乳腺肿瘤的药物；

(2)体外非治疗性地抑制乳腺肿瘤细胞的增殖；或

(3)体外非治疗性地诱导乳腺肿瘤细胞的凋亡。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗包括抑制乳腺肿瘤细胞的增殖和/或诱导乳腺肿瘤细胞的凋亡。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗为光热治疗。