CN105873570A - 治疗性蛋白质的持续释放储槽式调配物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种储槽式调配物，其包括治疗性蛋白质。所述治疗性蛋白质可以是基于毒素的治疗性蛋白质。所述储槽式调配物在单次投予后在持续有效含量内释放所述治疗性蛋白质至少一个月。所述基于毒素的治疗性蛋白质可包括基于ShK的蛋白质。

Description

治疗性蛋白质的持续释放储槽式调配物和其用途
相关申请案的交叉引用
本申请案要求2013年12月23日申请的美国临时专利申请案第61/920,383号的优先权和权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于持续释放治疗性蛋白质的调配物，其包括具有至少一个二硫桥键的基于毒素的治疗性蛋白质。也披露产生和使用所述调配物的方法。在单次投予后，调配物在受试者体内实现持续有效含量的治疗性蛋白质维持至少一个月。
背景技术
一般来说，治疗性药品具有介于最小有效剂量与最大容许剂量之间的可接受有效含量的范围，称为药品的治疗窗。维持药品在治疗窗内需要不超过最大容许剂量的持续有效含量的药物。
在治疗性蛋白质的情况下，通常通过频繁非经肠注射实现不超过最大容许剂量的持续有效含量。然而，频繁注射的需求是不方便的，可能导致受试者顺应性不佳，并且可能引起受试者体内治疗性蛋白质的波动和潜在有害的含量。
多次注射的替代方法利用调节治疗性蛋白质在投予至受试者之后随时间释放的可生物降解材料。通过相互作用导致治疗性蛋白质控制缓慢释放的分子排列的封装和形成方法，理论上可实现持续升高的蛋白质含量。尽管所述方法理论上运作良好，但已发现此类释放系统通常显示称为“爆发”的极高初始释放速率，使大量治疗性蛋白质在投予之后快速释出。这一爆发可能形成超过治疗窗的蛋白质浓度，通常导致非所要副作用并且释放系统中随后留下不足以支撑稍后的有效含量的量。另外，此类组合物通常在血液浓度中产生非所要峰值和谷值，导致治疗含量随时间不一致。
例如生理学温度、生物分子的环境和对投予控制释放组合物的免疫反应等因素可能会通过例如分解和聚集等造成生物可用性差的机制不利地改变治疗性蛋白质的处置。这些自然过程可能会干扰组合物的所要释放曲线和效用，尤其因为蛋白质是具有许多限定分解和消除路径的本质上不稳定分子。
已成功地形成包括例如亮丙立德(leuprolide)(和相关化合物，包括布舍瑞林(buserelin)、组氨瑞林(histrelin)、戈舍瑞林(goserelin)、那法瑞林(nafarelin)以及曲普瑞林(triptorellin))的促性腺素释放激素(GnRH)促效剂的控制释放组合物，其展现在投予之后1-3个月的持续释放(美国专利第5,980,945号；第6,036,976号；第6,337,618号)。黄体生成素释放激素(LH-RH)促效剂也已经组合到控制释放组合物中(美国专利第3,853,837号、第4,008,209号、第3,972,859号、第4,086,219号、第4,124,577号、第4,253,997号以及第4,317,815号；英国专利第1423083号)。然而，这些调配物中的活性化合物极短(约9个氨基酸)并且缺乏与治疗性蛋白质活性有关的高级结构要素，例如二级结构要素(例如α-螺旋和β-薄片)以及三级结构要素。举例来说，NMR结构已表明一个I型或II型β转角。另外，看起来并非这些单个直链类似物形式的化合物的治疗功效所必需的结构组分显示针对例如MCF-7乳癌细胞系的相关目标的强效活性。
已经进行大量工作来尝试解决与产生更复杂治疗性蛋白质的持续释放储槽式调配物有关的问题(参看例如艾利森(Allison),药物传递的专业观点(Expert Opin.Drug Deliv.)5:615-28,2008；徐(Xu)等人,药学学报(Acta Pharmaceutica Sinica),42:1-7,2007；荣格(Jung)等人,国际药学研究(Arch.Pharm.Res.)32:359-65,2009；波伊索(Bouissou)等人,药学研究(Pharm.Res.)23:1295-305,2006；卢安(Luan)等人,欧洲药剂学和生物药剂学期刊(Eur.J.Pharm.Biopharm.)63:205-14,2006；邓肯(Duncan)等人,控制释放期刊(J.Control Release)110:34-48,2005；利奇(Leach)等人,医药科学期刊(J.Pharm.Sci.)94:56-69,2005；杨(Yeo)等人,国际药学研究27:1-12,2004；叶(Yeh)等人,微胶囊期刊(J.Microencapsul.)24:82-93,2007；科斯坦蒂诺(Costantino)等人,医药科学期刊93:2624-2634,2004；杨等人,国际药学研究,27:1-12,2004；萍(Pean)等人,控制释放期刊56:175-187,1998；美国专利第5,891,478号；卡拉斯基罗(Carrasquillo),控制释放期刊76:199-208,2001；卡斯特利亚诺斯(Castellanos)等人,医药药理学期刊(J.PharmPharmacol)53:1099-1107,2001；李(Lee)等人,生物化学期刊(J.Biol.Chem.)256:7193-7201,1981；佩雷斯(Perez.)等人,医药药理学期刊54:301-313,2002；以及泰勒(Taylor)等人,糖尿病(Diabetes)51(增刊2):A85,2002)。尽管这一领域中已有大量研究，然而，仅少数肽成功地调配成控制释放组合物。
尝试控制和降低蛋白质释放的初始爆发第先前实例大部分不成功并且包括：牛血清白蛋白(BSA)(萨马迪(Samadi)等人,生物大分子(Biomacromolecules)14:1044-53 2013)；α-胰凝乳蛋白酶(弗洛雷斯(Flores)-费尔南德斯(Fernández)等人,结果医药科学(ResultsPharma,Sci.)2:46-51,2012)；粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)(张(Zhang)等人,微胶囊期刊(J.Microencapsul.)28:743-51,2011)；干扰素α-2b(李(Li)等人,国际药学期刊(Int.J.Pharm.)410:48-53,2011)；组织坏死因子α(TNF-α)(金姆(Kim)等人,控制释放期刊150:63-9,2011)；红细胞生成素、神经生长因子以及人类生长因子(耶(Ye)等人,控制释放期刊(J Control Release.)146:241-60,2010)以及人类生长激素(美国专利第5,891,478号)。展现明显早期爆发的调配物也已在例如郑(Zheng)等人,药物传递(Drug Deliv.)17:77-82,2010中综述。
与实现治疗性蛋白质持续释放有关的额外难题包括囊封蛋白质的不稳定性和/或治疗性蛋白质从组合物的不完全释放(叶等人,国际药学研究,27:1-12,2004)。已尝试许多方法来解决这些问题中的每一者，包括稳定赋形剂(李等人,生物化学期刊,256:7193-7201,1981)、核-壳结构(袁(Yuan)等人,国际纳米医学期刊(Int.J.Nanomedicine)7:257-270,2012)以及活性组分的分子工程改造(卢克(Lucke)等人,药物研究(Pharm.Res.),19:175-181,2002)。尽管进行了全部这些方法和尝试，但治疗性蛋白质大部分未能成功调配成持续释放系统。参看例如帕伊(Pai)等人,AAPS J.11(1):88-98,2009年3月；PMCID:PMC2664882。
发明内容
需要投予无需多次注射就能实现有效含量的蛋白质持续释放形式的治疗性蛋白质的能力。尤其需要投予比不具有复杂结构的事先调配的短蛋白质(例如GnRH促效剂或LH-RH)更复杂的治疗性蛋白质的能力。
本发明通过提供持续释放治疗性蛋白质(包括基于毒素的治疗性蛋白质)的调配物解决这些需要。蛋白质可包括至少一个二硫桥键。在单次投予之后，调配物提供持续有效含量的治疗性蛋白质维持至少一个月。也披露产生和使用所述调配物的方法。
具体来说，本发明提供包括至少一种治疗性蛋白质的持续释放储槽式调配物。更具体来说，持续释放储槽式调配物包括包含治疗性蛋白质的内部水相、包括可生物降解的聚合物的第二相(油/固体相)以及分散有粒子的第三外部水相。内部水相可以是特定化学改性的微环境，其中选择保留具体治疗性蛋白质的原生和活性构形并且允许其与第二相聚合物相容从而实现蛋白质随时间持续释放的pH、盐浓度、溶剂、稳定剂以及释放改性剂。
附图说明
图1为在37℃下使用机械搅拌将聚合物类型PLG1A、PLG2A、PLG3A、PLG5E以及PLG7E(代表不同分子量和封端化学性质的一定范围的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG))调配到2w/v％十二烷基硫酸钠(SDDS)介质中的体外释放曲线。
图2A和2B显示如通过动态光散射所测量的三个独立批次的PLG2A调配物的分散液尺寸。图2A示出了通过强度绘制的ShK-186持续释放储槽式调配物的尺寸分布；图2B示出了如通过动态光散射所测量的调配物中的粒子的体积加权分布。
图3为负载治疗性蛋白质的PLG2A聚合物调配物的ζ电位(如通过电泳迁移率测量的粒子表面电荷)的测量值。阴离子表面层帮助赋予水性悬浮液中的分散稳定性。ζ电位测量值显示电荷为-75、-72和-72mV的阴离子粒子的类似紧凑簇，提供通过静电排斥有助于胶体稳定性的库仑相互作用。
图4为调配物(PLG2A)的光学显微图像，显示调配物内粒子的形状和大致均匀几何尺寸。所述图显示PLG聚合物囊封ShK-186的光学显微(100×)图像，显示具有一微米尺寸的圆形(可能球形)粒子。
图5A和5B显示向史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)单次皮下(SC)注射多种调配物后，以40,000μg/kg给药的ShK-186的体内释放速率。悬浮液使用PLG1A、PLG2A和PLG3A制备。图5A以线性标度显示这一数据，而图5B提供对数(Log)标度。
图6A和B为用PLG2A调配的不同剂量(高＝40,000μg/kg，中等＝20,000μg/kg，低＝10,000μg/kg)的ShK-186的体内释放的图。保持史泊格-多利大鼠体内ShK-186的血清含量在相对窄浓度范围上超过30天。图6A显示线性标度。图6B显示对数标度。
图7A和7B为单次SC注射之后，史泊格多利大鼠体内以10,000μg/kg给药的ShK-192的体内释放图。达到的最大浓度为几乎t＝12天表明治疗性蛋白质从演进PLG2A持续释放储槽式调配物逐渐释放，这是相对平稳地持续30天的过程。图7A显示线性标度。图7B显示对数标度。
图8为针对PLG2A调配物的史泊格-多利大鼠体内，以20,000μg/kg用一次SC注射给药的ShK-186的体内释放曲线，显示t＝2天时的Cmax以及延伸56天的长期持续释放尾。
具体实施方式
多蛋白质因为在体内展现生物活性而适用作治疗性药品。然而，尝试使用这些蛋白质作为疗法时，难以不频繁注射投予就实现持续有效含量的蛋白质。
多次注射的替代方法为投予已囊封在调节治疗性蛋白质随时间释放的可生物降解材料中的治疗性蛋白质。尽管这一方法理论上良好起作用，但已发现难以实现此类控制释放组合物。举例来说，许多此类控制释放组合物显示可能形成超过治疗窗的药物浓度的爆发，由此增加非所需副作用的可能性，并且最后在组合物中留下不足以持续随后有效含量的量的治疗性蛋白质。例如生理学温度、生物分子环境和对投予控制释放组合物的免疫反应的因素也可能不利地改变治疗性蛋白质的处置。
本文所披露的持续释放储槽式调配物克服前述尝试的失败，例如本文所引用的参考文献中所述的那些。本文所披露的调配物通过解除给药(避免多次注射)和减少非所要副作用可提高患者顺应性。
在具体实施例中，本文所披露的调配物显示最小爆发作用的释放特征以及小于5或小于3的Cmax比C平均的比率。这些比率表明如使用结构敏感生物分析体外和体内测量，分子结构的协同方面、调配物相互作用和工艺的成功组合以实现稳定治疗性蛋白质的相对均匀释放。已控制包括第二最大值相对于第一最大值的尺寸(三相组分，卢安等人,欧洲药剂学和生物药剂学期刊.63:205-14,2006)和谷值的深度的释放曲线的特征来产生随延伸时间段(例如超过一个月并且高达至少56天)明显稳定的血清含量。因此，在单次投予后，本文所披露的持续释放储槽式调配物实现治疗性蛋白质的适合释放特征(例如几乎零级释放动力学)超过一个月或更久的时间段。
“持续释放”应解释为包括：(1)单次投予后在有效含量内释放至少一个月；或(2)在单次投予后，在Cmax比C平均比率不超过5或不超过3的有效含量内释放至少一个月。“持续释放”也可以解释为包括：(1)单次投予后在有效含量内释放至少56天；或(2)在单次投予后，在Cmax比C平均比率不超过5或不超过3的有效含量内释放至少56天。
“有效含量”是在具体蛋白质治疗窗内的实现预期防治性治疗或治疗性治疗而不形成不希望的副作用的那些含量。
“储槽式调配物”包括在投予后提供治疗性蛋白质向周围组织中的持续释放的治疗性蛋白质传递系统。
通过在本文所披露的工艺中组合治疗性蛋白质和赋形剂实现所述储槽式调配物，所述工艺在具体实施例中，形成微囊封可生物降解颗粒分散液。
在具体实施例中，本发明包括包含至少一种治疗性蛋白质的储槽式调配物。更具体来说，储槽式调配物可包括包含治疗性蛋白质的内部水相、包括聚合物的第二中间相(油/固相；在具体实施例中，聚合物可生物降解)，以及可分散粒子的第三外部水相。内部水相是特定化学改性的微环境，其中选择保留具体治疗性蛋白质的原生和活性构形并且允许其与第二聚合物相容从而实现蛋白质随时间持续释放的pH、盐浓度、溶剂、稳定剂以及释放改性剂。
本文所披露的实施例可包括：(i)包括治疗性蛋白质的内部水相，治疗性蛋白质以储槽式调配物的重量计0.025重量％到5重量％存在；(ii)基于聚合物的油/固相；以及(iii)包括以储槽式调配物的重量计0.01重量％到1重量％存在的表面活性剂的外部水相，其中储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放治疗性蛋白质至少一个月。
在各种实施例中，储槽式调配物包括由内部水相和聚合物相制成的粒子。在多个实施例中，储槽式调配物包括由内部水相和水相包围的聚合物相制成的粒子。
聚合物.本文所披露的储槽式调配物中所用的具体聚合物组合物和制剂提供在生理条件下形成允许从所述结构持续释放治疗性蛋白质的结构的化学微环境。在具体实施例中，通过例如经水合聚合物基质扩散的过程产生持续释放。
聚合物通常可以是仅微溶或不溶于水；以及在向受试者投予之后生物相容和可生物降解。“微溶”意思是聚合物在水中溶解不超过3重量％。本文所披露的储槽式调配物中所用的聚合物的平均分子量一般在3,000道尔顿(Da)到100,000Da范围内，并且在具体实施例中，约3,000到20,000Da范围内。这些聚合物的多分散性通常在1.1到4.0范围内。具体储槽式调配物中所用的生物相容性聚合物的量取决于治疗性蛋白质的药理学活性强度和其所要释放速率。
聚合物的化学性质可包括酸，脂肪族聚酯(均聚物，例如聚(乳酸))，共聚物，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)、羟基羧酸、α-羟基酸、聚(氨基酸)和/或聚(氰基丙烯酸)酯。最优选为乳酸和/或乙醇酸的酯，即聚(丙交酯)、聚(乙交酯)和/或PLG。本文所披露的储槽式调配物还可包括这些聚合物的聚乙二醇化、乙氧基化和其它衍生型式，包括亲水性(羧基封端的)和更疏水性(酯封端的)封端结构。
在具体实施例中，示范性聚合物包括可生物降解聚合物，包括具有所要丙交酯:乙交酯比率、平均分子量、多分散性和末端基团化学性质的聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(己内酯)和聚(丙交酯)-共(乙交酯)(PLG)。
在各种实施例中，所用聚合物可以是羧基封端的中等分子量PLG。“低分子量”指的是聚合物的分子量为1,000Da到10,000Da。“中等分子量”指的是分子量为10,000Da到25,000Da的聚合物。“高分子量”指的是分子量大于25,000Da的聚合物。
在具体实施例中，所用聚合物可以是PLG1A、PLG2A、PLG3A、PLG5E或PLG7E。PLG1A是分子量为5.9kDa的羧基封端的PLG聚合物。PLG2A是分子量为13.6kDa的羧基封端的PLG聚合物。PLG3A是分子量为32kDa的羧基封端的PLG聚合物。PLG5E是分子量为75kDa的酯化PLG聚合物。PLG7E是分子量为68kDa的酯化PLG聚合物。使用多种等级以不同比率掺合不同聚合物类型可导致从贡献聚合物中的每一者借用的特征。因此，还可以使用掺合物和共聚物。掺合物包括不同聚合物的混合物。共聚物包括由至少两种不同构成单体制成的那些。
溶剂和赋形剂.通过水解聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)的酯键形成的强酸性微环境提供可能不利影响治疗性蛋白质的稳定性的苛刻环境。为了克服这些挑战，本文所披露的储槽式调配物的内部水相可以通过缓冲液和盐溶液控制pH。内部水相可以通过组合pH缓冲剂物质和赋形剂来稳定，赋形剂包括乙酸、碳酸、磷酸，以及盐，例如磷酸氢钠，盐酸、氢氧化钠、精氨酸和赖氨酸。在具体实施例中，使用具有140mM氯化钠盐的磷酸盐缓冲水溶液。在具体实施例中，这些缓冲系统设计成保持储槽式调配物的内部水相的pH高于6。
在具体实施例中，内部水相的pH为6.0、7.0、7.4或8.0(磷酸盐缓冲液)；5.0或6.0(组氨酸)；4.5、5.0或6.0(柠檬酸盐)；4.5、5.0或5.5(乙酸盐)、Mg(OH)2。使用NaCl、KCl和/或CaCl2可以使内部水相的离子强度是0-200mM。
内部水相还可包括蛋白质稳定剂，例如白蛋白、明胶、柠檬酸、乙二胺钠乙酸四铵、糊精、硫酸氢钠、多元醇，例如聚(乙二醇)，和/或防腐剂，例如对羟基甲苯、对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、苯甲醇、氯丁醇和硫柳汞。
使用不同溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、三醋精、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、酚类或其组合)可改变粒径和结构来调节释放特征。其它适用溶剂包括水、乙醇、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、丙酮、甲醇、异丙醇(IPA)、苯甲酸乙酯和苯甲酸苯甲酯。
例如表面活性剂、清洁剂、内相粘度强化剂、复合剂、表面活性分子、共溶剂、螯合剂、稳定剂、纤维素衍生物、(羟丙基)甲基纤维素(HPMC)、乙酸HPMC、乙酸纤维素、普朗尼克(pluronics)(例如F68/F127)、聚山梨醇酯、(特拉华州威明顿的美国禾大(Croda Americas,Wilmington,Delaware))、聚(乙烯醇)(PVA)、(特拉华州威明顿的美国禾大)、乙酸异丁酸蔗糖(SAIB)、盐和缓冲剂的释放改性剂也可以改变储槽式调配物的治疗性蛋白质释放的特性。
分配到储槽式调配物的内粒子的外相边界的赋形剂，例如表面活性剂，包括聚山梨醇酯、二辛基磺基丁二酸酯、泊洛沙姆和PVA，也可以用有利方式改变包括粒子稳定性和侵蚀速率、水合作用和通道结构、界面传输和动力学的特性。粒子的外相边界(可以通过例如内部水相周围的聚合物固体/油相形成)为包围粒子的外部水相附近的粒子部分。
在具体实施例中，外部水相的pH可以在5.5-8.5范围内并且可包括0-200mM范围中的磷酸盐、柠檬酸盐，以及包括NaCl、KCl和/或CaCl2的盐。
不同表面活性剂物质还可以用于稳定本文所披露的储槽式调配物以及所述的乳液。示范性表面活性剂包括环氧乙烷-环氧丙烷掺合物(PEO-PPO)二嵌段和三嵌段共聚物，脱水山梨糖醇酯，例如(特拉华州威明顿的美国禾大)、PVA、 (德国达姆施塔特的赢创罗姆有限公司(EvonikGmbH,Darmstadt,Germany))、泊洛沙姆、多库酯钠以及SDDS。
所披露储槽式调配物的额外处理可利用稳定赋形剂，包括甘露糖醇、蔗糖、海藻糖以及甘氨酸，在例如Tris、柠檬酸盐或组氨酸的缓冲剂中，与例如聚山梨醇酯、PVA和二辛基磺基丁二酸酯的其它组分一起进行。也可以使用产生复原成初始悬浮液的类似尺寸和效能特征的极低水分粉末的冷冻-干燥循环。
治疗性蛋白质.作为本文所述的储槽式调配物的部分提供的治疗性蛋白质可包括与前述控制释放组合物中所发现的蛋白质相比长度较长和/或结构更复杂的蛋白质。
示范性治疗性蛋白质为基于毒素的治疗性蛋白质。用于本文所披露的储槽式调配物的基于毒素的治疗性蛋白质的具体实例结合电压门控性通道。示范性电压门控性通道包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7、Kv2.1、Kv3.1、Kv3.2、Kv11.1、Kc1.1、Kc2.1、Kc3.1、Nav1.2、Nav1.4以及Cav1.2通道。
毒素蛋白质由多种生物体产生并且已演化成结合到离子通道和受体。来自蛇、蝎、蜘蛛、蜜蜂、蜗牛和海葵的原生毒素蛋白质的长度通常为10-80个氨基酸并且包括2到5个形成致密分子结构的二硫桥键。这些蛋白质看起来已从少数结构构架演化。蛋白质丛集成折叠图案家族，其通过半胱氨酸/二硫化物环结构保守以维持有助于效能、稳定性和选择性的三维结构，其全部为形成本发明的储槽式调配物时至关重要的要素。(彭宁顿(Pennington)等人,生物化学(Biochemistry),38,14549-14558(1999)；脱特(Tudor)等人,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),251,133-141(1998)；以及贾维(Jaravine)等人,生物化学(Biochemistry),36,1223-1232,(1997))。
“基于毒素的治疗性蛋白质”包括表1的基于毒素的蛋白质(或其变异体、D-取代的类似物、羧基末端酰胺、改性、衍生物或药学上可接受的盐)，和表2的基于ShK的蛋白质(或其变异体、D-取代的类似物、羧基末端酰胺、修饰物、衍生物或药学上可接受的盐)。基于毒素的治疗性蛋白质可以是合成或天然存在的。
“基于毒素的蛋白质”包括任何合成或天然已知毒素蛋白质和表1中披露的那些蛋白质，以及其变异体、D-取代的类似物、羧基末端酰胺、修饰物、衍生物或药学上可接受的盐。用于储槽式调配物和用于本文所披露的方法中的具体示范性基于毒素的治疗性蛋白质包括表1中所列的基于毒素的蛋白质，并且如序列表中作为SEQ ID NO:225-256所列出。
ShK为通过三个二硫桥键交联的高度结构化35残基蛋白质，其活性关键取决于其三维结构。保持这一治疗性蛋白质的效能的储槽式调配物需要稳定和保留前述调配尝试中并非必需或解决的高级结构要素并且因此提供治疗性治疗的改良。
ShK蛋白质为可用于本文所披露的储槽式调配物和方法的毒素蛋白质亚型。ShK蛋白质最初从加勒比海葵地毯海葵(Stichodactyla helianthus)分离。ShK蛋白质用作Kv1.3通道的抑制剂。通过抑制Kv1.3通道，在某些实施例中，ShK蛋白质可抑制皮摩尔浓度的效应记忆细胞(TEM)的活化、增殖和/或细胞激素产生或通过皮摩尔浓度的效应记忆细胞(TEM)抑制活化、增殖和/或细胞激素产生。
“抑制剂”为降低或消除生物活性的任何基于毒素的治疗性蛋白质，所述生物活性通常是基于化合物与受体的相互作用的结果，包括生物合成和/或催化活性、受体、或信号转导路径活性、基因转录或转译、细胞蛋白传输等。
原生ShK蛋白质描述于例如彭宁顿等人,国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Protein Res.),46,354-358(1995)中。在本发明范围内的示范性ShK结构还公开于Beeton等人,分子药理学(Mol.Pharmacol.),67,1369-1381(2005)；美国公开案第2008/0221024号；PCT公开案第WO/2012/170392号；以及美国专利第8,080,523号和第8,440,621号中。
“基于ShK的蛋白质”包括任何合成或天然已知ShK蛋白质以及其变异体、D-取代类似物、羧基末端酰胺、修饰物、衍生物和药学上可接受的盐。
用于本文所披露的储槽式调配物中的具体示范性基于ShK的蛋白质包括表2中列出的那些，并且在序列表中作为SEQ ID NO:1-224和SEQ ID NO:257-260显示。用于本文所披露的具体实施例中的基于ShK的蛋白质包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:208、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:217、SEQ IDNO:218以及SEQ ID NO:221的那些。
所属领域的技术人员了解设计具有增强特性的基于毒素的治疗性蛋白质的技术，例如丙氨酸扫描、使用已知序列的基于比对介导的突变诱发的合理设计和/或分子建模。举例来说，基于毒素的治疗性蛋白质可以设计成去除蛋白酶裂解位点(例如K或R残基处的胰蛋白酶裂解位点和/或F、Y或W残基处的胰凝乳蛋白酶裂解位点)。非水解磷酸酯取代也对磷酸酯基赋予稳定作用以及针对磷酸酶的稳定性。非水解磷酸酯基包括磷酸酪氨酸的膦酸酯类似物，例如4-膦酰基甲基苯丙氨酸(Pmp)、4-膦酰基二氟甲基苯丙氨酸(F2Pmp)、对膦酰基苯丙氨酸、单氟膦酰基甲基苯丙氨酸、磺酰基(二氟甲基)苯丙氨酸(F2Smp)和羟基膦酰基甲基苯丙氨酸。在其它实施例中，可使用磷酸酪氨酸模拟物，例如OMT、FOMT和利用羧酸基复制磷酸酯基官能度的其它类似物，如布尔克(Burke)和李,化学研究评述(Acc.Chem.Res.),36,426-433(2003)中所述。在另一实施例中，非水解类似物包括甲基-、芳氧基-和硫基-乙基磷酸。在另一实施例中，非水解磷酸酯衍生物包括二氟亚甲基膦酸和二氟亚甲基磺酸。
为了提高基于毒素的治疗性蛋白质的结构的药物动力学和药效学(PK/PD)特性，可取代、置换或改性对降解特性敏感的残基。用酰胺改性C端酸官能也可以赋予稳定性。基于毒素的治疗性蛋白质的主要结构的这些改变可以与N端的阴离子部分组合产生稳定和选择性Kv1.3阻断剂。为了制造具有较高体内半衰期的基于毒素的治疗性蛋白质，可以制备蛋白质的变异体或修饰物，其中关键蛋白水解消化位点可以经取代以降低蛋白酶敏感性。这可以包括用保守电子等排置换(例如Lys置换成Lys(乙酰基)或Gln)和或中性置换(Ala)取代非必需残基。
本文所披露的基于毒素的治疗性蛋白质的“变异体”包括相较于本文所披露的基于毒素或基于ShK的蛋白质具有一或多个氨基酸添加、缺失、停止位置或取代的蛋白质。
氨基酸取代可以是保守或非保守取代。本文所披露的基于毒素的治疗性蛋白质的变异体可包括具有一或多个保守氨基酸取代的那些。“保守取代”涉及以下保守取代基中的一者中存在的取代：第1组：丙氨酸(Ala；A)、甘氨酸(Gly；G)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)；第2组：天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酸(Glu；E)；第3组：天冬酰胺(Asn；N)、谷酰胺(Gln；Q)；第4组：精氨酸(Arg；R)、赖氨酸(Lys；K)、组氨酸(His；H)；第5组：异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、甲硫氨酸(Met；M)、缬氨酸(Val；V)；以及第6组：苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)、色氨酸(Trp；W)。
另外，氨基酸可以根据类似功能、化学结构或组成(例如酸性、碱性、脂肪族、芳香族或含硫)分组成保守取代基。举例来说，为了取代，脂肪族分组可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。包括彼此视为保守取代的氨基酸的其它组包括：含硫：Met和Cys；酸性：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂肪族非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性带负电残基和其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性带正电残基：His、Arg和Lys；大脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。额外信息见于克赖顿(Creighton)(1984)蛋白质(Proteins),W.H.弗里曼和公司(W.H.Freeman and Company)。
本文所披露的基于毒素的治疗性蛋白质的变异体还包括与本文所披露的蛋白质序列具有至少70％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性的蛋白质。
用于本文所披露的以基于毒素的蛋白质为基础的储槽式调配物的基于毒素的治疗性蛋白质的变异体包括以下蛋白质，其与SEQ ID NO:225-256中任一者共享70％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享75％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享80％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享81％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享82％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享83％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享84％序列一致性；与SEQ IDNO:225-256中任一者共享85％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享86％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享87％序列一致性；与SEQ IDNO:225-256中任一者共享88％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享89％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享90％序列一致性；与SEQ IDNO:225-256中任一者共享91％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享92％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享93％序列一致性；与SEQ IDNO:225-256中任一者共享94％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享95％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享96％序列一致性；与SEQ IDNO:225-256中任一者共享97％序列一致性；与SEQ ID NO:225-256中任一者共享98％序列一致性；或与SEQ ID NO:225-256中任一者共享99％序列一致性。
用于本文所披露的以基于ShK的蛋白质为基础的储槽式调配物的基于毒素的治疗性蛋白质的变异体包括以下蛋白质，其与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享80％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享81％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享82％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享83％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享84％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享85％序列一致性；与SEQ IDNO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享86％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享87％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQID NO:257-260中任一者共享88％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享89％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享90％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享91％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享92％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享93％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享94％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享95％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享96％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享97％序列一致性；与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享98％序列一致性；或与SEQ ID NO:1-224和/或SEQ IDNO:257-260中任一者共享99％序列一致性。
具体示范性实施例包括基于毒素的治疗性蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ IDNO:208共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。在另一实施例中，变异体包括的蛋白质与SEQ ID NO:209共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。在另一实施例中，变异体包括的蛋白质与SEQ ID NO:217共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。在另一实施例中，变异体包括的蛋白质与SEQ ID NO:210共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。在另一实施例中，变异体包括的蛋白质与SEQ ID NO:218共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。在另一实施例中，变异体包括的蛋白质与SEQ ID NO:208共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。在另一实施例中，变异体包括的蛋白质与SEQ ID NO:257共用80％序列一致性、85％序列一致性、86％序列一致性、87％序列一致性、88％序列一致性、89％序列一致性、90％序列一致性、91％序列一致性、92％序列一致性、93％序列一致性、94％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性。
“序列一致性％”指的是如通过比较序列所测定的两个或更多个序列之间的关系。所属领域中，“一致性”还意味着如通过此类序列串之间的匹配测定的蛋白质序列之间的序列亲缘关系程度。“一致性”(通常称为“相似性”)容易通过已知方法计算：包括以下中所述的那些：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)(莱斯克A.M.(Lesk,A.M.)编.)牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(NY)(1988)；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)(史密斯D.W(Smith,D.W.)编)学术出版社(Academic Press),纽约(NY)(1994)；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部(格里芬A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬H.G.编)胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州(NJ)(1994)；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)(范海涅G.(Von Heijne,G.)编)学术出版社(1987)；以及序列分析引物(Sequence Analysis Primer)(格里布科夫M.(Gribskov,M.)和德弗罗J.(Devereux,J.)编)牛津大学出版社,纽约(1992)。测定序列一致性的优选方法设计成获得所测试序列之间的最佳匹配。在公开可用的计算机程序中编码用于测定序列一致性和相似性的方法。序列比对和一致性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算程序组(威斯康星麦迪逊的DNASTAR公司(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin))的Megalign程序进行。也可以使用Clustal比对法(希金斯和夏普CABIOS(Higgins and SharpCABIOS),5,151-153(1989)用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行序列的多序列比对。相关程序还包括GCG编程程序组(威斯康星套装9.0版(Wisconsin PackageVersion 9.0),遗传学计算机组(GCG),麦迪逊(Madison),威斯康星(Wisconsin))；BLASTP、BLASTN、BLASTX(阿尔丘尔(Altschul)等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410(1990)；DNASTAR(威斯康星麦迪逊的DNASTAR公司)；以及并入史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)的FASTA程序(皮尔逊(Pearson),计算机方法基因组研究(Comput.Methods Genome Res.),[国际学术会议(Proc.Int.Symp.)](1994),会议日期1992,111-20.编辑:舒豪伊(Suhai),桑德尔(Sandor).出版商:普雷纳姆(Plenum),纽约(New York),纽约(N.Y.)州。在本发明的情境内，应理解如果使用序列分析软件进行分析，那么分析结果是基于所提及程序的“默认值”。“默认值”意味着软件最初初始化时初始加载的值或参数的任何组。
“D-取代的类似物”包括本文所披露的基于毒素的治疗性蛋白质，其一或多个L-氨基酸经D-氨基酸取代。D-氨基酸可以是与蛋白质序列中存在的氨基酸相同的氨基酸类型或可以是不同氨基酸。因此，D-类似物也是变异体。
“修饰”包括本文所披露的基于毒素的治疗性蛋白质，其中一或多个氨基酸已置换成非氨基酸组分，或其中氨基酸已结合到官能团或官能团已另外与氨基酸或蛋白质关联。经修饰的氨基酸可以是例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法呢基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、结合到脂质部分的氨基酸、结合到人类血清白蛋白的氨基酸或结合到有机衍生剂的氨基酸。经修饰氨基酸的存在可以有利于例如(a)提高蛋白质血清半衰期和/或功能性体内半衰期，(b)降低蛋白质抗原性，(c)提高蛋白质储存稳定性，(d)提高蛋白质溶解度，(e)延长循环时间和/或(f)提高生物可用性，例如增加曲线下面积(AUCsc)。氨基酸可以例如在重组制造期间共转译或转移后修饰(例如在哺乳动物细胞中表达期间在N-X-S/T基元处N-连接的糖基化)或通过合成方式修饰。经修饰氨基酸可以在序列内或在序列末端。修饰可包括如本文其它地方所述的衍生物。
C端可以是基于毒素的治疗性蛋白质中每一种的羧酸基或酰胺基，优选羧酸基。本发明还涉及通过以下进一步修饰的基于毒素的治疗性蛋白质：(i)对C端添加，例如Tyr、碘-Tyr、荧光标签，或(ii)对N端添加，例如Tyr、碘-Tyr、焦谷氨酸酯基或荧光标签。
另外，可向C端和/或N端添加熟练技术人员已知提高稳定性的残基或残基群组。另外，可向C端和/或N端添加熟练技术人员已知提高口服可用性的残基或残基群组。
在具体实施例中，C端为酸(例如COOH)或酰胺(例如CONH2)。“酰胺”指的是在具体实施例中连接到蛋白质的C端的NH2。在多个实施例中，酸的C端羟基(OH)经酰胺取代。此类取代在本文使用术语术语“酰胺”命名或命名为C端氨基酸-NH2，如在“-Cys-NH2”中。
已研究多种治疗性蛋白质的安全性、效能和特异性，并且将蛋白质连接到具有阴离子型电荷的有机或无机化学实体已显示改良医药组合物的适用性。连接位点可以是N端，但修饰不限于这一位点处的连接。
适当化学实体的实例包括L-Pmp(OH2)；D-Pmp(OH2)；D-Pmp(OHEt)；Pmp(Et2)；D-Pmp(Et2)；L-Tyr；L-Tyr(PO3H2)(对-磷酸基-酪氨酸)；L-Phe(p-NH2)；L-Phe(p-CO2H)；L-天冬氨酸；D-天冬氨酸；L-谷氨酸；以及D-谷氨酸。所用缩写如下定义：Pmp(对-膦酰基甲基-苯丙氨酸)；和Ppa(对-磷脂酰-苯丙氨酸)。PmP和Ppa的替代包括Pfp(对-膦酰基(二氟-甲基)-苯丙氨酸)和Pkp(对-膦酰基-甲基酮基-苯丙氨酸)。
示范性化学实体可以通过以下方式连接：连接基团，例如氨基乙氧基乙氧基-乙酸连接基团(在本文中称为AEEAc)或通过任何其它适合方式。化学实体/连接基团组合的实例包括AEEAc-L-Pmp(OH2)；AEEAc-D-Pmp(OH2)；AEEAc-D-Pmp(OHEt)；AEEAc-L-Pmp(Et2)；AEEAc-D-Pmp(Et2)；AEEAc-L-Tyr；AEEAc-L-Tyr(PO3H2)；AEEAc-L-Phe(p-NH2)；AEEAc-L-Phe(p-CO2H)；AEEAc-L-天冬氨酸；AEEAc-D-天冬氨酸；AEEAc-L-谷氨酸；以及AEEAc-D-谷氨酸。在化学实体中，一般来说，如果氨基酸残基具有手性中心，那么可使用氨基酸残基的D和/或L对映异构体。
本文所披露的全部基于毒素的治疗性蛋白质可以通过AEEAc的N-端连接和/或C端处的酰胺连接(例如ShK-186(SEQ ID NO:217)和ShK-192(SEQ ID NO:218))修饰。当在形成过程中用于描述连接基团时，AEEAc可互换地指氨基乙氧基乙氧基乙酸和Fmoc-氨基乙氧基乙氧基乙酸。当用于指最终状态的特异性蛋白质中的连接基团时，术语指的是氨基乙氧基乙氧基乙酸。
本文所披露的全部基于毒素的治疗性蛋白质可以通过添加以下来修饰：聚乙二醇(PEG)、人类血清白蛋白、抗体、脂肪酸、包括Fab和Fc区的抗体片段、羟乙基淀粉、聚葡萄糖、低聚糖、聚唾液酸、玻尿酸、糊精、聚(2-乙基2-噁唑酮)、聚谷氨酸(PGA)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HPMA)、包括以下的氨基酸的非结构化亲水性序列：具体来说氨基酸Ala、Glu、Gly、Ser和Thr，以及如以下中所述的许多其它连接基团和添加：施密特S.R.(Schmidt,S.R.)(编),靶向生物药品的融合蛋白：应用和攻毒(FusionProtein Targeting for Biopharmaceuticals:Applications and Challenges),约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons):新泽西州霍博肯(Hoboken New Jersey),2013。PEG基团可以使用以下连接到赖氨酸的ε氨基：(a)PEG丁二酰亚胺基碳酸酯，(b)PEG苯并三唑碳酸酯，(c)PEG二氯三嗪，(d)PEG三氟乙磺酸酯，(e)PEG对-硝基苯基碳酸酯，(f)PEG三氯苯基碳酸酯，(g)PEG羰基咪唑，和(h)PEG丁二酰亚胺基丁二酸酯。PEG基团可以通过可降解连接基团(包括氨基甲酸苯甲酯的对或邻二硫化物)连接到半胱氨酸。定点引入PEG可以通过用PEG-醛还原性烷基化或通过在氰基硼氢化钠存在下α-氨基的甘油醛改性来实现。PEG化化学性质已在许多公开案中加以描述，包括罗伯特(Robert)等人,先进药物传递评论(Advanced Drug Delivery Reviews),54,459-476(2002)。低聚糖可以是N-连接或O-连接的。通过连接到Xxx为除脯氨酸以外的任何氨基酸的Asn-Xxx-Ser/Thr共同序列来制造细胞株，从而添加N-连接低聚糖(包括聚唾液酸)。O-连接的低聚糖连接到Ser或Thr。
具体实施例包括基于毒素的治疗性蛋白质SEQ ID NO:1-260，其通过AEEAc连接有具有阴离子型电荷的有机或无机化学实体。
基于毒素的治疗性蛋白质的另一实例为ShK-186的基于ShK的DOTA结合物(称为ShK-221)。“DOTA”指的是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸，其可以经氨基己酸连接到本文所披露的治疗性蛋白质的N端。DOTA结合提供针对螯合金属原子(例如铟或钆)的位点。可以结合到本文所披露的治疗性蛋白质的其它分子包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚胺二乙酸(IDA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N″-三乙酸(NOTA)和相关分子。
本发明进一步针对所披露基于毒素的治疗性蛋白质的衍生物。“衍生物”包括具有非周期排列的基于毒素的治疗性蛋白质，其中环排列保留原生蛋白质的原生桥连模式。在一个实施例中，环状基于毒素的治疗性蛋白质包括线性基于毒素的治疗性蛋白质和蛋白质连接基团，其中线性基于毒素的治疗性蛋白质的N端和C端经蛋白质连接基团连接形成酰胺环状蛋白质主链。在一些实施例中，蛋白质连接基团包括选自Gly、Ala以及其组合的氨基酸。
可以向本文所述的的基于毒素的治疗性蛋白质应用多种环化方法。本文所述的基于毒素的治疗性蛋白质容易使用BOC化学试剂环化以引入Ala、Gly或Ala/Gly桥，以及其组合或其它残基，如施纳则(Schnolzer)等人,国际肽和蛋白质研究杂志(Int J PeptProtein Res.),40,180-193(1992)所述。环状基于毒素的治疗性蛋白质可提高其稳定性、口服生物可用性，并且降低对蛋白分解的敏感性，而不影响基于毒素的治疗性蛋白质对其特异性目标的亲和力。
本文所披露的各基于毒素的治疗性蛋白质还可包括在任何位置添加、缺失、停止位置、取代、替代、结合、关联或排列，包括本文所披露的基于毒素的治疗性蛋白质序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60。因此，在具体实施例中，各基于毒素的治疗性蛋白质的各氨基酸位置可以是Xaa位置，其中Xaa表示在具体位置处氨基酸的添加、缺失、停止位置、取代、替代、结合、关联或排列。在具体实施例中，各基于毒素的治疗性蛋白质在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60的一或多者处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个Xaa位置。
基于毒素的治疗性蛋白质可具有超过一种改变(添加、缺失、停止位置、取代、替代、结合、关联或排列)并且作为变异体、D-取代类似物、羧基末端酰胺、修饰物和/或衍生物中的一或多者合适。也就是说，纳入一种类别的变异体、D-取代类似物、羧基末端酰胺、修饰物、和/或衍生物并不排除纳入其它类别并且在本文全部统称为“基于毒素的治疗性蛋白质”。一个实例包括SEQ ID NO:1，其中位置21处的氨基酸为Nle和/或位置22处的氨基酸置换成二氨基丙酸。
在位置21为Met的任何蛋白质中，Met可以经取代以赋予针对氧化的稳定作用。在一个实施例中，位置21处的Met经Nle取代。在位置21处具有Met的SEQ ID NO:1-256中的任一者中，这一Met可以经Nle取代。在位置22处具有Lys的SEQ ID NO:1-256中的任一者中，这一Lys可以经二氨基丙酸取代。因此，本文所披露的一个实施例包括SEQ ID NO:1，其中位置21处的Met经Nle取代，酰胺存在于C端和/或阴离子型部分存在于N端。
“非官能性氨基酸残基”指的是D-或L-形式的氨基酸残基，其具有缺乏酸性、碱性或芳香族基团的侧链。示范性非官能性氨基酸残基包括Meg、Gly、Ala、Val、Ile、Leu和Nle。
在本文所披露的具体实施例中，治疗性蛋白质具有至少20个氨基酸、至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸、至少25个氨基酸、至少26个氨基酸、至少27个氨基酸、至少28个氨基酸、至少29个氨基酸、至少30个氨基酸、至少31个氨基酸、至少32个氨基酸、至少33个氨基酸、至少34个氨基酸、至少35个氨基酸、至少36个氨基酸、至少37个氨基酸、至少38个氨基酸、至少39个氨基酸、至少40个氨基酸、至少41个氨基酸、至少42个氨基酸、至少43个氨基酸、至少44个氨基酸、至少45个氨基酸、至少46个氨基酸、至少47个氨基酸、至少48个氨基酸、至少49个氨基酸、至少50个氨基酸、至少51个氨基酸、至少52个氨基酸、至少53个氨基酸、至少54个氨基酸、至少55个氨基酸、至少56个氨基酸、至少57个氨基酸、至少58个氨基酸、至少59个氨基酸、至少60个氨基酸、至少61个氨基酸、至少62个氨基酸、至少63个氨基酸、至少64个氨基酸、至少65个氨基酸、至少66个氨基酸、至少67个氨基酸、至少68个氨基酸、至少69个氨基酸、至少70个氨基酸、至少71个氨基酸、至少72个氨基酸、至少73个氨基酸、至少74个氨基酸、至少75个氨基酸、至少76个氨基酸、至少77个氨基酸、至少78个氨基酸、至少79个氨基酸或至少80个氨基酸。
在额外实施例中，治疗性蛋白质具有20个氨基酸、21个氨基酸、22个氨基酸、23个氨基酸、24个氨基酸、25个氨基酸、26个氨基酸、27个氨基酸、28个氨基酸、29个氨基酸、30个氨基酸、31个氨基酸、32个氨基酸、33个氨基酸、34个氨基酸、35个氨基酸、36个氨基酸、37个氨基酸、38个氨基酸、39个氨基酸、40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸、70个氨基酸、71个氨基酸、72个氨基酸、73个氨基酸、74个氨基酸、75个氨基酸、76个氨基酸、77个氨基酸、78个氨基酸、79个氨基酸或80个氨基酸。
在本文所披露的额外实施例中，治疗性蛋白质具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键、至少三个二硫桥键、至少四个二硫桥键或至少五个二硫桥键。
在额外实施例中，治疗性蛋白质具有一个二硫桥键、两个二硫桥键、三个二硫桥键、四个二硫桥键或五个二硫桥键。
治疗性蛋白质还适用于本文所披露的储槽式调配物中，包括分子量介于500和50,000道尔顿之间的那些。
具体来说，相关治疗性蛋白质包括对例如Na+、K+或Ca2+通道的阳离子通道、例如Cl-通道的阴离子通道或例如烟碱乙酰基胆碱受体(NAChR)的配位体门控性通道起作用的那些。这些通道包括胞外和/或胞内存在的配位体和电压门控性离子通道。胞外通道或受体包括kanate；α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和乙酰胆碱受体(例如α9/α10亚型(nAChR))；血清素(5-羟色胺，5-HT)受体；以及甘氨酸和γ-丁酸(GABA)受体。胞内受体可包括环状AMP(cAMP)、环状GMP(cGMP)、Ca2+以及G-蛋白受体。
适用于本文所披露的储槽式调配物的治疗性蛋白质的具体实例包括靶向电压门控性通道的毒素蛋白质，包括ShK蛋白质。示范性电压门控性通道包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7、Kv2.1、Kv3.1、Kv3.2、Kv11.1、Kc1.1、Kc2.1、Kc3.1、Nav1.2、Nav1.4以及Cav1.2通道。
还可以使用本文所述的治疗性蛋白质的前药。术语“前药”指的是在受试者体内可发生生物转化(例如自发或酶促)以释放或转化(例如酶促、机械、电磁等)蛋白质的一或多种活性形式的治疗性蛋白质。前药可用于克服与稳定性、毒性、缺乏特异性或生物可用性有限有关的问题。示范性前药包括活性蛋白质和化学掩蔽基团(例如可逆地抑制蛋白质活性的基团)。一些优选前药为序列在代谢条件下可裂解的蛋白质的变异体或修饰物。示范性前药在发生生物化学转型(例如磷酸化、氢化、脱氢、糖基化等)时在体内或体外变得具有活性或更具活性。前药通常提供溶解度、组织相容性或延时释放的优势(参看例如邦德高(Bundgard),前药设计(Design of Prodrugs),第7-9页,第21-24页,埃尔塞维尔(Elsevier),阿姆斯特丹(Amsterdam)(1985)；以及西尔弗曼(Silverman),药物设计和药物作用的有机化学方法(The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action),第352-401页,学术出版社(Academic Press),圣地亚哥(San Diego),加利福尼亚州(CA)(1992))。
因为水溶性种类的上述治疗性蛋白质当投予到基于水的媒剂中时时发生初始爆发，所以适宜使用此类水溶性种类的本文所披露的基于PLG的储槽式调配物。此类蛋白质的辛醇-水分配系数(Kow)为1或更低，但大于0.1。蛋白质可以调配成盐形式，当分子具有例如氨基残基的碱性基团时尤其如此。盐形式可以是酸(例如盐酸、硫酸、硝酸)和有机酸(例如碳酸和丁二酸)的加成物。
本文所披露的储槽式调配物使用的治疗性蛋白质还可以经分子工程改造以显示稳固酸稳定性。具体来说，可以进行C端酰胺化(不可氧化的Nle取代)和/或N端处的不可水解的L-磷酸酪氨酸取代以根据其在储槽式调配物中将经受的酸性微环境和生理环境调适治疗性蛋白质。
治疗性蛋白质的适当量取决于蛋白质种类，但以储槽式调配物中所用的可生物降解聚合物的组成计，一般降到0.001重量％到90重量％范围内。额外实施例包括0.002重量％、0.003重量％、0.004重量％、0.005重量％、0.006重量％、0.007重量％、0.008重量％、0.009重量％、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％或10重量％。
形成储槽式调配物的方法.关于制造本文所披露的储槽式调配物的实例的方法，可采用用于包覆治疗性蛋白质的任何已知微囊封程序，包括水中干燥法、喷雾干燥法、凝聚法或其等效方法。
在具体实施例中，水溶性或可分散性治疗性蛋白质可以与赋形剂(例如盐、缓冲剂、多元醇、糖、氨基酸、表面活性剂、稳定剂)和释放改性剂组合并且与聚合物和溶剂混合形成多相系统，所述系统可通过均质化、喷雾干燥、凝聚、超声波处理和/或微流体化机械地转化成微乳液。这一初级水/油(w/o)乳液接着可添加到包括例如表面活性剂的稳定剂和缓冲剂的水性连续相中，并且进一步分散形成具有聚合物粒子的水包油包水(w/o/w)乳液，所述乳液通过溶剂蒸发损失和搅拌/混合而随时间硬化或熟化。
水性悬浮液可以通过使用例如离心分离的方法进一步浓缩以增浓较高密度相(主要聚合物粒子)，随后去除上部(澄清或略混浊)溶液层达到适当最终体积，实现所要浓度。这一方法还可以用于使外部水相呈所要pH、容积渗透浓度、离子强度和缓冲剂组成。以类似方式，悬浮液可进一步稀释成包括生理食盐水、磷酸盐缓冲盐水、糖溶液、盐、缓冲剂和其它赋形剂的水性组合物以实现所要浓度(固体重量百分比、pH、容积渗透浓度或总药物剂量)或稀释到赋形剂中用于冷冻-干燥(冻干)步骤或额外处理。
如以下实例中进一步描述，治疗性蛋白质可以在水中溶解达到最终所要浓度并且和缓冲剂盐和包括表面活性剂的赋形剂一起溶解。完全w/o乳液可以倒入培养基瓶中；向瓶中装入20mL 0.5％DSS、20mM磷酸盐pH 7.0、0.05％PVA水溶液。混合物可以用剪切设置(26,000转/分钟(rpm))均质化5分钟，使瓶与熔融的冰(0℃)热接触。产生剂探针可以保持浸没以限制液体发泡和溢出。乳液将变成乳白色(类似于1％牛奶)。可以测试pH并且根据需要调整到范围5<pH<7.5中。可以从剪切去除调配物并且松散地盖盖子以减缓蒸发，并且在室温下在通风橱中搅拌隔夜以使溶剂蒸发(二氯甲烷)。可接着通过筛网过滤调配物。乳液可以储存于室温下，温和的上下颠倒混合以避免沉降/结块。或者，溶液可以储存在4℃或为了较长存放稳定性而冻干。所属领域普通技术人员已知许多适当冻干技术。
使用方法.本文所披露的方法包括用本文所披露的储槽式调配物治疗受试者(人类、兽医学动物(犬、猫、爬虫、鸟类等)、家畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)和研究动物(猴、大鼠、小鼠、鱼等))以实现治疗性蛋白质、其盐或前药的持续释放。持续释放可向受试者传递治疗有效量的治疗性蛋白质、其盐或前药。治疗有效量包括提供有效量或有效含量(事先定义)的那些量。
“有效量”为在受试者体内产生所要生理学改变所必需的治疗性蛋白质的量。通常为研究目的投予有效量。本文所披露的有效量减少、控制或消除免疫系统病症的存在或活性和/或减轻、控制或消除免疫系统病症的非所要副作用。
“防治性治疗”包括向不展现免疫系统病症的病征或症状或仅展现免疫系统病症的早期病征或症状的受试者投予的治疗，使得治疗是为了减少、预防或降低免疫系统病症进一步发展的风险而投予。因此，防治性治疗充当针对免疫系统病症的预防性治疗。
“治疗性治疗”包括向展现免疫系统病症的症状或病征的受试者投予的治疗并且为了减少或消除免疫系统病症的那些病征或症状而向受试者投予。治疗性治疗可减轻、控制或消除免疫系统病症的存在或活性，和/或减轻、控制或消除免疫系统病症的副作用。
在具体实施例中，本文所披露的治疗性蛋白质调配成用于治疗性治疗免疫系统病症或病状(包括自体免疫疾病)的储槽式调配物。在某些实施例中，自体免疫疾病或病状为牛皮癣、牛皮癣性关节炎、多发性硬化症、IPEX、全身性红斑性狼疮症、狼疮肾炎、I型糖尿病、II型糖尿病、艾迪森氏病(Addison's disease)、乳糜泻、皮肌炎、葛瑞夫兹氏病(Graves'disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌无力、恶性贫血、类风湿性关节炎、伴有多血管炎的肉芽肿病(韦格纳病(Wegener's disease))、抗嗜中性白细胞细胞质自体抗体(ANCA)血管炎、发炎性肠病、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、过敏、哮喘、异位性皮炎、移植物抗宿主疾病、组织或器官移植、心血管疾病、血管炎、小血管炎、巨细胞动脉炎、葡萄膜炎、白塞氏综合症(Behcet's syndrome)、非酒精性脂肪肝病(包括NASH)、自体免疫性肝病或休格连综合症(Sjogren syndrome)。
在一示范性实施例中，免疫系统疾病为牛皮癣。可以使用包括以下的参数评估治疗的影响：斑块体表面积受累(BSA％)、牛皮癣区域和严重程度指数(PASI)组分和研究员牛皮癣整体评定(IGA，5点等级)、患者牛皮癣整体评定、皮肤病生活质量指数(DLQI)以及牛皮癣失能指数(PDI)。治疗对牛皮癣斑块的影响可以通过使用包括以下的方法对注射后15天、30天或更多天取的生物检体进行评估来测定：由病理学家对斑块组织病理学进行H&E染色和评估；促炎性细胞因子的qPCR的基因表达，包括：IFNγ、TNFα、iNOS、IL-4、8、10、17A、17F、17A/F、20、21、22、23、CCL20、牛皮癣素、K16和其它细胞激素；细胞活化/群体(KRT16和Ki67)的免疫组织化学表征；和/或测量单核细胞浸润(CD3、HLA-DR、CD11c+、CD68、CD163、Kv1.3)。
在另一实施例中，可以使用所属领域中已知的技术通过测量的参数评估疾病期间对全身性自体免疫/发炎状态的作用，包括：测量血浆/血清生物标记物，包括IL-17A、IL-17F、IL-17A/F和其它细胞激素/趋化因子；全血总RNA中的基因表达；和/或分析周边血液单核细胞群体(CD4+T细胞：原生中央记忆体或效应记忆T细胞；CD8+T细胞：原生中央记忆体或效应记忆T细胞；调节T细胞)。
对于投予，可以基于体外分析法和/或动物模型研究的结果初始地估算“治疗有效量”(在本文中也称为剂量)。这类信息可以用于更准确地判定适用于所关注受试者的剂量。
储槽式调配物中治疗性蛋白质的量和浓度以及向受试者投予的储槽式调配物的量可以由医生、兽医或研究人员基于临床上相关因素、储槽式调配物中的治疗性蛋白质的溶解度、治疗性蛋白质的效能和活性以及储槽式调配物投予方式来选择。可以向受试者投予包括治疗有效量的本文所披露的治疗性蛋白质或其医药学上可接受的盐或前药的储槽式调配物以临床上安全和有效的方式(包括一或多次独立投予储槽式调配物)治疗自体免疫疾病。在其它考虑因素中，每次投予剂量的量和投予的总量还可以取决于受试者(包括目标)的身体、生理学和心理因素、体重、病状严重程度、自体免疫疾病类型、事先或同时发生的治疗性干预、受试者的自发病以及投予途径。
适用剂量通常在0.1到40,000μg/kg或0.5到1μg/kg范围内。在其它实例中，适用剂量通常可在0.1到1μg/kg、0.1到10μg/kg、0.1到100μg/kg、0.1到1,000μg/kg、0.1到10,000μg/kg、0.1到20,000μg/kg、1到10μg/kg、1到100μg/kg、1到1,000μg/kg、1到10,000μg/kg、1到20,000μg/kg、1到30,000μg/kg、10到100μg/kg、10到1,000μg/kg、10到10,000μg/kg、10到20,000μg/kg、10到30,000μg/kg、100到1,000μg/kg、100到10,000μg/kg、100到20,000μg/kg、100到30,000μg/kg、1,000到10,000μg/kg、1,000到20,000μg/kg、1,000到30,000μg/kg、10,000到20,000μg/kg、10,000到30,000μg/kg或20,000到30,000μg/kg范围内。在其它实例中，剂量可包括0.1μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μg/kg、900μg/kg、950μg/kg、1,000μg/kg、1,500μg/kg、2,000μg/kg、2,500μg/kg、3,000μg/kg、3,500μg/kg、4,000μg/kg、4,500μg/kg、5,000μg/kg、5,500μg/kg、6,000μg/kg、6,500μg/kg、7,000μg/kg、7,500μg/kg、8,000μg/kg、8,500μg/kg、9,000μg/kg、9,500μg/kg、10,000μg/kg、10,500μg/kg、11,000μg/kg、11,500μg/kg、12,000μg/kg、12,500μg/kg、13,000μg/kg、13,500μg/kg、14,000μg/kg、14,500μg/kg、15,000μg/kg、15,500μg/kg、16,000μg/kg、16,500μg/kg、17,000μg/kg、17,500μg/kg、18,000μg/kg、18,500μg/kg、19,000μg/kg、19,500μg/kg、20,000μg/kg、20,500μg/kg、21,000μg/kg、21,500μg/kg、22,000μg/kg、22,500μg/kg、23,000μg/kg、23,500μg/kg、24,000μg/kg、24,500μg/kg、25,000μg/kg、25,500μg/kg、26,000μg/kg、26,500μg/kg、27,000μg/kg、27,500μg/kg、28,000μg/kg、28,500μg/kg、29,000μg/kg、29,500μg/kg、30,000μg/kg、30,500μg/kg、31,000μg/kg、31,500μg/kg、32,000μg/kg、32,500μg/kg、33,000μg/kg、33,500μg/kg、34,000μg/kg、34,500μg/kg、35,000μg/kg、35,500μg/kg、36,000μg/kg、36,500μg/kg、37,000μg/kg、37,500μg/kg、38,000μg/kg、38,500μg/kg、39,000μg/kg、39,500μg/kg或40,000μg/kg。
在其它实例中剂量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg或更高。
可以通过在治疗方案的时程期间投予单次或多次剂量(例如每周、每2周、每3周、每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年)实现治疗有效量。在具体实施例中，仅需要单次投予。在额外实施例中，每30天或每60天提供投予。
关于本文所披露的储槽式调配物的适当使用方法的额外信息见于国际专利申请案第PCT/US2014/020771号和第PCT/US2014/047691号，以及美国专利申请案第14/124,669号中。
储槽式调配物可以通过任何适当途径投予，包括注射；非经肠注射；滴注；或通过细针用注射植入到软组织、体腔或偶尔植入到血管中。
实例.包括以下实例以展示本发明的具体实施例。所属领域普通技术人员鉴于本发明应了解可以对本文所披露的具体实施例作出许多改变并且仍获得同样或类似结果而不脱离本发明的精神和范围。
1.一种储槽式调配物，其包括：(i)包括治疗性蛋白质的内部水相，所述治疗性蛋白质以所述储槽式调配物的0.025重量％到5重量％存在；(ii)基于聚合物的固体/油相；以及(iii)分散有粒子的外部水相，所述外部水相包括以所述储槽式调配物的0.01重量％到1重量％的表面活性剂，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
2.实施例1的储槽式调配物，其中所述聚合物选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(丙交酯-共-乙交酯-接枝PEG)或其掺合物或共聚物。
3.实施例1或2的储槽式调配物，其中所述聚合物是丙交酯:乙交酯比率为1:1的聚(丙交酯-共-乙交酯)。
4.实施例1、2或3中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质以所述储槽式调配物的0.025重量％；以所述储槽式调配物的0.25重量％；或以所述储槽式调配物2.5重量％存在。
5.实施例1、2、3或4中任一项的储槽式调配物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯、聚(乙二醇)、环氧乙烷-环氧丙烷(PEO-PPO)掺合物、泊洛沙姆、二辛基-磺基丁二酸酯、聚(乙烯醇)(PVA)、PVP或其组合。
6.实施例1、2、3、4或5中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少20个氨基酸、至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸、至少25个氨基酸、至少26个氨基酸、至少27个氨基酸、至少28个氨基酸、至少29个氨基酸、至少30个氨基酸、至少31个氨基酸、至少32个氨基酸、至少33个氨基酸、至少34个氨基酸、至少35个氨基酸、至少36个氨基酸、至少37个氨基酸、至少38个氨基酸、至少39个氨基酸、至少40个氨基酸、至少41个氨基酸、至少42个氨基酸、至少43个氨基酸、至少44个氨基酸、至少45个氨基酸、至少46个氨基酸、至少47个氨基酸、至少48个氨基酸、至少49个氨基酸、至少50个氨基酸、至少51个氨基酸、至少52个氨基酸、至少53个氨基酸、至少54个氨基酸或至少55个氨基酸。
7.实施例1、2、3、4或5中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有20个氨基酸、21个氨基酸、22个氨基酸、23个氨基酸、24个氨基酸、25个氨基酸、26个氨基酸、27个氨基酸、28个氨基酸、29个氨基酸、30个氨基酸、31个氨基酸、32个氨基酸、33个氨基酸、34个氨基酸、35个氨基酸、36个氨基酸、37个氨基酸、38个氨基酸、39个氨基酸、40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸或55个氨基酸。
8.实施例1、2、3、4、5、6或7中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键、至少三个二硫桥键、至少四个二硫桥键或至少五个二硫桥键。
9.实施例1、2、3、4、5、6或7中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有一个二硫桥键、两个二硫桥键、三个二硫桥键、四个二硫桥键或五个二硫桥键。
10.实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为基于毒素的治疗性蛋白质。
11.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为基于ShK的蛋白质。
12.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质是抑制电压门控性钾通道的基于ShK的蛋白质。
13.实施例12的储槽式调配物，其中所述抑制的电压门控性钾通道为Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv1.3/1.5、Kv1.6、Kv3.2或KCa3.1通道中的一或多者。
14.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有SEQ ID NO:1-260中任一者的序列。
15.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有SEQ ID NO:1-224或SEQ ID NO:257-260中任一者的序列。
16.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为以下中的一或多个：SEQ ID NO:208、SEQ IDNO:217、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:218、SEQ IDNO:221、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:260或其盐。
17.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218。
18.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15或16中任一项的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:210。
19.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一项的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少40天、在单次投予后持续释放至少41天、在单次投予后持续释放至少42天、在单次投予后持续释放至少43天、在单次投予后持续释放至少44天、在单次投予后持续释放至少45天、在单次投予后持续释放至少46天、在单次投予后持续释放至少47天、在单次投予后持续释放至少48天、在单次投予后持续释放至少49天、在单次投予后持续释放至少50天、在单次投予后持续释放至少51天、在单次投予后持续释放至少52天、在单次投予后持续释放至少53天、在单次投予后持续释放至少54天、在单次投予后持续释放至少55天或在单次投予后持续释放至少56天。
20.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一项的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质40天、在单次投予后持续释放41天、在单次投予后持续释放42天、在单次投予后持续释放43天、在单次投予后持续释放44天、在单次投予后持续释放45天、在单次投予后持续释放46天、在单次投予后持续释放47天、在单次投予后持续释放48天、在单次投予后持续释放49天、在单次投予后持续释放50天、在单次投予后持续释放51天、在单次投予后持续释放52天、在单次投予后持续释放53天、在单次投予后持续释放54天、在单次投予后持续释放55天或在单次投予后持续释放56天。
21.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一项的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少两个月。
22.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一项的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质两个月。
23.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或21中任一项的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少三个月。
24.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一项的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质三个月。
25.一种冻干储槽式调配物，其包括：(i)基于聚合物的外部固体/油相，其包括以所述冻干储槽式调配物计0.025重量％到5重量％分散于其中的治疗性蛋白质；(ii)以所述冻干储槽式调配物计0.01重量％到0.5重量％表面活性剂；以及(iii)以所述冻干储槽式调配物计0.5重量％到90重量％糖，其中在所述冻干储槽式调配物复原后，所述复原的储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
26.实施例25的冻干储槽式调配物，其中所述糖为蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖或其组合。
27.实施例25或26的冻干储槽式调配物，其中所述糖为蔗糖。
28.实施例25、26或27中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述聚合物选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(丙交酯-共-乙交酯-接枝PEG)或其掺合物或共聚物。
29.实施例25、26、27或28中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述聚合物是丙交酯:乙交酯比率为1:1的聚(丙交酯-共-乙交酯)。
30.实施例25、26、27、28或29中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质以所述冻干储槽式调配物的0.025重量％；以所述冻干储槽式调配物的0.25重量％；或以所述冻干储槽式调配物的2.5重量％存在。
31.实施例25、26、27、28、29或30中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯、聚(乙二醇)、环氧乙烷-环氧丙烷掺合物、泊洛沙姆、 二辛基-磺基丁二酸盐、PVA、PVP或其组合。
32.实施例25、26、27、28、29、30或31中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少20个氨基酸、至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸、至少25个氨基酸、至少26个氨基酸、至少27个氨基酸、至少28个氨基酸、至少29个氨基酸、至少30个氨基酸、至少31个氨基酸、至少32个氨基酸、至少33个氨基酸、至少34个氨基酸、至少35个氨基酸、至少36个氨基酸、至少37个氨基酸、至少38个氨基酸、至少39个氨基酸、至少40个氨基酸、至少41个氨基酸、至少42个氨基酸、至少43个氨基酸、至少44个氨基酸、至少45个氨基酸、至少46个氨基酸、至少47个氨基酸、至少48个氨基酸、至少49个氨基酸、至少50个氨基酸、至少51个氨基酸、至少52个氨基酸、至少53个氨基酸、至少54个氨基酸或至少55个氨基酸。
33.实施例25、26、27、28、29、30或31中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有20个氨基酸、21个氨基酸、22个氨基酸、23个氨基酸、24个氨基酸、25个氨基酸、26个氨基酸、27个氨基酸、28个氨基酸、29个氨基酸、30个氨基酸、31个氨基酸、32个氨基酸、33个氨基酸、34个氨基酸、35个氨基酸、36个氨基酸、37个氨基酸、38个氨基酸、39个氨基酸、40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸或55个氨基酸。
34.实施例25、26、27、28、29、30、31、32或33中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键、至少三个二硫桥键、至少四个二硫桥键或至少五个二硫桥键。
35.实施例25、26、27、28、29、30、31、32或33中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有一个二硫桥键、两个二硫桥键、三个二硫桥键、四个二硫桥键或五个二硫桥键。
36.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为基于毒素的治疗性蛋白质。
37.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为基于ShK的蛋白质。
38.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为抑制电压门控性钾通道的基于ShK的蛋白质。
39.实施例38的冻干储槽式调配物，其中所述抑制的电压门控性钾通道为Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv1.3/1.5、Kv1.6、Kv3.2或KCa3.1通道。
40.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有SEQ ID NO:1-260中任一者的序列。
41.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有SEQ ID NO:1-224或SEQ IDNO:257-260中任一者的序列。
42.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:208、SEQ IDNO:217、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:218、SEQ IDNO:221或其盐。
43.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述复原的储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少40天、在单次投予后持续释放至少41天、在单次投予后持续释放至少42天、在单次投予后持续释放至少43天、在单次投予后持续释放至少44天、在单次投予后持续释放至少45天、在单次投予后持续释放至少46天、在单次投予后持续释放至少47天、在单次投予后持续释放至少48天、在单次投予后持续释放至少49天、在单次投予后持续释放至少50天、在单次投予后持续释放至少51天、在单次投予后持续释放至少52天、在单次投予后持续释放至少53天、在单次投予后持续释放至少54天、在单次投予后持续释放至少55天或在单次投予后持续释放至少56天。
44.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述复原储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质40天、在单次投予后持续释放41天、在单次投予后持续释放42天、在单次投予后持续释放43天、在单次投予后持续释放44天、在单次投予后持续释放45天、在单次投予后持续释放46天、在单次投予后持续释放47天、在单次投予后持续释放48天、在单次投予后持续释放49天、在单次投予后持续释放50天、在单次投予后持续释放51天、在单次投予后持续释放52天、在单次投予后持续释放53天、在单次投予后持续释放54天、在单次投予后持续释放55天或在单次投予后持续释放56天。
45.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述复原储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少两个月。
46.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述复原储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质两个月。
47.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或45中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述复原储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少三个月。
48.实施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中任一项的冻干储槽式调配物，其中所述复原储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质三个月。
49.一种治疗患有自体免疫疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者投予治疗有效量的实施例1到48中任一项的储槽式调配物，由此治疗所述受试者。
50.一种治疗患有自体免疫疾病的受试者的方法，其包括投予治疗有效量的储槽式调配物，所述储槽式调配物包括以所述储槽式调配物的0.0.25重量％到5重量％存在的分散有Kv1.3通道抑制剂蛋白质的生物相容性聚合物，和以所述储槽式调配物的0.1重量％到1重量％存在的表面活性剂，其中所述储槽式调配物不含改变Kv1.3通道抑制剂蛋白质的释放速率的额外成分，由此治疗所述受试者。
51.实施例49或50的方法，其中所述自体免疫疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、狼疮、狼疮肾炎、器官移植排斥反应、葡萄膜炎、干眼病或自体免疫性肠病。
52.实施例49、50或51中任一项的方法，其中所述投予通过注射进行。
53.实施例52的方法，其中所述注射为单次注射。
54.一种储槽式调配物，其包括：(i)以所述储槽式调配物的1.2重量％存在的基于毒素的治疗性蛋白质；(ii)PLG1A、PLG2A、PLG3A、PLG5E或PLG7E聚合物；以及(iii)以所述储槽式调配物的0.1重量％存在的PVA表面活性剂，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
55.一种储槽式调配物，其包括：包括基于毒素的治疗性蛋白质的内部水相，所述基于毒素的治疗性蛋白质以所述储槽式调配物的1.2重量％存在，以及一或多种缓冲剂，包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或其组合，其中所述内部水相的pH为5.0-8.5；(ii)基于PLG1A、2A、3A、5E或7E聚合物的固体/油相；以及(iii)包括以所述储槽式调配物的0.01-0.10重量％存在的PVA表面活性剂的外部水相，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
56.一种储槽式调配物，包括：(i)以所述储槽式调配物的1.2重量％存在的SEQ IDNO:1到260的基于毒素的治疗性蛋白质；(ii)PLG1A、2A、3A、5E或7E聚合物；以及(iii)以所述储槽式调配物的0.01-0.1重量％存在的PVA表面活性剂，其中在单次投予后所述储槽式调配物在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
57.一种储槽式调配物，其包括：(i)内部水相，其包括以所述储槽式调配物的1.2重量％存在的SEQ ID NO:1-260的基于毒素的治疗性蛋白质；一或多种缓冲剂，包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或其组合；以及一或多种盐，包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、(NH4)2CO3或其组合，其中所述内部水相的pH为5.0-8.5；(ii)基于PLG1A、2A、3A、5E或7E聚合物的固体/油相；以及(iii)外部水相，其包括以所述储槽式调配物的0.01-0.1重量％存在的PVA表面活性剂，其中所述储槽式调配物在单次投予后持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
58.一种在受试者体内获得治疗性肽的持续释放的方法，其包含向所述受试者投予实施例1到48或54到57中任一项所述的储槽式调配物，由此获得所述治疗性肽在所述受试者体内的持续释放。
59.实施例58的方法，其中所述持续释放通过以下证明：(1)在单次投予后在有效含量内释放至少一个月；(2)在单次投予后在Cmax比C平均比率不超过5或不超过3的有效含量内释放至少一个月；(3)在单次投予后在有效含量内释放至少56天；和/或(4)在单次投予后在Cmax比C平均比率不超过5或不超过3的有效含量内释放至少56天。
实例1.制备治疗性蛋白质的储槽式调配物.聚合物、溶剂、水相、缓冲剂、赋形剂和共溶剂的重量/体积和比例如下：将1.0g聚合物溶解于5.0mL二氯甲烷中。接着添加0.5mL含100mg/mL ShK-186(或ShK-192)的20mM磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS；pH6.0)。使用10×195mm探针在20,000rpm下将初级乳液均质化2分钟。接着将初级乳液添加到20mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)、0.5％二辛基磺基丁二酸酯(DDS)和0.05％PVA的水溶液中；并且使用20×195mm探针在26,000rpm下均质化2分钟。向二次乳液中添加搅拌棒并且在通风橱中搅拌悬浮液隔夜以使挥发性溶剂蒸发。第二天，通过325网筛过滤悬浮液。将过滤的材料离心(20,000g，5分钟)并且抽出清液层，并且通过包括高效液相色谱(HPLC)和针对蛋白质(ShK-186或ShK-192)含量的二喹啉甲酸(BCA)的方法分析以测定封装效率。
选择用于制备这一实例中评定的不同储槽式调配物的聚合物包括低分子量(MW)PLG，例如PLG1A；中等MW PLG，例如PLG2A；以及高MW PLG，例如PLG3A，其全部为亲水性羧基封端的(H系列)。测试的额外聚合物是PLG5E和PLG7E，它们都是酯化的(E系列)。这一实例中所用的聚合物购自湖岸生物材料(Lakeshore Biomaterials)。
实例2.测量治疗性蛋白质从持续释放的储槽式调配物的封装、质量平衡和体外释放.通常在紧接储槽式调配物之后，通过在分离法(例如离心)之后并且使用等式(1)分析清液层的游离蛋白质含量来测量封装百分比：
封装％＝(总ShK-清液层ShK)/总ShK
典型封装效率在60到90％范围内。
通过加热超过聚合物的玻璃态转变温度对系统加压以几乎完全释放ShK蛋白质，添加表面活性剂物质(例如浓SDDS)，机械搅拌，超声波处理，碱或酸水解，或这些加速释放方法的多种组合来实现质量平衡。可以通过在多个时间和不同条件下取样清液层并且应用等式(2)获得典型体外释放曲线：
释放％＝清液层ShK/总ShK
为了测量体外释放，将溶液置换成去离子水、2w/v％表面活性剂SDDS(水溶液)、1×PBS和20mM磷酸盐缓冲液(pH 7)。在轨道运动振动台上搅拌不同样品并且保持于37℃的温度下。通过在不同时间(通常t＝0天到t＝15天)抽取的清液层BCA或逆相(RP)-HPLC分析测量蛋白质随时间的释放。
图1示出了五种不同储槽式调配物的ShK-186的体外释放。调配物如实例1中所述使用一定范围的PLG制成，所述PLG具有不同分子量和封端化学性质。结果显示末端(封端)基团对调节长期释放的作用，这可能由于与治疗性蛋白质的相互作用。这类测量的差示和绝对特征可帮助形成体外/体内相关性作为针对产品质量控制的调配物特性的功能测试。在这一情形下，相较于从基于羧基封端的聚合物(PLG1A、2A和3A)观测的释放，体外可见治疗性蛋白质从使用酯封端聚合物PLG5E和PLG7E制成的调配物的更快速初始释放。
实例3.储槽式调配物物理特性的表征.采用标准分析型表征方法来分析本文所披露的ShK-186的储槽式调配物的物理和化学特性并且根据实例1的方法使用PLG2A聚合物形成。使用马尔文纳米分粒器(Malvern nanosizer)通过光散射测量尺寸和电泳迁移率。通过光学显微镜测量形态/均匀性。结果显示于图2-4中。
图2A和2B显示如通过动态光散射所测量的三个独立批次的储槽式调配物的分散液尺寸。图2A和2B显示通过如通过动态光散射所测量的调配物悬浮液的强度(图2A)和按体积计(图2B)绘制的储槽式调配物的尺寸分布。
图3为储槽式调配物的ζ电位(如通过电泳迁移率所测量的粒子表面电荷)的测量值。阴离子表面层帮助赋予水性悬浮液中的分散稳定性。ζ电位测量值显示电荷为-75、-72和-72mV的阴离子粒子的类似紧凑簇，提供通过静电排斥有助于胶体稳定性的库仑相互作用。
图4为显示PLG调配物的形状和大致均匀几何尺寸的储槽式调配物的光学显微镜图像。所述图显示PLG调配物囊封ShK-186的光学显微(100×)图像，显示具有一微米尺寸的圆形(可能球形)粒子。
总体而言，本实例证实这一实例中所述的储槽式调配物的平均尺寸为1微米(图4)，如电泳迁移率所测量球体的表面/界面边界的净电荷为-75mV--72mV(图3)指示胶体稳定性，并且调配物显示均匀球形几何结构(图4)。
实例4.体内评估储槽式调配物.遵照以下方法制备这一实例中所述的储槽式调配物。在低速搅拌下，将1.0g PLG聚合物(1A、2A或3A)溶解于5.0mL二氯甲烷中，直到聚合物在10mL烧杯中完全溶解。添加500μL ShK-186(在具有140mM NaCl的20mM磷酸钠水性缓冲液(pH 6.0)中，获得20mg/mL蛋白质的最终浓度)并且使用10×195mm探针在26,000rpm下均质化2分钟。将全部w/o乳液倒入100mL(康宁公司(Corning,Inc.),康宁(Corning),纽约(New York))1395培养瓶中，所述培养瓶中装有20mL 0.5重量％DSS、20mM磷酸盐(pH 7.0)和0.05重量％PVA水溶液。
使混合物在相同剪切设置(26,000rpm)下均质化5分钟，使烧杯与熔融冰(0℃)热接触。产生剂探针保持完全浸没在液体中以限制材料发泡和溢出。乳液由于胶体散射而变成乳白色。检验水(外部)相pH并且必要时调整到5<pH<7.5。从剪切去除调配物，在通风橱中在室温下搅拌隔夜以使溶剂蒸发(二氯甲烷)。轻轻覆盖培养瓶以避免水过度蒸发隔夜。
第二天，通过325网筛过滤悬浮液。通过网筛去除极少(<5％)固体材料。接着在室温下储存悬浮液，上下颠倒混合以避免沉降/结块。通过离心悬浮液，抽取清液层相并且通过例如BCA或HPLC的方法分析ShK-186含量，来测量封装百分比。PLG1A、2A和3A的封装效率分别是88％、87％和82％。
即将注射使用之前，在2,000g下，在4℃下，利用适当体积离心调配物8分钟。固体粒子沉降到底部，倾析几乎澄清或略微混浊的清液层，随后用适当体积和组合物(缓冲剂、pH和离子强度)置换水溶液，随后机械混合以再悬浮粒子(必要时涡旋)获得均匀且自由流动的分散液(乳白色)。
使用23号针用1mL指定储槽式调配物对史泊格多利大鼠(雄性，年轻8-16周，每种病状n＝1)进行SC注射。在注射后多个时间点抽取血液并且通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定ShK-186。
从遵照这一程序制备的储槽式调配物的体内释放特征的实例显示于图5A(线性浓度)和图5B(对数浓度)中。与在15分钟内达到Cmax，接着不断降低并且在一天内消除到极低含量的治疗性蛋白质的生理食盐水溶液相比，使用ShK-186和PLG聚合物1A和2A形成的储槽式调配物在4天产生可检测蛋白质，并且PLG2A的调配物直到第18天也可检测。基于PLG3A的调配物在体内产生较低水平的药物持续释放。
实例5.使用ShK-186和ShK-192与PLG2A的储槽式调配物的体内剂量反应.如下进行储槽式调配物的制备：使用机械搅拌将1.0g PLG2A溶解于5.0mL二氯甲烷中直到聚合物完全溶解。单独地向三种独立PLG2A制剂中添加包括三种ShK-186含量的500μL体积(40、20和10mg/mL最终浓度；在具有140mM NaCl的20mM磷酸钠水性缓冲液(pH 6.0)中)，并且用10×195mm探针(26,000rpm)均质化2分钟。接着将w/o乳液倒入100mL1395培养瓶中，所述培养瓶装有20mL 0.5重量％DSS和20mM磷酸盐(pH 7.0)水溶液。使混合物在相同剪切设置(26,000rpm)下均质化5分钟，使烧杯与熔融冰(0℃)热接触。检验水(外部)相的pH并且必要时调整到5.0<pH<7.5。
接着从剪切去除调配物，并且在通风橱中在室温下搅拌隔夜以使溶剂蒸发。第二天早晨，通过325网筛过滤悬浮液并且在室温下储存，上下颠倒混合以避免沉降/结块。即将注射使用之前，在2,000g下，在4℃下，利用适当体积离心调配物8分钟。固体粒子沉降到底部，允许倾析几乎澄清的清液层，随后用适当体积和组合物(例如PBS)置换水溶液，随后机械混合以再悬浮粒子。
用1mL指定储槽式调配物对史泊格多利大鼠(雌性，年龄8-16周，n＝3)进行SC注射。在多个时间点抽取血液并且通过ELISA方法分析ShK-186。
图6A和6B显示与PLG2A一起调配的不同剂量(高＝40,000μg/kg，中等＝20,000μg/kg，低＝10,000μg/kg)的ShK-186的体内释放(图6A显示线性浓度并且图6B显示对数浓度)。ShK-186的血清含量在相对窄浓度范围上保持超过30天。如图6A和6B中所示，释放特征的相对形状几何学上类似，但曲线下面积根据ShK-186的总剂量按比例调整。这些结果表明长效储槽式调配物可以经调配以保持生物有效和完整ShK-186在长时间段的循环含量。
进行这一实例的下一部分以测试ShK-192的调配物和ShK-192在长持续时间内的体内释放类似于用于ShK-186的方法，使用机械搅拌将1.0g PLG2A溶解于5.0mL二氯甲烷中直到聚合物完全溶解。通过用10×195mm探针(26,000rpm)均质化2分钟来调配500μL体积，其包括低剂量的ShK-192(10mg/mL最终浓度；在具有140mM NaCl的20mM磷酸钠水性缓冲液(pH 6.0)中)。接着将w/o乳液转移到100mL1395培养瓶中，所述培养瓶装有20mL 0.5重量％DSS、20mM磷酸盐(pH 7.0)、水溶液。
混合物保持与冰水(0℃)热接触并且在26,000rpm下均质化5分钟，检验水(外部)相的最终pH并且调整到5.0<pH<7.5。接着从均质化去除调配物并且在通风橱中在室温下机械搅拌隔夜以使溶剂蒸发。第二天，首先通过325网筛过滤悬浮液，接着在室温下储存，上下颠倒混合以使沉降/结块降到最低。即将体内使用之前，在2,000g下，在4℃下，利用适当体积离心调配物8分钟。固体粒子分离到底部，允许倾析几乎澄清的清液层，随后用适当体积和组合物的水性缓冲剂(例如PBS)置换水溶液，随后机械混合以再悬浮粒子。接着抽取悬浮液(1mL)并且使用23号针以SC注射向大鼠(n＝3)投予。在多个时间点抽取血液并且使用ELISA分析法分析ShK-192。
图7A和7B为单次SC注射之后史泊格-多利大鼠体内以10,000μg/kg给药的ShK-192的体内释放的曲线图(图7A示出了线性浓度并且图7B示出了对数浓度)。几乎t＝12天时达到最大浓度表明治疗性蛋白质从储槽式调配物逐渐释放，这是一个相对平稳地持续30天的过程。总体来说，图7示出了史泊格-多利大鼠体内ShK-192的血清含量的时程，标准差绘制成y轴误差范围。这一曲线表明调配出不同生物分子活性Kv1.3通道抑制剂以获得随超过一个的长时间段的持续释放和有效血清浓度。
在重复实验中，监测ShK-186的血液含量的时间延长。如图8中可以看出，史泊格-多利大鼠体内20,000μg/kg下的单次SC剂量(1mL)的用PLG2A调配的ShK-186的体内释放持续至少56天。
实例6.ShK-186和ShK-192储槽式调配物在包括延迟型过敏大鼠模型的自体免疫疾病动物模型中的疗效.在第0天使用20G×11/2针在路易斯大鼠(Lewis rat)的尾巴基部，通过SC投予用在完成弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)中1:1(v/v)混合的100μg卵白蛋白(OVA/CFA，200μL体积)接种。在第7天，通过使用29G×1针向异氟醚麻醉的动物的耳朵的耳廓注射20μg OVA(10μL)，在耳部引起迟发型过敏(DTH)。在第8天和第9天，通过使用测微器(测径规)测量抗原注射位点的硬结来评估DTH。使用ShK-186或ShK-192的对照处理包括在第0-7天(从初始免疫开始每天)以100μg/kg、10μg/kg、3μg/kg或1μg/kg SC注射ShK-186或ShK-192。将对照处理与第0天(免疫时间)在1,000μg/kg、5,000μg/kg、10,000μg/kg、20,000μg/kg或40,000μg/kg下使用基于PLG聚合物(在一个实例中，PLG2A)持续调配物单次注射的ShK-186或ShK-192的储槽式调配物进行比较。
ShK-186或ShK-192的储槽式调配物预期在以单次注射给药时显示显著治疗效果，其中两者都将使硬结(发炎性反应)减小到与每日SC注射缓冲液P6N(注射用水中10mM磷酸钠，0.8w/v％NaCl，0.05w/v％聚山梨醇酯20，pH＝5)中的ShK-186或ShK-192产生的结果相当的水平或进一步减小。
实例7.ShK-186和ShK-192储槽式调配物在包括慢性复发性/缓解自体免疫脑脊髓炎大鼠模型的自体免疫疾病动物模型中的疗效.通过向暗刺鼠大鼠(哈兰公司(Harlan))SC注射脊髓匀浆(生物再生公司(Bioreclamation,Inc.))和CFA诱发慢性复发性/缓解自体免疫脑脊髓炎(CR-EAE)。动物通常在CR-EAE发作30天后恢复。在通过免疫诱发CR-EAE之前和之后，以每天、每两天或每三天在不同时间点SC注射不同量的ShK-186或ShK-192(1、3、5、10和100μg/kg)处理大鼠。这些方案与在实验开始时以及疾病发作后(即大鼠的临床评分为1或更大之后(治疗模型))以1,000μg/kg、5,000μg/kg、10,000μg/kg、20,000μg/kg或40,000μg/kg剂量给予的储槽式调配物(ShK-186或ShK-192与PLG2A)单次注射进行比较。
对每日储槽式调配物处理大鼠中的CR-EAE严重程度进行临床评分来测量处理功效。在SC注射脊髓匀浆/CFA乳液之后持续设定时间段每日两次使用以下评分系统对疾病进行监测和评分：(0)无疾病；(0.5)远端尾无力；(1)尾无力；(2)轻度下肢轻瘫，共济失调；(3)中度下肢轻瘫，大鼠有时绊倒；(3.5)一条后肢瘫痪，另一条运动；(4)全部后肢麻痹；(5)全部后肢麻痹和失禁；以及(6)垂死，呼吸困难，不进食或饮水/立即施行安乐死。在实验的特定时间点处死大鼠子组以采集组织或收集全血样品。
当在预防和治疗模型中以单次注射给药时，预期ShK-186或ShK-192的储槽式调配物显示显著治疗作用，例如临床评分降低。预期这些作用与ShK-186或ShK-192在缓冲剂P6N中每日给药时测试的不同药物投予方案所观测到的作用相当或比它更好。
实例8.牛皮癣的治疗.自体免疫疾病牛皮癣为效应记忆T细胞已显示牵涉于疾病中并且表达ShK-186的目标(钾通道Kv1.3)的自体免疫疾病。牛皮癣患者用本文所披露的储槽式调配物给药一次，接着在给药后的不同时间点评估以监测治疗性蛋白质(例如ShK-186、ShK-192)的治疗作用。打算评估的剂量包括0.1、1、10、100、1000、10,000、20,000或30,000mcg/Kg。评估时间点包括给药后1、2、3、4、6、8、12、16、24周。为了评估单次注射储槽式调配物之后的治疗性蛋白质暴露，在注射后的所要时间点从患者收集血液样品并且通过现有生物分析方法检测循环药物量。还监测牛皮癣的临床评分。预期治疗性蛋白质持续释放并且临床评分提高。
如所属领域普通技术人员将理解，本文所披露的各实施例可包含其具体陈述的元件、步骤、成分或组分或主要由它们组成或由它们组成。因此，术语“包括”应解释为列举：“包含、由……组成或主要由……组成”。过渡术语“包含”意思是包括(但不限于)，并且允许纳入甚至呈主要量的未指定元件、步骤、成分或组分。过渡短语“由……组成”不包括任何未指定的元件、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施例的范围限于指定元件、步骤、成分或组分以及不显著影响实施例的那些。因为本文定义了“持续释放”，所以材料作用将防止具体实施例实现治疗性蛋白质的持续释放。
除非另外指示，否则说明书和权利要求书中所使用的所有数值将理解成在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非指明为相反的，否则在说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可能取决于试图通过本发明获得的所需特性而变化的近似值。最低限度地，并且不打算限制等效物原则对权利要求书范围的应用，每一个数值参数都应至少根据所报告的有效数字的数值并且通过应用一般四舍五入技术来解释。当需要进一步阐明时，在结合所陈述数值或范围使用时，术语「约」具有由所属领域的技术人员合理地归属至其的意义，即表示比所陈述值或范围略大或略小，在所陈述值的±20％的范围内；所陈述值的±19％的范围内；所陈述值的±18％的范围内、所陈述值的±17％的范围内；所陈述值的±16％的范围内；所陈述值的±15％的范围内；所陈述值的±14％的范围内；所陈述值的±13％的范围内；所陈述值的±12％的范围内；所陈述值的±11％的范围内；所陈述值的±10％的范围内；所陈述值的±9％的范围内；所陈述值的±8％的范围内；所陈述值的±7％的范围内；所陈述值的±6％的范围内；所陈述值的±5％的范围内；所陈述值的±4％的范围内；所陈述值的±3％的范围内；所陈述值的±2％的范围内或所陈述值的±1％的范围内。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中所阐述的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值固有地包括某些由其分别的测试测量值中所发现的标准差必然造成的误差。
除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的情形下(尤其在随附权利要求书的情形下)所用的术语“一(a/an)”、“所述”和类似指示物应解释为涵盖单数和复数两者。本文中值的范围的叙述仅打算充当个别地提及处于所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指示，否则每一个个别值并入到本说明书中，如同其在本文中个别地列举一般。除非本文另外指示或另外明显与内容相矛盾，否则本文所描述的所有方法都可以按任何适合顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示范性语言(例如“例如”)的使用，仅打算更好地阐明本发明，并且不对以其它方式所要求的本发明范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求的要素对于实践本发明来说是必需的。
本文所披露的本发明的替代性要素或实施例的分组不应解释为限制。每一个群组成员都可以个别地或以与所述群组中其它成员或本文中所见其它要素的任何组合形式来提到和要求。预期群组中的一或多个成员可以出于便利性和/或专利性的原因而包括于群组中或从群组删除。当任何此类纳入或删除发生时，本说明书被认为如所修改地包括群组，因此满足所附权利要求书中所用的所有马库西(Markush)群组的书面描述。
本文中描述了本发明的某些实施例，包括本发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。当然，在阅读前述描述之后，这些所描述实施例的变化对于所属领域的技术人员将变得显而易见。本发明人期望熟练技术人员适当时采用这些变化，并且本发明人打算以不同于本文中特定描述的其它方式来实施本发明。因此，本发明包括可适用的法律所允许的、在此所附的权利要求书中叙述的主题的所有变更和等效物。此外，除非本文中另有说明或另外明显与内容相矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合。
此外，本说明书全文已对公开案、专利和/或专利申请案(统称为“参考文献”)做出许多参考。所列举参考文献中的每一个针对其具体列举传授内容独立地以引用的方式併入本文中。
本文中所示的细节是作为实例并且仅出于说明性论述本发明的优选实施例的目的，并且是为了提供被认为本发明的多个实施例的原理和概念方面的最有用且容易理解的描述而呈现。在这一方面，没有尝试比基础理解本发明所必需的程度更详细地展示本发明的结构细节，本说明书加上图示和/或实例使得所属领域的技术人员很清楚如何在实际中实施本发明的几种形式。
除非实例中清晰且明确修改或当意义的应用显现无意义或基本上无意义的任何构造时，否则用于本发明中的定义和解释意思是并且打算控制任何未来构造。在术语构造将使其无意义或基本上无意义的情况下，定义应取自韦氏辞典(第3版)或所属领域普通技术人员已知的辞典(例如生物化学与分子生物学牛津辞典(安东尼史密斯(AnthonySmith)编，牛津大学出版社，牛津，2004))。
最后，应理解本文所披露的本发明实施例说明本发明的原理。可以采用的其它修改处于本发明的范围内。因此，可以根据本文中的传授内容来利用例如(但不限于)本发明的替代性配置。因此，本发明不限于如所精确展示和描述的内容。

Claims (44)

1.一种储槽式调配物，其由以下组成：
(i)由以下组成的粒子：
(a)内部水相，其包含治疗性蛋白质SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218、缓冲剂和盐，其中所述粒子的所述内部水相的pH为6.0-8.5；以及
(b)包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)2A的聚合物相；以及
(ii)包围所述粒子的水相，其包含聚(乙烯醇)PVA表面活性剂；
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
2.一种储槽式调配物，其由以下组成：
(i)由以下组成的粒子：
(a)内部水相，其包含治疗性蛋白质SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218、缓冲剂和盐，其中所述粒子的所述内部水相的pH为6.0-8.5；以及
(b)聚合物相，其包含羧基封端的中等分子量PLG；以及
(ii)包围所述粒子的水相，其包含表面活性剂；
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
3.一种储槽式调配物，其由以下组成：
(i)由以下组成的粒子：
(a)内部水相，其包含具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键或至少三个二硫桥键的治疗性蛋白质、缓冲剂和盐，其中所述粒子的所述内部水相的pH为6.0-8.5，以及
(b)包含PLG2A的聚合物相；以及
(ii)包围所述粒子的水相，其包含PVA表面活性剂；
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
4.一种储槽式调配物，其由以下组成：
(i)由以下组成的粒子：
(a)内部水相，其包含具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键或至少三个二硫桥键的治疗性蛋白质、缓冲剂和盐，其中所述粒子的所述内部水相的pH为6.0-8.5，以及
(b)聚合物相，其包含羧基封端的中等分子量PLG；以及
(ii)包围所述粒子的水相，其包含表面活性剂；
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
5.一种储槽式调配物，其基本上由以下组成：
(i)内部水相，其包含：
(a)SEQ ID NO:1-260中的任一者的基于毒素的治疗性蛋白质，其以所述储槽式调配物的1.2％w/w存在，
(b)缓冲剂，其包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或其组合，以及
(c)选自NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、(NH4)2CO3或其组合的盐，
其中所述内部水相的pH为5.0-8.5；
(ii)基于羧基封端的中等分子量PLG聚合物的固体/油相；以及
(iii)外部水相，其包含以所述储槽式调配物的0.01-0.1％w/w存在的PVA表面活性剂，
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
6.一种储槽式调配物，其基本上由以下组成：
(i)内部水相，其包含：
(a)SEQ ID NO:1-260中的任一者的基于毒素的治疗性蛋白质，其以所述储槽式调配物的1.2％w/w存在，
(b)缓冲剂，其包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或其组合，以及
(c)选自NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、(NH4)2CO3或其组合的盐，
其中所述内部水相的pH为5.0-8.5；
(ii)基于PLG2A聚合物的固体/油相；以及
(iii)外部水相，其包含以所述储槽式调配物的0.01-0.1％w/w存在的PVA表面活性剂，
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
7.一种储槽式调配物，其基本上由以下组成：(i)SEQ ID NO:1-260中的任一者的基于毒素的治疗性蛋白质，其以所述储槽式调配物的1.2％w/w存在；(ii)PLG2A聚合物；以及(iii)以所述储槽式调配物的0.01-0.1％w/w存在的PVA表面活性剂；其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
8.一种储槽式调配物，其基本上由以下组成：
(i)内部水相，其包含：
(a)基于毒素的治疗性蛋白质，其以所述储槽式调配物的1.2％w/w存在，以及
(b)缓冲剂，其包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或其组合，
其中所述内部水相的pH为5.0-8.5；
(ii)基于PLG2A聚合物的固体/油相；以及
(iii)外部水相，其包含以所述储槽式调配物的0.01-0.10％w/w存在的PVA表面活性剂，
其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
9.一种储槽式调配物，其基本上由以下组成：(i)基于毒素的治疗性蛋白质；(ii)PLG2A聚合物；以及(iii)PVA表面活性剂，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述基于毒素的治疗性蛋白质至少一个月。
10.一种储槽式调配物，其基本上由以下组成：(i)内部水相，其包含以所述储槽式调配物的0.025％w/w到5％w/w存在的治疗性蛋白质；(ii)基于聚合物的固体/油相；以及(iii)外部水相，其包含以所述储槽式调配物的0.01％w/w到1％w/w存在的表面活性剂，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
11.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述聚合物选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、PLG、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、PLG-接枝聚乙二醇PEG或其掺合物或共聚物。
12.根据权利要求11所述的储槽式调配物，其中所述聚合物是丙交酯:乙交酯比率为1:1的PLG。
13.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质以所述储槽式调配物的0.025％w/w；所述储槽式调配物的0.25％w/w；或所述储槽式调配物的2.5％w/w存在。
14.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯、PEG、环氧乙烷-环氧丙烷PEO-PPO掺合物、泊洛沙姆(poloxamer)、磺基丁二酸二辛酯、PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP或其组合。
15.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少20个氨基酸、至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸、至少25个氨基酸、至少26个氨基酸、至少27个氨基酸、至少28个氨基酸、至少29个氨基酸、至少30个氨基酸、至少31个氨基酸、至少32个氨基酸、至少33个氨基酸、至少34个氨基酸、至少35个氨基酸、至少36个氨基酸、至少37个氨基酸、至少38个氨基酸、至少39个氨基酸、至少40个氨基酸、至少41个氨基酸、至少42个氨基酸、至少43个氨基酸、至少44个氨基酸、至少45个氨基酸、至少46个氨基酸、至少47个氨基酸、至少48个氨基酸、至少49个氨基酸、至少50个氨基酸、至少51个氨基酸、至少52个氨基酸、至少53个氨基酸、至少54个氨基酸或至少55个氨基酸。
16.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键、至少三个二硫桥键、至少四个二硫桥键或至少五个二硫桥键。
17.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为基于毒素的治疗性蛋白质。
18.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为抑制电压门控性钾通道的基于ShK的蛋白质。
19.根据权利要求18所述的储槽式调配物，其中所述抑制的电压门控性钾通道为Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv1.3/1.5、Kv1.6、Kv3.2或KCa3.1通道。
20.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有SEQ ID NO:1-260中的任一者的序列。
21.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:219、SEQ IDNO:218、SEQ ID NO:221或其盐。
22.根据权利要求21所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:217。
23.根据权利要求21所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:218。
24.根据权利要求21所述的储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ ID NO:210。
25.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少40天、至少41天、至少42天、至少43天、至少44天、至少45天、至少46天、至少47天、至少48天、至少49天、至少50天、至少51天、至少52天、至少53天、至少54天、至少55天或至少56天。
26.根据权利要求10所述的储槽式调配物，其中所述聚合物为PLG1A、PLG2A、PLG3A、PLG5E或PLG7E。
27.一种冻干储槽式调配物，其基本上由以下组成：(i)基于聚合物的固体/油相，其包含以所述冻干储槽式调配物计0.025％w/w到5％w/w分散于其中的治疗性蛋白质；(ii)以所述冻干储槽式调配物计0.01％w/w到0.5％w/w表面活性剂；以及(iii)以所述冻干储槽式调配物计0.5％w/w到90％w/w糖，其中在所述冻干储槽式调配物复原后，所述复原的储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少一个月。
28.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述糖为蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖或其组合。
29.根据权利要求28所述的冻干储槽式调配物，其中所述糖为蔗糖。
30.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述聚合物选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、PLG、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、PLG-接枝PEG或其掺合物或共聚物。
31.根据权利要求30所述的冻干储槽式调配物，其中所述聚合物是丙交酯:乙交酯比率为1:1的PLG。
32.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质以所述冻干储槽式调配物的0.025％w/w；以所述冻干储槽式调配物的0.25％w/w；或以所述冻干储槽式调配物的2.5％w/w存在。
33.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯、PEG、环氧乙烷-环氧丙烷掺合物、泊洛沙姆、磺基丁二酸二辛酯、PVA、PVP或其组合。
34.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少20个氨基酸、至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸、至少25个氨基酸、至少26个氨基酸、至少27个氨基酸、至少28个氨基酸、至少29个氨基酸、至少30个氨基酸、至少31个氨基酸、至少32个氨基酸、至少33个氨基酸、至少34个氨基酸、至少35个氨基酸、至少36个氨基酸、至少37个氨基酸、至少38个氨基酸、至少39个氨基酸、至少40个氨基酸、至少41个氨基酸、至少42个氨基酸、至少43个氨基酸、至少44个氨基酸、至少45个氨基酸、至少46个氨基酸、至少47个氨基酸、至少48个氨基酸、至少49个氨基酸、至少50个氨基酸、至少51个氨基酸、至少52个氨基酸、至少53个氨基酸、至少54个氨基酸或至少55个氨基酸。
35.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有至少一个二硫桥键、至少两个二硫桥键、至少三个二硫桥键、至少四个二硫桥键或至少五个二硫桥键。
36.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为基于毒素的治疗性蛋白质。
37.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为抑制电压门控性钾通道的基于ShK的蛋白质。
38.根据权利要求37所述的冻干储槽式调配物，其中所述抑制的电压门控性钾通道为Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv1.3/1.5、Kv1.6、Kv3.2或KCa3.1通道。
39.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质具有SEQ IDNO:1-260中的任一者的序列。
40.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述治疗性蛋白质为SEQ IDNO:208、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:219、SEQID NO:218、SEQ ID NO:221或其盐。
41.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述复原的储槽式调配物在单次投予后在有效含量内持续释放所述治疗性蛋白质至少40天、至少41天、至少42天、至少43天、至少44天、至少45天、至少46天、至少47天、至少48天、至少49天、至少50天、至少51天、至少52天、至少53天、至少54天、至少55天或至少56天。
42.根据权利要求27所述的冻干储槽式调配物，其中所述聚合物为PLG1A、PLG2A、PLG3A、PLG5E或PLG7E。
43.一种在受试者体内获得治疗性蛋白质的持续释放的方法，其包含向所述受试者投予根据权利要求1到42中任一权利要求所述的储槽式调配物，由此获得所述治疗性蛋白质在所述受试者体内的持续释放。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述持续释放通过以下证明：(1)在单次投予后在有效含量内释放至少一个月；(2)在单次投予后在Cmax对C平均比率不超过5或不超过3的有效含量内释放至少一个月；(3)在单次投予后在有效含量内释放至少56天；和/或(4)在单次投予后在Cmax对C平均比率不超过5或不超过3的有效含量内释放至少56天。
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