CN105860962B - Rgd功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料、其修饰方法及应用 - Google Patents

Rgd功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料、其修饰方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RGD功能多肽修饰的稀土上转化纳米材料，其修饰方法及应用，属于纳米材料领域。所述纳米材料由以下修饰方法得到：(一)利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇通过配体交换方法将油酸修饰的纳米粒改性为表面氨基化的水溶性粒子；(二)将羧基化的2‑氰基苯并噻唑偶联到表面氨基化的水溶性粒子表面；(三)接着在RGD功能多肽分子氨基端构建出半胱氨酸末端残基；(四)将含有半胱氨酸残基的多肽特异性修饰到特异性连接臂修饰的水溶性稀土上转化纳米粒表面，制成RGD功能多肽修饰的稀土上转化纳米材料。与现有技术相比，本发明的稀土上转化纳米材料具有非常强的靶向肿瘤能力，具有广泛的应用价值。

Description

RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料、其修饰方法及应用
技术领域
本发明涉及纳米材料领域，具体地说是一种RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其修饰方法及应用。
背景技术
上转换纳米材料是一种荧光纳米材料，通过稀土离子的掺杂由低能量红外或者近红外光激发，辐射出高能量的可见光。稀土掺杂NaYF4:Yb/Er可以通过对稀土元素掺杂比例的调节实现多色发光，也可以通过对掺杂元素种类进行调节，实现磁学和光学的多模态信号转换。上转换荧光纳米材料是已知的最有效的可以实现多模态显像的纳米材料之一，在生物分析化学和生物成像等方面有着巨大潜力。
为了实现纳米材料的生物功能，需要对其表面进行功能化修饰。在生物学功能化方面，针对不同的生物分子，如寡聚核苷酸、蛋白质(含抗原、抗体、酶)、多肽等，不同的修饰方法已经被用来对上转换纳米粒表面进行功能化修饰。其中将靶分子和纳米粒表面之间的氨基和羧基偶联反应是对纳米材料功能化的首选方案，比如，Sisi Cui等人(ACS Nano,2013,1,676-688.)利用靶向叶酸受体的叶酸分子作为靶标分子，将其羧基用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳酰亚胺(DDC)活化，然后与稀土上转换纳米材料表面亲水性配体壳聚糖上氨基进行偶联，通过酰胺键的形式将叶酸分子的羧基和纳米颗粒表面的氨基相连接，从而构建了靶向到癌部位的纳米颗粒。但所用到的叶酸为小分子靶标，结构简单易于结构修饰，对于多肽或者蛋白这种方法存在明显不足，最突出的问题就是由于多肽或者蛋白质分子中可反应的氨基通常不止一个而使产物中存在大量的异构体，而且如果氨基恰好处于蛋白质的生物活性位点上，则可能导致蛋白质的失活。同时，这种连接方法反应活性较低，连接到纳米材料表面的生物分子较少。
由于上述方法在标记过程当中的非特异性标记，基于“点击化学”的修饰方法受到了越来越多的关注，比如Joshua I.Cutler等人(Nano.Lett,2010,10,1477-1480)，首先将寡核苷酸的末端构建出炔基，接着将纳米粒表面修饰出叠氮基团，通过“点击化学”将靶寡核苷酸分子修饰在纳米粒表面完成对纳米粒的功能化修饰，但是炔基和叠氮基团之间的缩合反应，通常是需要在铜离子的介导下才能完成的。众所周知，铜作为一种常见的重金属离子，在生理条件下能影响生物大分子构象的变化，从而使其功能受到影响。所以，在修饰纳米材料的过程当中会不可避免的影响到纳米粒表面生物大分子的功能。同时由于纯化不彻底造成铜离子的残留，会有潜在的生物毒性。
发明内容
本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料。
本发明进一步的技术任务是提供上述纳米材料的修饰方法。
本发明更进一步的技术任务是提供上述纳米材料的应用。
本发明的技术任务是按以下方式实现的：RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特点是由以下修饰方法得到：
首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-OH和DSPE-PEG-NH2)通过配体交换方法将油酸修饰的纳米粒改性为表面氨基化的水溶性粒子；
随后将羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)偶联到表面氨基化的水溶性粒子表面，得到特异性连接臂修饰的水溶性稀土上转换纳米粒；
接着在RGD功能多肽分子氨基端构建出半胱氨酸末端残基，得到半胱氨酸修饰的RGD功能多肽；
最后将半胱氨酸修饰的RGD功能多肽特异性修饰到特异性连接臂修饰的水溶性稀土上转换纳米粒表面，制成RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料。
修饰反应式为：
作为优选，上述稀土上转换纳米材料RGD功能多肽的修饰方法包括以下步骤：
1)表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料的制备：
取表面油酸包裹的稀土上转换纳米材料用三氯甲烷分散，加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，超声反应一定时间后减压浓缩除去三氯甲烷，纯化得到聚乙二醇(PEG)修饰的表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料，如采用去离子水重新分散离心，弃去上清液(除去未包裹的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)，得到聚乙二醇(PEG)修饰的表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料；
2)水溶性稀土上转换纳米材料表面特异性连接臂修饰：
将羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)的羧基活化，制备成琥珀酰亚胺酯溶液，接着将氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料用三氯甲烷分散，将制备得到的琥珀酰亚胺酯溶液加入到纳米材料分散液中，加入一定量的碱，反应完成后，除去未反应的原料(如未反应的羧基化的2-氰基苯并噻唑)，并提纯得到特异性连接臂修饰的水溶性稀土上转换纳米材料；
3)半胱氨酸修饰的RGD功能多肽：
在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯(Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu)，调节体系pH值至8-8.5，使RGD功能多肽的末端氨基与N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯偶联制备出含有受保护半胱氨酸残基的多肽，接着将得到的保护性多肽在裂解液的作用下，脱去半胱氨酸的保护基团，并用半制备HPLC纯化，得到半胱氨酸修饰的RGD功能多肽；
4)稀土上转换纳米材料表面RGD功能化多肽修饰：
将步骤2)得到的水溶性稀土上转换纳米材料的碳酸盐缓冲溶液，加入步骤3)得到的半胱氨酸修饰的RGD功能多肽的碳酸盐缓冲溶液中，同时加入防止巯基氧化的还原剂，反应一段时间后，纯化得到RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料。
步骤1)所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-OH和DSPE-PEG-NH2)优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-NH2)的摩尔百分比率为5％-20％，总二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇总浓度为10-40mM。超声反应的反应时间优选为10-40min。
步骤2)所述羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)的结构式如下：
式中，X为氧原子或者氮原子；m为0、1、2、3或者4。
步骤2)中活化羧基所用的活化剂优选为二环己基碳酰亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以摩尔比计，其反应当量关系为羧基化的2-氰基苯并噻唑:二环己基碳酰亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺＝1:(1-1.5):(1-1.5)；
所述碱为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和/或者三乙胺(TEA)；
加入碱后再反应3-5h，反应完成。
步骤3)所述半胱氨酸修饰的RGD功能多肽具有式(I)所示的结构：
式(I)中，半胱氨酸为L构型或者D构型。
步骤3)中，在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯(Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu)的具体方法优选为：N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯(Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu)先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，随后再将N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯(Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu)溶液加入到含有RGD功能多肽的碳酸盐缓冲体系中，N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯与RGD功能多肽的摩尔比率范围为(1.2-1.5):1，偶联反应的反应时间为0.5-1h。
步骤3)中可以选用现有技术中任意一种碱剂进行pH值调节，优先为以N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和/或者三乙胺(TEA)调节体系pH值至8-8.5。
步骤3)中所述裂解液可选用现有技术中任意一种裂解液，如三氟乙酸/二氯甲烷体系或三氟乙酸/三异丙基硅烷/和去离子水体系，但为了达到最佳效果，优选为三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)和去离子水(H2O)的混合溶液，三氟乙酸、三异丙基硅烷和去离子水的体积百分比为95％:1-5％:1-5％，反应时间为5-10min。
步骤4)中所述还原剂优选为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP.HCl)，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐与半胱氨酸修饰的RGD功能多肽的摩尔比率范围为(2-5):1，反应时间为5-10min。
通过大量实验可以看出，本发明的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料具有非常强的靶向肿瘤能力，在制备肿瘤组织的靶向检测制剂中可以得到广泛的应用。
附图说明
附图1为实施例中脱掉半胱氨酸侧链保护后的c(RGDfK)多肽高分辨质谱图；
附图2为实施例中功能性c(RGDfK)多肽对稀土上转换纳米材料修饰前后的透射电镜(TEM)图；
附图3为实施例中功能性c(RGDfK)多肽对稀土上转换纳米材料修饰前后在980nm激发光激发下的荧光发射图；
附图4为实验例中注射纳米材料后的活体荧光成像图。
实施方式
下面的实施例、制剂实施例以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
【实施例1】
本发明的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料由以下修饰方法得到：
(1)表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料的制备
称取20.2mg的油酸包裹的稀土上转换纳米材料(OA-UCNPs)分散于10mL三氯甲烷中，再称取二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000(DSPE-PEG3000-OH和DSPE-PEG3000-NH2)10.2mg溶于5mL的三氯甲烷，共同加入到50mL圆底烧瓶中，室温下超声处理30min，然后用减压浓缩除去三氯甲烷，得到的白色固体用5mL去离子水超声分散后，再用超纯水清洗3次，除去未包裹的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000，10000r×5min离心5min，沉淀真空干燥得到白色粉末，即表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料。
所用的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000中DSPE-PEG3000-NH2摩尔百分比率为10％，总二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3000浓度为20mM。
(2)特异性连接臂的制备
取化合物1(2-氰基-6-羟基苯并噻唑)(350.4mg,2mmol)于反应瓶中，加入化合物溴乙酸叔丁酯2(390.3mg,3mmol)，碳酸钾(1.39g,10mmol)及6mL的无水N,N-二甲基甲酰胺，100℃下搅拌回流，TLC检测反应，反应结束后，冷却反应液，用水-二氯甲烷体系萃取2次，合并有机层，无水碳酸钠干燥后减压浓缩，硅胶柱分离纯化，最终得到淡黄色固体粉末(化合物3)499.4mg，产率86％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.95(d,1H,J＝8.9),6.98(dd,1H,J＝2.3,8.9),6.94(d,1H,J＝2.3),4.9(br t,1H),3.89(d,2H,J＝5.1),1.5(s,9H).MS:calcdfor C14H16N3O2S 290.1,found 290.3。
称取化合物3 50.4mg于反应瓶中，加入三氟乙酸5mL，冰浴下反应2h，反应结束后，减压浓缩反应液，硅胶柱分离纯化，最终得到淡黄色固体粉末(化合物4——羧基化的2-氰基苯并噻唑)36.7mg，产率91％。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ7.87(d,1H,J＝9.8),7.04-7.08(m,2H),3.99(s,2H).MS:calcd for C10H8N3O2S 234.0,found 234.2。
(3)PEG化的稀土上转换纳米材料表面COOH-CBT修饰
称取20.3mg的特异性连接臂(羧基化的2-氰基苯并噻唑，COOH-CBT)溶于2mL的N,N-二甲基甲酰胺，加入21.1mg二环己基碳酰亚胺(DCC)和11.8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应时间为3h，过滤除去沉淀，保留滤液备用。称取20.3mg的氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料分散于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中，再将上述特异性连接臂活化酯溶液加入到纳米材料溶液中，然后加入33.1mg N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，在室温下搅拌3h，之后将体系离心，收集底部沉淀，依次用N,N-二甲基甲酰胺(2次)和超纯水(2次)清洗，除去未反应的特异性连接臂，10000r×5min离心，沉淀真空干燥得到白色粉末，即偶联有连接臂的水溶性稀土上转换纳米材料。
(4)RGD功能性多肽的半胱氨酸修饰
称取N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu 26.8mg溶于200μL二甲基甲酰胺；称取环状五肽c(RGDfK)19.3mg用300μL碳酸盐缓冲体系溶解，将Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu二甲基甲酰胺加入到多肽水溶液中，以N,N-二异丙基乙胺调节体系pH＝8.2，室温下反应30min，反应结束后用半制备HPLC纯化目标产物，收集相应馏分，最终得到白色冻干粉，随后称取产物25.3mg，加入裂解液1mL，室温下反应10min。反应液倾入10mL冰乙醚中，出现大量白色絮状沉淀，离心收集白色沉淀用去500μL离子水复溶，最终用半制备HPLC纯化目标多肽，收集相应馏分，最终得到白色冻干粉(半胱氨酸修饰的RGD功能多肽)。
如附图1所示，脱掉半胱氨酸侧链保护后的c(RGDfK)多肽分子离子峰[M+H]+为707.3283，其理论值为707.3294。
(5)稀土上转换纳米材料环状五肽c(RGDfK)功能化修饰
称取20.2mg的偶联有特异性连接臂的水溶性稀土上转换纳米材料，分散于5mL的碳酸盐缓冲体系，再称取2.1mg的末端半胱氨酸化的多肽(半胱氨酸修饰的RGD功能多肽)溶于500μL的碳酸盐缓冲体系，称取1.6mg三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP.HCl)加入到多肽水溶液中，随后将多肽溶液加入到偶联有特异性连接臂的水溶性稀土上转换纳米材料中，以N,N-二异丙基乙胺调节体系酸碱度，使反应体系pH值为8.2，在室温下搅拌反应10min，之后将体系离心，收集底部沉淀，用超纯水清洗3次，除去未反应的多肽，10000r×5min离心，沉淀真空干燥得到淡黄色固体粉末，即c(RGDfK)功能化的稀土上转换纳米材料。
所述裂解液成分为三氟乙酸(TFA)，三异丙基硅烷(TIS)和去离子水(H2O)的混合溶液，其体积百分比为TFA/TIS/H2O(95％:2.5％:2.5％)。
本发明的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料具有非常强的靶向肿瘤能力。通过下面试验例及应用试验进行详细说明。
【试验例一】
对功能性c(RGDfK)多肽对稀土上转换纳米材料修饰前后做透射电镜(TEM)。图2左图为特异性连接臂偶联的水溶性稀土上转换纳米材料的透射电镜(TEM)图；右图为c(RGDfK)功能化修饰后的稀土上转换纳米材料的透射电镜(TEM)图；从透射电镜图看出多肽功能化修饰前后对其粒径基本无影响。
【试验例二】
以980nm激发光激发修饰前后的功能性c(RGDfK)多肽对稀土上转换纳米材料。图3虚线为特异性连接臂偶联的水溶性稀土上转换纳米材料的荧光发射谱；实线图为c(RGDfK)功能化修饰后的稀土上转换纳米材料的荧光发射谱。从荧光发射谱看出多肽功能化修饰前后对其荧光发射谱基本无影响。
【应用试验】
应用步骤：
(1)4T1荷瘤裸鼠动物模型的建立：
(2)c(RGDfK)功能化稀土上转换纳米材料4T1乳腺癌靶向近红外荧光成像：
1)4T1荷瘤裸鼠动物模型的建立：4T1小鼠的乳腺癌细胞在标准培养条件下培养。收集细胞，离心，反复洗涤3次，最终将细胞重悬，得到5x106/mL的4T1细胞悬液，吸取100μL皮下注射入Athymic nude小鼠，形成种植瘤模型。当肿瘤总体积达100mm3时进行活体成像实验。
2)4T1乳腺癌靶向近红外荧光成像：实验组所用材料为c(RGDfK)功能化稀土上转换纳米材料将功能化上转换纳米粒；对照组实验所用为未经修饰的上转换纳米粒。两种纳米材料都稀释到1.5mg/mL，尾静脉注射进荷瘤模型小鼠(200μL/小鼠),使用经980nm激发光源改造过的Lumina ll小动物活体成像系统进行活体光学成像。激发光波长980nm，功率密度为0.5W/cm2，发射光谱滤光片为790nm-810nm。注射后对不同组别的不同4T1荷瘤裸鼠进行肿瘤区域光学成像。
图4左图为实验组(注射c(RGDfK)功能化上转换纳米粒)，右图为对照组(注射未经功能化上转换纳米粒)。通过图4可以发现左图肿瘤区域的信号明显强于右图相应位置的信号，说明经过靶向多肽修饰后的稀土上转换纳米材料其靶向肿瘤能力有明显提高。

Claims (10)

1.RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于由以下修饰方法得到：
首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇通过配体交换方法将油酸修饰的纳米粒改性为表面氨基化的水溶性纳米粒；
随后将羧基化的2-氰基苯并噻唑偶联到表面氨基化的水溶性纳米粒表面，得到特异性连接臂修饰的水溶性纳米粒；
接着在RGD功能多肽分子氨基端构建出半胱氨酸末端残基，得到半胱氨酸修饰的RGD功能多肽；
最后将半胱氨酸修饰的RGD功能多肽特异性修饰到特异性连接臂修饰的水溶性纳米粒表面，制成RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料。
2.根据权利要求1所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于，所述修饰方法包括以下步骤：
1)表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料的制备：
取表面油酸包裹的稀土上转换纳米材料用三氯甲烷分散，加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，超声反应一定时间后减压浓缩除去三氯甲烷，纯化得到聚乙二醇修饰的表面氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料；
2)水溶性稀土上转换纳米材料表面特异性连接臂修饰：
将羧基化的2-氰基苯并噻唑的羧基活化，制备成琥珀酰亚胺酯溶液，接着将氨基化的水溶性稀土上转换纳米材料用三氯甲烷分散，将制备得到的琥珀酰亚胺酯溶液加入到纳米材料分散液中，加入一定量的碱，反应完成后，除去未反应的原料，并提纯得到特异性连接臂修饰的水溶性稀土上转换纳米材料；
3)半胱氨酸修饰的RGD功能多肽：
在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯，调节体系pH值至8-8.5，使RGD功能多肽的末端氨基与N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯偶联制备出含有受保护半胱氨酸残基的多肽，接着将得到的保护性多肽在裂解液的作用下，脱去半胱氨酸的保护基团，并用半制备HPLC纯化，得到半胱氨酸修饰的RGD功能多肽；
4)稀土上转换纳米材料表面RGD功能化多肽修饰：
将步骤2)得到的水溶性稀土上转换纳米材料的碳酸盐缓冲溶液，加入步骤3)得到的半胱氨酸修饰的RGD功能多肽的碳酸盐缓冲溶液中，同时加入防止巯基氧化的还原剂，反应一段时间后，纯化得到RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料。
3.根据权利要求2所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于：步骤1)所用的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的摩尔百分比率为5％-20％，总二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇总浓度为10-40mM，超声反应的反应时间为10-40min。
4.根据权利要求2所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于：步骤2)所述羧基化的2-氰基苯并噻唑的结构式如下：
式中，X为氧原子或者氮原子；m为0、1、2、3或者4。
5.根据权利要求4所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于：步骤2)中活化羧基所用的活化剂为二环己基碳酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，以摩尔比计，其反应当量关系为羧基化的2-氰基苯并噻唑:二环己基碳酰亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺＝1:(1-1.5):(1-1.5)；
所述碱为N,N-二异丙基乙胺和/或者三乙胺；
加入碱后再反应3-5h，反应完成。
6.根据权利要求2所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于：步骤3)所述半胱氨酸修饰的RGD功能多肽具有式(I)所示的结构：
式(I)中，半胱氨酸为L构型。
7.根据权利要求6所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于：步骤3)中N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，随后再将N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯溶液加入到含有RGD功能多肽的碳酸盐缓冲体系中，N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亚胺酯与RGD功能多肽的摩尔比率范围为(1.2-1.5):1，偶联反应的反应时间为0.5-1h；
所述裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷和去离子水的混合溶液，三氟乙酸、三异丙基硅烷和去离子水的体积百分比为95％:1-5％:1-5％，反应时间为5-10min。
8.根据权利要求2所述的RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料，其特征在于：步骤4)中所述还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐与半胱氨酸修饰的RGD功能多肽的摩尔比率范围为(2-5):1，反应时间为5-10min。
9.以RGD功能多肽对稀土上转换纳米材料进行修饰的修饰方法，其特征在于：
首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇通过配体交换方法将油酸修饰的纳米粒改性为表面氨基化的水溶性纳米粒；
随后将羧基化的2-氰基苯并噻唑偶联到表面氨基化的水溶性纳米粒表面，得到特异性连接臂修饰的水溶纳米粒；
接着在RGD功能多肽分子氨基端构建出半胱氨酸末端残基，得到半胱氨酸修饰的RGD功能多肽；
最后将半胱氨酸修饰的RGD功能多肽特异性修饰到特异性连接臂修饰的水溶性纳米粒表面，制成RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料。
10.权利要求1所述RGD功能多肽修饰的稀土上转换纳米材料在制备肿瘤组织的靶向检测制剂中的应用。
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