CN105849567B - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的鉴定 - Google Patents

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的鉴定 Download PDF

Info

Publication number
CN105849567B
CN105849567B CN201480070689.3A CN201480070689A CN105849567B CN 105849567 B CN105849567 B CN 105849567B CN 201480070689 A CN201480070689 A CN 201480070689A CN 105849567 B CN105849567 B CN 105849567B
Authority
CN
China
Prior art keywords
staphylococcus aureus
mec
psm
methicillin
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480070689.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105849567A (zh
Inventor
加布里埃莱·比尔鲍姆
克里斯蒂安·塞卡特
纳赫德·阿尔萨比提
米夏埃莱·约斯滕
马里昂·赖夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Brooke Dalton Ltd And Lianghe Co
Original Assignee
Bruker Daltonik GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bruker Daltonik GmbH filed Critical Bruker Daltonik GmbH
Publication of CN105849567A publication Critical patent/CN105849567A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105849567B publication Critical patent/CN105849567B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种鉴定细菌样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，该方法包括以下步骤：将样本中的细菌分类为金黄色葡萄球菌(SA)并确定是否存在酚溶性调控蛋白肽或其变体，其中，存在PSM‑mec肽或其变体表明该金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。该变体优选为PSM‑mec肽的甲酰化变体，该变体在单质子化状态的质荷比为2415。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的鉴定
技术领域
本发明涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的鉴定，尤其是通过质谱进行鉴定。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(S.aureus)为芽孢杆菌目和葡萄球菌科细菌，常见于人类呼吸道和皮肤上。虽然金黄色葡萄球菌未必总是具有致病性，但它是皮肤感染(例如疖)、呼吸系统疾病(例如鼻窦炎)和食物中毒的普遍原因。目前已证实，它有获得抗菌剂耐药性的超常能力。20世纪80年代末，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)开始在医院传播，随后开始出现社区获得性菌株(CA-MRSA)。目前它仍是医院获得性感染的五个最常见原因之一，并且通常是手术后伤口感染的原因。如今，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)给全世界大多数国家的医院卫生带来了问题。
对甲氧西林的耐药性通过mec操纵子介导，该操纵子是葡萄球菌盒式染色体mec(SCCmec)的一部分。耐药性通过mecA基因获得，该基因编码改变的青霉素结合蛋白(例如PBP2a)，该蛋白结合β-内酰胺(青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类)的亲和力较低。这使得在存在β-内酰胺的情况下，启动转肽酶活性，从而阻止它们抑制细胞壁合成。迄今为止，已检测出十一种不同的SCCmec类型以及多种亚型和变体。这些盒式染色体在序列和集成移动元件方面显示出高度多样性。
在临床实验室中，完整细胞的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)正在越来越广泛地用于患者样本细菌的鉴定。通过MALDI-TOF MS鉴定细菌所使用的分析物离子(尤其是核糖体蛋白离子)通常具有单电荷，因此人们只需要简单参考离子的质量m。然而，更准确的术语是“电荷相关质量”m/z，实际上，这在质谱中是必需的。
已经有多项研究分析了通过质谱法(尤其是MALDI-TOF MS)区分甲氧西林敏感(易感)金黄色葡萄球菌(MSSA)与MRSA的可能性：
-Edwards-Jones V等，J.Med.Microbiol.,2000,49,295-300:“Rapiddiscrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistantStaphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry”；
-Du Z.等，Anal.Chem.,2002,74,5487-5491:“Identification ofStaphylococcus aureus and determination of its methicillin resistance bymatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry”；
-Lu JJ.等，Anal.Chem.,2012,84,5685-5692:“Peptide biomarker discoveryfor identifica-tion of methicillin-resistant and vancomycin-intermediateStaphylococcus aureus strains by MALDI-TOF”；
-Bernardo K.等，Proteomics,2002,2,747-753:“Identification anddiscrimination of Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laserdesorption/ionization-time of flight mass spectrometry”；
-Majcherczyk PA等，FEMS Microbiol.Lett,2006,255,233-239:“Thediscriminatory power of MALDI-TOF mass spectrometry to differentiate betweenisogenic teicoplanin-susceptible and teicoplanin-resistant strains ofmethicillin resis-tant Staphylococcus aureus”；
-孙等，卫生研究，2011，40，375-378：“基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”。
发明内容
本发明提供一种鉴定细菌样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，该方法包括以下步骤：将样本中的细菌分类为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)并确定是否存在酚溶性调控蛋白肽或其变体，其中，存在PSM-mec肽或其变体表明该细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。变体优选为PSM-mec肽的甲酰化变体，该变体在单质子化状态的质荷比为2415。
可以通过获得整个(完整)细菌细胞的质谱并确定质谱中存在至少一个m/z介于2404和2420之间的质量信号，尤其是存在m/z中心位置为2415的质量信号，从而确定存在PSM-mec肽或其变体。还可以可通过在细菌样本中施加溶剂(例如类似如乙醇等的有机溶剂)，获得所得到的上清液的质谱并确定质谱中存在至少一个m/z介于2404和2420之间的质量信号，尤其存在m/z中心位置为2415的质量信号，从而来确定存在PSM-mec肽或其变体。此外，还可选择m/z介于2404和2420之间的母离子，尤其是m/z中心位置为2415的母离子，并通过包含这些母离子的细菌样本的串联质谱从而确定存在PSM-mec肽或变体。
优选通过以下方式将细菌分类为金黄色葡萄球菌：获得细菌的样本质谱，并且将该样本质谱与文库中的参考质谱进行比较，所述文库包括至少一个金黄色葡萄球菌的参考质谱。参考质谱可以是众所周知的细菌株系的测量质谱，或者可以衍生自细菌株系的基因序列。样本质谱优选是整个(完整)细菌细胞的MALDI-TOF质谱。使用质谱分配细菌的分类学类别(分类学分类/鉴定)在出版物Van Baar(FEMS Microbiology Reviews，24，2000，193-219：“Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry”)和Jarman等人(AnalyticalChemistry，72(6)，2002，1217-1223：An Algorithm for Automated BacterialIdentification Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization MassSpectrometry)中均有描述。优选通过在样本质谱中至少存在一个m/z介于2404和2420之间的质量信号从而确定PSM-mec肽或其变体的存在，尤其是通过存在m/z中心位置为2415的质量信号确定PSM-mec肽或其变体的存在，其中，该样本质谱也用于分类学分类。
根据本发明的方法可进一步包括确定金黄色葡萄球菌的agr(附属基因调节子)系统状态的步骤，即，金黄色葡萄球菌的agr是阳性还是阴性。存在agr系统和存在PSM-mec肽或其变体表明该金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，而存在agr系统但不存在PSM-mec肽或其变体则表明该金黄色葡萄球菌是甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。可以通过是否存在δ毒素(delta-toxin)来确定agr系统的状态，其中存在δ毒素表明存在agr系统(agr阳性)。可以通过质谱确定δ毒素，其中，在细菌样本的质谱(最好是用于分类学鉴定的样本质谱)中存在m/z中心位置为3007或3037的质量信号，则表明存在δ毒素，因此存在agr为阳性的金黄色葡萄球菌。如果agr为阴性状态，则无法确定金黄色葡萄球菌是MRSA还是MSSA。
细菌样本可来自于琼脂平板上、营养肉汤中或血液培养中的培养物，或直接来自涂片或体液。可从琼脂平板的凝胶状培养基上生长的菌落收集细菌。在液体营养肉汤或血液培养中培养的细菌可通过离心或过滤分离。在后一种情况中，优选在裂解血细胞后再分离。对涂片和血液等其他样本而言，还必须裂解非细菌细胞。
为了进一步确定是否存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，可以在确定存在PSM-mec肽或其变体后执行额外的抗生素敏感试验(AST)。该额外的抗生素敏感试验可以是常规试验，其中，在抗生素的影响下确定营养肉汤中或琼脂平板上的细菌生长，例如通过光学测量确定营养肉汤的浊度或琼脂平板的生长区。其他的抗生素敏感试验可基于质谱，并且在例如美国专利号US B8,293,496B2(Goverun等：“Mass spectrometric measurement ofmicrobial resistances”)和欧洲专利申请号13002450.8(K.Sparbier等：“Massspectrometric determination of microbial resistances”)和13002699.0(K.Sparbier等：“Determining the bacterial resistance by mass spectrometric easurement ofthe bacterial growth”)等中均有描述。
在商业仪器中，在线性模式下使用基质辅助激光解吸和电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪对微生物(如细菌)进行质谱鉴定已为人们广泛接受。然而，除了基质辅助激光解吸电离，其他类型的电离也可适用于获得根据本发明的质谱，例如电喷雾电离(ESI)或借助后续化学电离(CI)的解吸方法。此外，可以使用不同类型的质量分析器，例如正交离子注入的飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪或四极杆过滤器。尤其四极杆过滤仪器可用于(例如)通过选择反应监测，从而确定是否存在m/z为2415的质量信号。
存在酚溶性调控蛋白肽(PSM-mec)或其变体还可以通过使用诸如MALDI-TOF MS或四极杆过滤器等质谱仪(尤其使用标定物质)来定量确定。如果已经定量确定PSM-mec肽并且细菌样本中的细菌初始浓度已知，则可通过确定的PSM-mec肽的量确定抗药性的强度。
附图说明
图1示出了金黄色葡萄球菌菌株USA100的已测量MALDI-TOF质谱以及该菌株的克隆，其中可通过反义RNA的表达而使PSM-mec的表达下调。
图2示出了根据本发明的优选方法的流程图。
具体实施方式
细菌的质谱分类
通过质谱对细菌进行分类学分类通常开始于在陪替氏培养皿中的凝胶状培养基中培养清晰分离的菌落(分离物)。使用小棉棒(例如木质牙签)将少量细菌从菌落点涂到质谱样本盘上。采用公知方法将细胞裂解，添加基质材料的溶液并使其干燥，并将样本盘插入到借助基质辅助激光解吸(MALDI)电离操作的飞行时间质谱仪(TOF)的离子源中。通过脉冲激光发射生成离子，并测量它们的飞行时间。通常将上百个单一质谱相加以改善信噪比。术语通过MALDI-TOF质谱仪获得的“细菌质谱”或“样本质谱”通常指许多单一质谱相加的总质谱。
在Van Baar的综述中详细说明了如何借由质谱鉴定细菌(“FEMS MicrobiologyReviews”，24，2000，193-219：“Characterization of bacteria by matrix-assistedlaser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry”)。例如，可通过分析细菌样本质谱和文库中储存的公知细菌菌株的参考质谱的相似度来进行鉴定。每次与参考质谱的相似度比较，都可计算相似度值。如果与确切参考质谱的相似度值明显优于与所有其他参考质谱的相似度值，并且优于预选相似度阈值，则该细菌可视为已鉴定细菌。根据各个种的代表性参考质谱的数量，分类学分类的鉴定通常可向下进行到种级别。在Jarman等人的出版物(“Analytical Chemistry”，72(6)，2002，1217-1223：“An Algorithmfor Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry”)中，描述了自动生成参考质谱和对待研究中的样本的质谱与自动生成的参考质谱进行相似度分析的计算机辅助方法。
测得m/z为2415的细菌混合物的鉴定
已经有多项研究分析过使用MALDI-TOF MS区分甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)与MRSA的可能性。尤其是，MRSA菌株与其同基因MSSA突变体(在储存期间丢失SCCmec)的比较表明细胞提取物的质谱没有任何差异，从而说明mecA、PBP2a或其他抗药性变体编码的蛋白质过大(76kDa)或存在的量太少，从而在常规测量期间无法通过细胞提取物的MALDI-TOF MS检测到。
使用完整的MRSA和MSSA细胞，即直接将整个细胞放置在靶上而不事先进行提取，可在Rhine-Hesse克隆(序列类型(ST)225，克隆群(clonal complex)(CC)5)的MRSA菌株中检测到m/z为2415的质量信号。在这些菌株的细胞提取物中未观察到m/z为2415的质量信号。质量信号对应于酚溶性调控蛋白(PSM)PSM-mec的甲酰化版本的单电荷(质子化)离子的已计算的质量。
为了证明m/z为2415的质量信号由PSM-mec肽产生，可构建这样的一个株系，其中，可通过反义RNA的表达从而使PSM-mec的表达下调。因此，寡核苷酸psmmecfor(aattcgcctgaatgcaagtcttgattaaatcaat-aatgcttgtaataacaccagtt)和psmmecrev(ctagaactggtgttattacaagcattattgatttaatcaagacttgcattca-ggcg)相互退火并直接与EcoRI/Xbal消化的载体pEPSA5结合，从而产生pEPSA5-psm-mec。产生的株系包含50bp的PSM-mec片段，位于反义方向木糖诱导型启动子之后。将该质粒转换为ST5USA100分离物(NRS382)，其包含A类mec基因复合体。株系在LB琼脂上生长，该琼脂包含34mg/l的氯霉素，作为隔夜是否存在50mM木糖的选择剂。细胞材料直接在MALDI-TOF MS研磨钢靶板上沉淀，从而形成细菌融合层。在接下来的步骤中，将1μl的甲酸(70％)添加到细菌层，然后添加1μl的乙腈，小心混合并风干。然后，在每个样本上覆盖2μl的基质(α-氰基-4-羟基-肉桂酸的50％乙腈/2.5％三氟乙酸的饱和溶液)并再次在室温下风干。使用MALDI-TOF MS分析样本，并在正线性模式下测量。
图1示出了菌株USA100(图1A)、存在木糖时含有pEPSA5-psm-mec的菌株USA100(图1B)和不存在木糖时含有pEPSA5-psm-mec的菌株USA100(图1C)的测量质谱。m/z为3007的质量信号由δ毒素产生，而m/z为2415的质量信号(对应于PSM-mec肽)被存在木糖时反义RNA的表达所抑制。结果显示，在向含有重组pEPSA5载体的株系添加木糖后m/z为2415的信号大幅降低，这证明了通过这种方法观察到的m/z为2415的信号确实是PSM-mec。
通过A类mec基因复合体鉴定MRSA
PSM-mec是小分泌肽，在包含A类mec基因复合体的三个SCCmec盒(II、III和VIII型)上编码(Chatterjee等人：“Distribution and regulation of the mobile geneticelement-encoded phenol-soluble modulin PSM-mec in methicillin-resistantStaphylococcus aureus”，2011，PloS One，6:e28781)。所有PSM的产生均由agr系统调节，该系统参与金黄色葡萄球菌中的群体感应，并直接通过AgrA的磷酸化形式调节δ毒素和PSM的表达。因此，可通过δ毒素(m/z为3007(大部分CC)或在CC1菌株中m/z为3037)的表达来判断菌株的agr状态，这通常表示整个细胞的质谱中最强的信号。如金黄色葡萄球菌Mu50等agr阴性类型菌株表示未产生δ毒素和PSM-mec，同样在δ毒素阴性类型菌株或临床分离物中未观察到PSM-mec的产生。
然而，A类mec基因复合体出现在多种医院相关性MRSA谱系中，例如美国、东亚和欧洲(纽约/日本株系或USA100)的ST5SCCmec II型医院相关性MRSA和近缘ST225SCCmec II型MRSA。ST225菌株在中欧的医院流行，并且去年占本地区MRSA分离物的70％以上。此外，这一分组包括在澳大利亚、亚洲和美洲以及东欧(巴西/匈牙利株系)流行的ST239SCCmec III型菌株以及以EMRSA-16(USA200)为代表的ST36SCCmec II型MRSA，其只存在于欧洲、澳大利亚和美国以及ST45菌株USA600中。
表1：被测菌株
在进一步的试验中，在一系列的菌株和得到良好表征的常规临床MRSA和MSSA分离物中测试是否存在PSM-mec(表1)。根据其克隆群(CC)分组菌株。如果怀疑存在A类mec基因复合体，则通过多重PCR执行SCCmec盒分型。如果发生意外阴性或阳性测量，则还可通过PCR检测是否存在PSM-mec，以确认在冷藏保存期间未丢失SCCmec或部分SCCmec，或排除MSSA中存在肽的可能性。
使用两种不同的方法制备MALDI样本：可将整个新鲜菌落涂抹到靶板上并直接覆盖MALDI基质，或者按照上述方法在靶上沉淀后直接使用甲酸/乙腈提取细胞。
如上所述，agr阴性类型菌株表示未产生δ毒素和PSM-mec，同样在δ毒素阴性类型菌株或临床分离物中未观察到PSM-mec的产生。因此，在表2的评估中排除未显示δ毒素信号的所有曲线(12％的涂抹和11.5％的提取样本)。
表2：通过MALDI-TOF MS在含有A类mec基因复合体的agr阳性MRSA菌株内检测PSM-mec的敏感性和特异性
方法 峰值检测窗口m/z 敏感性 特异性
靶上提取 2404-2420 0.944 0.955
2411-2419 0.944 1
涂抹的样本 2404-2420 0.955 0.796
2411-2419 0.955 1
在第一种类型的评估中，m/z介于2404和2420之间的所有信号(不论强度如何)均包含在内，从而导致使用靶上提取的整体敏感性为0.94，特异性大约为0.96。当在靶上沉淀后直接在样本上覆盖基质时，敏感性稍微提高，但是测量的特异性低于0.8。假阳性菌株(PSM-mec PCR阴性)在质量稍低时(m/z≤2411)信号弱。
在第二种类型的评估中，排除m/z值≤2411的所有相对较弱信号(例如强度＜100任意单位)，将m/z≥2411的所有相对较强信号(例如强度＞100任意单位)视为阳性。由此，因为消除了所有假阳性菌株(表2)，所以特异性大幅提高，从而表明在使用的菌株集合中仅存在与SCCmec有关的PSM-mec。检测到假阴性菌株的原因很可能是PSM-mec肽的低表达。
盲法试验的评价(“靶上提取”方法的135个样本和直接涂抹到靶上的60个样本)主要包括含有II型SCCmec盒(ST5、ST225)的CC5MRSA并混有其他CC(CC22、CC8、CC398)的MRSA以及10种MSSA菌株，在之前采用细胞提取物的研究中，这些菌株无法与CC5MRSA进行区分，这表明只能鉴定出所有agr阳性CC5MRSA的95％。
试验结果表明，可以通过MALDI-TOF MS鉴定包含A类mec基因复合体的agr阳性的MRSA。与通过群集分析鉴定MRSA的早期尝试相比，本发明使用PSM-mec肽作为具体标记物。标记物的特性已知，并且它在多个SCCmec盒上编码。由于该肽的阴离子性质和存在于细胞表面，可以在整个细胞测量期间检测到该肽；并且在使用乙醇清洗细胞时(这是细胞提取常规准备的第一步)，肽可能从细胞表面丢失。A类mec基因复合体存在于多个医院相关性MRSA谱系中。然而，无法通过此方法对含有SCCmec IV型盒的CA-MRSA菌株USA300、牲畜相关性MRSA或医院相关性CC22菌株(例如EMRSA-15)与MSSA进行区分。
图2示出了优选方法的流程图，包括以下步骤：(a)在琼脂平板上培养待分析的样本；(b)选择琼脂平板上的至少一个细菌菌落作为细菌样本；(c)获得来自至少一个菌落的细菌整个细胞的MALDI-TOF质谱；(d)通过比较MALDI-TOF质谱与文库的参考质谱对细菌进行分类，该文库包含至少一个金黄色葡萄球菌的参考质谱；以及(e)确定在MALDI-TOF质谱中是否存在第一和第二质量信号，其中第一质量信号的m/z中心位置为3007或3037，第二质量信号的m/z中心位置为2415，其中，当存在第一和第二质量信号时，至少一个菌落的细菌被鉴定为耐甲氧西林，当存在第一质量信号但不存在第二质量信号时，至少一个菌落的细菌被鉴定为甲氧西林敏感。
由于检测MRS主要子组的必要数据可在很多临床实验室的金黄色葡萄球菌分类学种鉴定期间获得，因此根据本发明分析细菌样本质谱可提前检测到至少部分医院获得性MRSA菌株并提前隔离住院患者。

Claims (14)

1.一种鉴定细菌样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，该方法包括以下步骤：
将样本中的细菌分类为金黄色葡萄球菌(SA)，
直接将整个细菌细胞放置在MALDI-TOF质谱仪靶板上而不事先进行提取，
获得整个细菌的MALDI-TOF质谱，
确定是否存在酚溶性调控蛋白肽(PSM-mec)的变体，其中，通过在MALDI-TOF质谱中存在m/z中心位置为2415的质量信号，从而确定存在PSM-mec肽的变体，并且
当存在PSM-mec肽的变体时表明已经分类的金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌通过以下方式被分类为金黄色葡萄球菌：将所述MALDI-TOF质谱与文库中的参考质谱进行比较，所述文库包含至少一个金黄色葡萄球菌的参考质谱。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，通过包含选择的m/z中心位置为2415的母离子的细菌样本的串联质谱，从而确定存在PSM-mec肽的变体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述PSM-mec肽的变体是PSM-mec肽的甲酰化版本。
5.根据权利要求1所述的方法进一步包括：确定细菌样本的金黄色葡萄球菌的agr系统的状态，其中，存在agr系统并且存在PSM-mec肽的变体表明所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
6.根据权利要求1所述的方法进一步包括：确定细菌样本的金黄色葡萄球菌的agr系统的状态，其中，存在agr系统并且不存在PSM-mec肽的变体表明所述金黄色葡萄球菌是甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。
7.根据权利要求1所述的方法进一步包括：确定细菌样本的金黄色葡萄球菌的agr系统的状态，如果agr为阴性状态，则无法确定金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林还是甲氧西林敏感。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中，在细菌样本中确定是否存在δ毒素，存在δ毒素则表明存在agr系统。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，当所述MALDI-TOF质谱中存在m/z为3007或3037的质量信号时，则确定细菌样本中存在δ毒素。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌样本源自于琼脂平板、液体营养肉汤、涂片、体液和血液培养之一。
11.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
(a)在琼脂平板上培养待分析的样本；
(b)选择琼脂平板上至少一个细菌菌落作为细菌样本；
(c)获得来自至少一个菌落的细菌整个细胞的MALDI-TOF质谱；
(d)通过比较MALDI-TOF质谱与文库的参考质谱对细菌进行分类，所述文库包含至少一个金黄色葡萄球菌的参考质谱；以及
(e)确定在MALDI-TOF质谱中是否存在第一和第二质量信号，其中第一质量信号的m/z中心位置为3007或3037，第二质量信号的m/z中心位置为2415；
其中，如果存在第一和第二质量信号，则至少一个菌落的细菌被鉴定为耐甲氧西林，如果存在第一质量信号但不存在第二质量信号，则至少一个菌落的细菌被鉴定为甲氧西林敏感。
12.根据权利要求11所述的方法，其中如果不存在第一质量信号，则无法确定所述细菌是耐甲氧西林还是甲氧西林敏感。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，在确定存在PSM-mec肽的变体之后执行额外的抗生素敏感试验，以确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的鉴定。
14.一种鉴定细菌样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，该方法包括以下步骤：将样本中的细菌分类为金黄色葡萄球菌(SA)并确定是否存在酚溶性调控蛋白肽(PSM-mec)的变体，其中，将溶剂施加到所述细菌样本，获得所得到的上清液的质谱，通过在质谱中存在m/z中心位置为2415的质量信号，从而确定存在PSM-mec肽的变体。
CN201480070689.3A 2013-12-23 2014-12-18 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的鉴定 Active CN105849567B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920054P 2013-12-23 2013-12-23
US61/920,054 2013-12-23
PCT/EP2014/078470 WO2015097061A1 (en) 2013-12-23 2014-12-18 Identification of methicillin resistant staphylococcus aureus (mrsa)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105849567A CN105849567A (zh) 2016-08-10
CN105849567B true CN105849567B (zh) 2017-12-15

Family

ID=52345179

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480070689.3A Active CN105849567B (zh) 2013-12-23 2014-12-18 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的鉴定

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11053533B2 (zh)
EP (1) EP3087396B1 (zh)
JP (1) JP6620099B2 (zh)
CN (1) CN105849567B (zh)
CA (1) CA2934769C (zh)
WO (1) WO2015097061A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106596822B (zh) * 2016-12-16 2018-01-19 南京市产品质量监督检验院 一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法
CN109946367B (zh) * 2017-12-20 2021-10-22 中国中医科学院医学实验中心 一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法
MX2021003006A (es) 2018-09-13 2021-05-27 Univ California Bacterioterapia contra proprionibacterium acnes para el tratamiento de acne.
KR102028564B1 (ko) * 2018-12-10 2019-10-04 한림대학교 산학협력단 말디-토프 질량분석기를 이용한 메티실린-내성 황색포도구균 균류의 동정방법
KR102165834B1 (ko) * 2019-07-16 2020-10-14 한림대학교 산학협력단 말디-토프 질량분석기를 이용한 메티실린-내성 황색포도구균 균류의 동정방법
CN111678968A (zh) * 2020-05-13 2020-09-18 重庆中元汇吉生物技术有限公司 质谱法检测霉菌的前处理方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008103751A2 (en) * 2007-02-20 2008-08-28 The Regents Of The University Of California Antimicrobial and anti-inflammatory therapies and compositions
WO2008154101A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Psm peptides as vaccine targets against methicillin-resistant staphylococcus aureus
CN102399877A (zh) * 2011-11-09 2012-04-04 泰普生物科学（中国）有限公司 一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株pcr检测试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1001267A (en) * 1911-03-06 1911-08-22 Luther B Hetrick Ginseng-shade.
FR2982367B1 (fr) * 2011-11-08 2013-12-27 Biomerieux Sa Procede de detection de l'hemolysine delta de staphylococcus aureus par spectrometrie de masse directement a partir d'une population bacterienne

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008103751A2 (en) * 2007-02-20 2008-08-28 The Regents Of The University Of California Antimicrobial and anti-inflammatory therapies and compositions
WO2008154101A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Psm peptides as vaccine targets against methicillin-resistant staphylococcus aureus
CN102399877A (zh) * 2011-11-09 2012-04-04 泰普生物科学（中国）有限公司 一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of novel cytolytic peptides as key virulence determinants for community-associated MRSA;Rong Wang 等;《NATURE MEDICINE》;20071111;第13卷(第12期);1510-1514 *
Identification of Staphylococcus aureus and Determination of Its Methicillin Resistance by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry;Zongmin Du 等;《Analytical Chemistry》;20021101;第74卷(第21期);5487-5491 *
Peptide Biomarker Discovery for Identification of Methicillin-Resistant and Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus Strains by MALDI-TOF;Jang-Jih Lu 等;《Analytical Chemistry》;20120607;第84卷;5685-5692 *
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ＭＲSＡ感染机制研究进展;张薇 等;《中国病原生物学杂志》;20130930;第8卷(第10期);949-957 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017501721A (ja) 2017-01-19
CA2934769C (en) 2019-09-24
CN105849567A (zh) 2016-08-10
CA2934769A1 (en) 2015-07-02
US20160355865A1 (en) 2016-12-08
EP3087396B1 (en) 2018-09-05
US11053533B2 (en) 2021-07-06
WO2015097061A1 (en) 2015-07-02
JP6620099B2 (ja) 2019-12-11
EP3087396A1 (en) 2016-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105849567B (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的鉴定
Schulthess et al. Identification of Gram-positive cocci by use of matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry: comparison of different preparation methods and implementation of a practical algorithm for routine diagnostics
Barreiro et al. Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
Chao et al. Comparison of the accuracy of two conventional phenotypic methods and two MALDI-TOF MS systems with that of DNA sequencing analysis for correctly identifying clinically encountered yeasts
Coltella et al. Advancement in the routine identification of anaerobic bacteria by MALDI-TOF mass spectrometry
EP3438275B1 (en) Microorganism identification method
Turvey et al. Identification of beer spoilage microorganisms using the MALDI Biotyper platform
Zhang et al. Analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus major clonal lineages by matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI–TOF MS)
AU2014270797B2 (en) Mass-spectrometric resistance determination by growth measurement
Chean et al. Comparing the identification of Clostridium spp. by two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry platforms to 16S rRNA PCR sequencing as a reference standard: a detailed analysis of age of culture and sample preparation
Barcelos et al. Comparison of standard and on-plate extraction protocols for identification of mastitis-causing bacteria by MALDI-TOF MS
Kok et al. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory
GB2467636A (en) Mass spectrometric identification of microorganisms in complex samples
Gutiérrez et al. Wine yeasts identification by MALDI-TOF MS: Optimization of the preanalytical steps and development of an extensible open-source platform for processing and analysis of an in-house MS database
EP2393935B1 (en) Rapid detection of bacteria using mass spectrometric analysis
WO2014116711A1 (en) Methods and apparatuses involving mass spectrometry to identify proteins in a sample
Panda et al. Rapid identification of clinical mycobacterial isolates by protein profiling using matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry
Berendsen et al. Identification of microorganisms grown in blood culture flasks using liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Alksne et al. Determination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis by MALDI-TOF MS in clinical isolates from Latvia
Matsumura et al. Detection of Escherichia coli sequence type 131 clonal group among extended-spectrum β-lactamase-producing E. coli using VITEK MS Plus matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry
CN106650779A (zh) 谱图相似度的计算方法
Tang et al. Rapid bacterial characterization and identification by MALDI-TOF mass spectrometry
KR102165834B1 (ko) 말디-토프 질량분석기를 이용한 메티실린-내성 황색포도구균 균류의 동정방법
Milman et al. A “Low-Molecular” Approach to the Identification of Microorganisms by MALDI Mass Spectrometry
Kim et al. Comparison of peaks in the matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry spectra of Staphylococcus aureus grown on various blood agar plates

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210730

Address after: Bremen, Germany

Patentee after: Brooke Dalton limited and Lianghe Co.

Address before: Bremen, Germany

Patentee before: Brook Dalton Ltd.

TR01 Transfer of patent right