CN105838634B

CN105838634B - 一种苏云金芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105838634B
Application number: CN201510165507.7A
Authority: CN
Inventors: 杜立新; 宋健; 曹伟平; 王金耀; 冯书亮
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2035-04-09
Also published as: CN105838634A

Abstract

本发明涉及生物防治领域，特别涉及一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其菌株定名为JQD117，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9763。其对双翅目害虫，尤其是蚊类害虫具有良好的杀虫活性。

Description

一种苏云金芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治领域，特别涉及一种苏云金芽孢杆菌。

背景技术

蚊类属于昆虫纲(Insecta)、双翅目(Diptera)，蚊总科(Culicoidea)。其主要分为卫生害虫和农业害虫，例如，重要的蚊类卫生害虫有按蚊(Anopheles)、库蚊(Culex)、伊蚊(Aedes)；重要的蚊类农业害虫有眼蕈蚊(Sciaridae)，其在全国各地均有分布。

卫生害虫可传播疾病的病原体以及传播鼠疫、伤寒、疟疾等流行病，严重威胁人们的生命安全，因此其对人类危害毋庸置疑。

而农业害虫也深刻影响着人类的生活，以韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)为例，其又名韭蛆、黄脚蕈蚊，属双翅目(Diptera)，眼蕈蚊科(Sciaridae)，迟眼蕈蚊属(Bradysia)，主要危害韭菜、大葱、洋葱、小葱、大蒜等百合科蔬菜，偶尔也危害莴苣、青菜、芹菜等，是葱蒜类蔬菜的主要害虫之一，在全国各地均有分布。韭菜迟眼蕈蚊的幼虫生活在土壤表层，群集在韭菜地下部的鳞茎和柔嫩的茎部蛀食为害。初孵幼虫先为害韭菜叶鞘基部和鳞茎的上端；春、秋季主要为害嫩茎，导致根茎腐烂。受害韭菜地上部分生长细弱，叶片发黄萎蔫下垂，最后韭叶枯黄死亡。夏季气温高时，幼虫向下移动，为害韭菜鳞茎，致使整个鳞茎腐烂，严重时整墩韭菜枯死。对于韭菜迟眼蕈蚊的防治方法主要有物理防治(糖醋液、臭氧等)和化学防治。由于物理防治存在操作繁琐、防治效果受环境影响大等缺点，生产上主要采用农药灌根等化学手段进行防治，但是由于韭蛆繁殖快、隐蔽性强、防治难度大，导致菜农不规范或过量、甚至违规使用禁用的高毒农药进行防治，导致农药残留超标、污染环境、危害人类健康以及杀害有益鸟类等问题，另一方面，长期大量使用化学农药增强害虫抗药性、污染环境、杀伤鸟类、造成害虫再度猖獗的恶性循环，不能达到对害虫种群的有效控制，同时造成韭菜农残超标，使消费者健康受到威胁。近年来毒韭菜事件频发，如：2004年“香河毒韭菜进京事件”、2010年“青岛毒韭菜事件”和2011年河南南阳“毒韭菜事件”，连续的毒韭菜曝光事件，使得消费者“谈韭色变”，严重影响了菜农的经济利益和消费者的食品安全。

为了减少化学农药对环境的污染及对人民健康的威胁，筛选对双翅目害虫，特别是蚊类有高致病性的生防微生物是防治该类害虫的有效方法和重要措施。

发明内容

本发明之一提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其菌株定名为JQD117，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9763。

本发明菌株JQD117采集筛选的过程及其形态分类：

本发明菌株JQD117是河北省农林科学院植物保护研究所将2013年4月在河北省阜平县采集的土样中分离到的菌株接种在LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1L，pH 7.2)上在30℃条件下培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征等。在LB培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.1～1.5×0.5μm；单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约1.0～1.2×0.5μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴孢晶体：球形，直径约0.4μm，具有杀虫活力。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌形态特征基本一致，初步判断该菌株属于苏云金芽孢杆菌，将其命名为JQD117。

利用gyrB基因序列对JQD117菌株进行鉴定分类：

将JQD117菌株接种于LB培养液，30℃振荡过夜，取1mL菌液于Eppenddorf管中，离心，弃上清，200μL超纯水悬浮，100℃处理10min，12000rpm离心5min，取上清即为模板。利用芽孢杆菌gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：

gyrB-F：5’TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3’(SEQ ID NO.1)，

gyrB-R：5’TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3’(SEQ ID NO.2)；

gyrB的PCR扩增反应体系(50μL)：10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL，引物(10μmol/L)各1μL，模板1μL，Taq聚合酶(5U/μL)1μL，超纯水补至50μL。扩增循环：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司，委托上海生工测序，得JQD117菌株的gyrB基因序列(SEQ IDNO.3)。将JQD117菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现JQD117与苏云金芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到99％；同时利用MEGA软件构建系统发育树，结果(见图1)JQD117菌株与苏云金芽孢杆菌聚合在一起，说明JQD117菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，并且与任何其他菌株不同，是一个新菌株。

利用phoR基因序列对JQD117菌株进行鉴定分类：

提取JQD117菌株的DNA，然后以JQD117菌株的DNA为模板，以phoR-F和phoR-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：

phoR-F：5’TTYARYTCATGRGAVACATT3’(SEQ ID NO.4)；

phoR-R：5’GGNTAYAAANARGAGGAGCC3’(SEQ ID NO.5)；

phoR的PCR扩增反应体系(50μL)：10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP Mixture(2.5mM)5μL，引物(10μmol/L)各2μL，模板1μL，Taq聚合酶(5U/μL)1μL，超纯水补至50μL。扩增循环：95℃ 5min；95℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。将所得扩增产物送交上海生工生物工程有限公司，委托上海生工测序，得JQD117菌株的phoR基因序列(见SEQ ID NO.6)。将JQD117的phoR基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现JQD117菌株与苏云金芽孢杆菌的phoR基因序列同源性最高，达到99％；同时利用MEGA软件构建系统发育树，结果(见图2)JQD117菌株与苏云金芽孢杆菌聚合在一起，说明JQD117菌株在分类上属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，并且与已知的任何其他菌株不同，是一个新菌株。

在研究过程中，发明人发现苏云金芽孢杆菌菌株JQD117对蚊类具有良好的杀虫活性，其不但对农业害虫眼蕈蚊，特别是韭菜迟眼蕈蚊具有非常高的杀虫活性，而且对卫生害虫按蚊和伊蚊也有很好的杀虫活性。由于苏云金芽孢杆菌对害虫高效、对人畜安全无毒、对环境友好等优点，其为生物防治蚊类害虫提供了一种有效的方法。

另外，该菌株与现有技术中的菌株，如苏云金芽孢杆菌菌株JQ23相比，对韭菜迟眼蕈蚊的活性出乎意料的高。根据实施例的分析，苏云金芽孢杆菌菌株JQ23对2龄韭菜迟眼蕈蚊的活性为3.186×10⁶cfu/ml，而本发明中的苏云金芽孢杆菌菌株JQD117的活性为0.934×10⁶cfu/ml，经过比较发现，本发明的苏云金芽孢杆菌菌株JQD117的活性较苏云金芽孢杆菌菌株JQ23的活性高出了2.4倍。因此，相比于JQ23菌株，本发明的苏云金芽孢杆菌菌株JQD117应用于生产，可以达到节省成本、提高害虫防效的目的。而且其对按蚊、伊蚊等蚊类的杀虫活性具有普遍作用，因而其杀虫谱也较苏云金芽孢杆菌菌株JQ23更宽。

本发明之二提供了一种如上所述的苏云金芽孢杆菌的应用。

本发明之三提供了一种包含如上所述的苏云金芽孢杆菌的组合物。所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与所述苏云金芽孢杆菌具有增效作用的其他物质，该物质可以是微生物来源杀虫物质，也可以是杀虫化合物。所述组合物进一步可以包括与所述的苏云金芽孢杆菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等；分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。

根据室内活性分析的结果可以推算出其在田间应用的使用剂量。在一个具体实施例中，所述JQD117在组合中的含量根据组合物中的状态而定，当组合物为液态时，所述JQD117在组合物中的含量为1.0×10⁶‐1.0×10⁹cfu/mL，优选所述JQD117在组合物中的含量为1.0×10⁷‐1.0×10⁸cfu/mL；当组合物为固态时，所述JQD117在组合物中的含量1.0×10⁶‐1.0×10⁹cfu/g，优选所述JQD117在组合物中的含量为1.0×10⁷‐1.0×10⁸cfu/g。其中，所述含量是指使用状态下的含量。

本发明之四提供了一种包含如上所述的苏云金芽孢杆菌的农药制剂。

在一个具体实施例中，所述农药制剂用于防治双翅目害虫；根据本发明的研究，其主要可以用于防治双翅目害虫，优选用于防治蚊类害虫；特别优选用于防治眼蕈蚊(Sciaridae)、按蚊(Anopheles)和伊蚊(Aedes)中的至少一种；其中，眼蕈蚊优选为迟眼蕈蚊属(Bradysia)；所述害虫具体为韭菜迟眼蕈蚊、中华按蚊(Anopheles sinensis)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)。

含有JQD117微生物的杀虫剂的使用方法：将该杀虫剂直接兑水稀释至1×10⁷-1×10⁸cfu/ml，在韭蛆发生初期灌根防治，可以连续灌根3次，每次间隔5-7天(d)。

本发明之五提供了一种以如上所述的苏云金芽孢杆菌为受体菌的工程菌。其中，所述工程菌可以为提高了对蚊类杀虫活性的工程菌。还可以为兼具其他害虫杀虫活性的工程菌株，优选所述其他害虫为地下害虫和/或水生害虫。或它们的组合。

在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。

在本说明书中，用语“包括”或者诸如“包含”的变形应理解为表示包括一个指定的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。用语“可以”或其变形应理解为表示可以选择指定的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但也可以不是选择指定的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，而是根据实际情况进行等同替换或其他相应的选择。

附图说明

图1根据gyrB的基因序列，利用MEGA软件构建系统发育树。

图2根据phoR的基因序列，利用MEGA软件构建系统发育树。

菌株保藏

本发明的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其菌株定名为JQD117，该菌株已于2014年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.9763。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

微生物菌剂的制备及室内试验操作方法参见CN104099277A。

实施例1

苏云金芽孢杆菌JQD117菌株对韭菜迟眼蕈蚊的活性测定

从河北省南宫市韭菜迟眼蕈蚊害虫严重的韭菜田中采集韭菜迟眼蕈蚊，其饲养方法的参照文献为：“慕卫,刘峰,贾忠明,何茂华,相冠锋，韭菜迟眼蕈蚊简便人工饲养技术，华东昆虫学报，2003,12(2)：87-89”。

试验设计：将JQD117发酵液稀释成1×10⁸、0.5×10⁷、1×10⁶、0.5×10⁶、1×10⁵和0.5×10⁵cfu/ml六个浓度梯度。设置阴性对照：无菌水。

活性测定方法参照CN104099277A。

对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫72小时(h)的LC₅₀值为0.934×10⁶cfu/ml(详见表1)。

表1苏云金芽孢杆菌JQD117菌株对韭蛆不同龄期毒力测定

对比例1

苏云金芽孢杆菌JQ23菌株对韭菜迟眼蕈蚊的活性测定

试验设计：将JQ23发酵液稀释成1×10⁸、0.5×10⁷、1×10⁶、0.5×10⁶、1×10⁵和0.5×10⁵cfu/ml六个浓度梯度。设置阴性对照：无菌水。

其他同实施例1。对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫72h的LC₅₀值为3.186×10⁶cfu/ml(详见表2)。

表2苏云金芽孢杆菌JQ23菌株对韭蛆不同龄期毒力测定

实施例2

苏云金芽孢杆菌JQD117菌株对中华按蚊(Anopheles sinensis)的活性测定

中华按蚊(Anopheles sinensis)采自保定周边常年积水水塘，用塑料盆舀水，用吸管吸取中华按蚊幼虫。采集到的幼虫在实验室进行人工饲养至成虫，经形态观察确定为中华按蚊。再饲养至第二代幼虫即为试验用虫。

其中，中华按蚊的饲养方法的参照文献为：“潘家复，韩罗珍，中华按蚊实验室饲养的研究，昆虫学报，1979,22(1)：41-45”。

对中华按蚊的2龄幼虫杀蚊活性测定分别用灭菌水将JQD117菌株发酵液稀释成1×10⁸、0.5×10⁷、1×10⁶、0.5×10⁶、1×10⁵和0.5×10⁵cfu/ml六个浓度梯度的菌悬液,每个生测盒加入10mL菌悬液，放入30头试虫，设置3个重复，以灭菌水做对照，放入28℃培养箱中，24h后调查死亡数，计算死亡率。

JQD117菌株对中华按蚊2龄幼虫24h的LC₅₀值为9.040×10⁶cfu/ml(详见表3)。

表3苏云金芽孢杆菌JQD117菌株对中华按蚊毒力测定

实施例3

苏云金芽孢杆菌JQD117菌株对白纹伊蚊(Aedes albopictus)的活性测定

白纹伊蚊(Aedes albopictus)采自保定周边常年积水水塘，用塑料盆舀水，用吸管吸取白纹伊蚊幼虫。采集到的幼虫在实验室进行人工饲养至成虫，经形态观察确定为白纹伊蚊。再饲养至第二代幼虫即为试验用虫。

其中，白纹伊蚊的饲养方法的参照文献为：“王佳璐，谭梁飞，白纹伊蚊的饲养技巧及其卵巢的解剖方法，中国媒介生物学及控制杂志，2011,22(4)：366-367”。

对白纹伊蚊2龄幼虫的杀蚊活性测定分别用灭菌水将JQD117菌株发酵液稀释成1×10⁸、0.5×10⁷、1×10⁶、0.5×10⁶、1×10⁵和0.5×10⁵cfu/ml六个浓度梯度的菌悬液，每个生测盒加入10mL菌悬液,放入30头试虫，设置3个重复，以灭菌水做对照，放入28℃培养箱中，24h后调查死亡数，计算死亡率。

JQD117菌株对白纹伊蚊2龄幼虫24h的LC₅₀值为4.215×10⁶cfu/ml(详见表3)。

表4苏云金芽孢杆菌JQD117菌株对白纹伊蚊毒力测定

Claims

1.一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其菌株定名为JQD117，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9763。

2.一种如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在防治蚊类害虫中的应用。

3.一种包含如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌的组合物。

4.一种包含如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌的农药制剂。

5.根据权利要求4所述的农药制剂，其特征在于，所述农药制剂用于防治蚊类害虫。

6.根据权利要求5所述的农药制剂，其特征在于，所述农药制剂用于防治眼蕈蚊(Sciaridae)、按蚊(Anopheles)和伊蚊(Aedes)中的至少一种。

7.一种以权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌为受体菌的工程菌。