CN105829889A - 用于测定多价、多特异性分子的生物活性的基于spr的桥接测定法 - Google Patents

用于测定多价、多特异性分子的生物活性的基于spr的桥接测定法 Download PDF

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Abstract

本文报道了二价、双特异性抗体的结合测定法用于测定二价、双特异性抗体的生物活性的用途，所述二价、双特异性抗体具有与其抗原相互作用较小的KD值(解离常数)，所述抗原将该二价、双特异性抗体固定至固体表面。

Description

用于测定多价、多特异性分子的生物活性的基于SPR的桥接测定法
本文报道了改进的用于测定多特异性、多价(例如双特异性、二价)分子的生物活性的桥接测定法的设置，其中在低聚副产物的存在下测定法的特异性和稳定性增加。
背景技术
用于测定单特异性抗体的生物活性的测定法是众所周知的。不同的测定法设置是已知的，如，例如通过固定的抗原(直接或间接地固定于固相)捕获抗体和通过标记的抗Fc抗体检测抗原-抗体复合体，或通过固定的抗体(直接或间接地固定于固相)捕获抗原和通过结合抗原上不同的非重叠表位的标记的抗体检测抗体-抗原复合体。
生物活性测定法是根据测试系统的特异性的、功能性的生物反应测量测试物质的生物活性的分析方法。可以使用基于动物的体内测定法、基于细胞的体外测定法或(受体)结合测定法来评估生物活性。
表面等离子体共振(SPR)是一种公知的测定单特异性抗体的抗体-抗原相互作用的技术。该技术可用于测定抗体对其各自抗原的结合亲和性。
在WO2011/117329中报道了双特异性、二价抗VEGF/抗ANG2抗体。
在WO2009/080251中报道了二价、双特异性抗体。在US2011/0293613中报道了双特异性抗体。在WO2010/040508中报道了双特异性抗VEGF/抗ANG2抗体。Schaefer,W.,等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)11187-11192)报道了免疫球蛋白结构域交叉用作生产双特异性IgG抗体的一般方法。
发明内容
已经发现，使用如以上概述的一般原则而不考虑如本文报道的发现的测定生物活性的测定法，对于多价、多特异性抗体(如二价，双特异性抗体)的“功能性”多聚体是敏感的，即二聚体、三聚体、四聚体和更高阶的聚集体，原因是基于亲合力的多聚体结合。
如本文所报道的一个方面是具有与其抗原相互作用的较小(较低)kD值(解离常数)的多价、多特异性抗体的结合位点用于测定多价、多特异性抗体生物活性(即与抗原的功能性结合)的(体外)用途，其中抗原将多特异性、多价抗体固定于固体表面。
在一个实施方案中，通过测定与抗原的(桥接)结合信号测定生物活性，多价、多特异性抗体对于该抗原具有更大(更高)的Kd值(解离常数)。
在一个实施方案中，生物活性是结合亲和性。
在一个实施方案中，通过表面等离子体共振或ELISA测定(桥接)结合信号。
在一个实施方案中，多价、多特异性抗体选自二价、双特异性抗体，三价、三特异性抗体，四价、四特异性抗体，三价、双特异性抗体，和四价、三特异性抗体。在一个实施方案中，多价、多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
如本文所报道的一个方面是二价、双特异性抗体与其第一和第二抗原的同时结合在表面等离子体共振或ELISA方法中的用途，其中，第一抗原作为捕获试剂固定在固体表面，和其中二价、双特异性抗体具有的与第一抗原相互作用的KD值小于与第二抗原相互作用的KD值，用于降低在表面等离子体共振或ELISA方法中二价、双特异性抗体的功能性多聚体形式的干扰。
在一个实施方案中，固体表面是表面等离子体共振芯片。
在一个实施方案中，第一抗原是二聚体或三聚体或四聚体。
在一个实施方案中，功能性多聚体是功能性二聚体。
在一个优选的实施方案中，第一抗原是二聚体或三聚体或四聚体和功能多聚体是功能性二聚体。
在一个实施方案中，具有与其抗原相互作用更高的kD值的结合位点的KD值，是具有较小KD值的二价、双特异性抗体的结合位点的KD值的至少1.1倍高。
在一个实施方案中，KD值是至少10倍高。
在一个实施方案中，KD值是至少100倍高。
如本文所报道的一个方面是多价、多特异性抗体与其第一和第二抗原同时结合(的桥接信号)用于多价、多特异性抗体的生物活性测定的(体外)用途，所述生物活性即与抗原的功能性结合，
其中多价、多特异性抗体的生物活性从与其第二抗原得到的(桥接)结合信号中导出，
其中与第二抗原的(桥接)结合信号通过表面等离子体共振或ELISA测定，其中第一固定抗原作为在固体表面上的捕获试剂，和
其中多价、多特异性抗体具有的与第一抗原相互作用的KD值(解离常数)小于与第二抗原相互作用的KD值(解离常数)。
在一个实施方案中，多价、多特异性抗体选自二价、双特异性抗体，三价、三特异性抗体，四价、四特异性抗体，三价、双特异性抗体，和四价、三特异性抗体。在一个实施方案中，多价、多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测定(桥接)结合信号。
如本文所报道的一个方面是多价、多特异性抗体与其第一和第二抗原的同时结合用于测定生物活性的(体外)用途，即多价、多特异性抗体与第一和第二抗原同时功能性结合，以减少来自多价、多特异性抗体的多聚体形式的干扰，
由此多价、多特异性抗体的生物活性从与其第二抗原得到的(桥接)结合信号中导出，
由此与第二抗原的(桥接)结合信号通过表面等离子体共振或ELISA测定，其中第一固定抗原作为在固体表面上的捕获试剂，和
由此多价、多特异性抗体具有的与第一抗原相互作用的KD值(解离常数)小于与第二抗原相互作用的KD值(解离常数)。
在一个实施方案中，多价、多特异性抗体选自二价、双特异性抗体，三价、三特异性抗体，四价、四特异性抗体，三价、双特异性抗体，和四价、三特异性抗体。在一个实施方案中，多价、多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测定(桥接)结合信号。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，基于二价、双特异性抗体与其第二抗原的结合测定多价、多特异性抗体与其第一和第二抗原同时结合的结合信号。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，固体表面是表面等离子体共振芯片或多孔板的孔壁。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，具有与其抗原相互作用的更大(更高)kD值(解离常数)的结合位点的KD值(解离常数)，是具有较小(较低)KD值(解离常数)的多价、多特异性抗体的结合位点的KD值(解离常数)的至少1.1倍大(高)。在一个实施方案中，KD值(解离常数)是至少1.5倍大(高)。在一个实施方案中，KD值(解离常数)是至少2倍大(高)。在一个实施方案中，KD值(解离常数)是至少10倍大(高)。在一个实施方案中，KD值(解离常数)是至少100倍大(高)。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，第一抗原是二聚体或三聚体或四聚体或容易聚集。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，功能性多聚体是功能性二聚体。
如本文所报道的一个方面是用于测定多价、多特异性抗体的生物活性的(体外)方法，所述生物活性即与抗原的功能性结合，包括以下步骤：
-测定多价、多特异性抗体与其第一和第二抗原同时结合的(桥接)结合信号，
由此多价、多特异性抗体的生物活性从与其第二抗原得到的(桥接)结合信号中导出，
由此与第二抗原的(桥接)结合信号通过表面等离子体共振或ELISA测定，其中第一固定抗原作为在固体表面上的捕获试剂，和
由此多价、多特异性抗体具有的与第一抗原相互作用的KD值(解离常数)小于与第二抗原相互作用的KD值(解离常数)。
在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测定(桥接)结合信号。
在一个实施方案中，多价、多特异性抗体选自二价、双特异性抗体，三价、三特异性抗体，四价、四特异性抗体，三价、双特异性抗体，和四价、三特异性抗体。在一个实施方案中，多价、多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
如本文所报道的一个方面是用于降低多价、多特异性抗体的生物活性测定中来自多价、多特异性抗体的功能多聚体形式的干扰的(体外)方法，所述生物活性即多价、多特异性抗体的功能性结合，包括以下步骤：
-测定多价、多特异性抗体与其第一和第二抗原同时结合的(桥接)结合信号，
由此多价、多特异性抗体的生物活性从与其第二抗原得到的(桥接)结合信号中导出，
由此与第二抗原的(桥接)结合信号通过表面等离子体共振或ELISA测定，其中第一固定抗原作为在固体表面上的捕获试剂，和
由此多价、多特异性抗体具有的与第一抗原相互作用的KD值(解离常数)小于与第二抗原相互作用的KD值(解离常数)。
在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测定(桥接)结合信号。
在一个实施方案中，多价、多特异性抗体选自二价、双特异性抗体，三价、三特异性抗体，四价、四特异性抗体，三价、双特异性抗体，和四价、三特异性抗体。在一个实施方案中，多价、多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
如本文所报道的一个方面是用于确定样本中多价、多特异性抗体的功能性多聚体的存在的(体外)方法，包括以下步骤
-比较使用其中第一抗原被固定并用于捕获多价、多特异性抗体的测定法所测定的多价、多特异性抗体的生物活性(即结合信号)，与使用其中第二抗原被固定并用于捕获多价、多特异性抗体的相同测定法所测定的多价、多特异性抗体的生物活性(即结合信号)，
由此，如果所测定的生物活性(即结合信号)的差异超过所实施的测定法的标准偏差，则确定存在多价、多特异性抗体的功能性多聚体。
在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测定(桥接)结合信号。
在一个实施方案中，多价、多特异性抗体选自二价、双特异性抗体，三价、三特异性抗体，四价、四特异性抗体，三价、双特异性抗体，和四价、三特异性抗体。在一个实施方案中，多价、多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，基于二价、双特异性抗体与其第二抗原的结合测定二价、双特异性抗体与其第一和第二抗原同时结合的结合信号。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，固体表面是表面等离子体共振芯片。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，第一抗原是二聚体或三聚体或四聚体或容易聚集。
在之前所有方面和实施方案的一个实施方案中，功能性多聚体是功能性二聚体。
发明的详细说明
已经发现，使用不考虑本文中报道的发现的原则之测定生物活性的测定法对多价、多特异性抗体的“功能性”多聚体是敏感的，即功能性二聚体、功能性三聚体、功能性四聚体和功能性更高阶聚集体，原因是基于亲和力的多聚体结合。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于，单克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
抗体的“类”指的是其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2分子。对应于免疫球蛋白不同类的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即该群所包含的各抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，包含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生的，此类变体一般以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从抗体的基本上同质群中获得的抗体的特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了这样的用于制备单克隆抗体的方法和其他示例性方法。
在某些实施方案中，抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对第一抗原，另一个是针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，多特异性抗体可结合相同抗原的两个不同表位。多特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达抗原的细胞。多特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段来制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540,WO93/08829,和Traunecker,A.,等人,EMBOJ.10(1991)3655-3659)，和“knob-in-hole”工程化(参见，例如，US5,731,168)。也可以通过如下制备多特异性抗体：工程化用于制造抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效果(WO2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，美国4,676,980，和Brennan,M.,等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(见，例如，Kostelny,S.A.,等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(见，例如，Holliger,P.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(sFv)二聚体(见，例如，Gruber,M.,等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和制备三特异性抗体，如，例如，在Tutt,A.,等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述。
该抗体或片段也可以是如WO2009/080251,WO2009/080252,WO2009/080253,WO2009/080254,WO2010/112193,WO2010/115589,WO2010/136172,WO2010/145792或WO2010/145793中所述的多特异性抗体。
双特异性抗体通常是特异性结合相同抗原上两个不同的、非重叠表位的抗体分子或特异性结合不同抗原上的两个表位的抗体分子。
不同的双特异性抗体形式是已知的。
如本文所报道的方法中可以使用的示例性双特异性抗体形式是
-Crossmab形式(＝Crossmab)：包含特异性结合第一表位或抗原的第一结合位点和特异性结合第二表位或抗原的第二结合位点的全长IgG抗体，由此各个链如下
-轻链1(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-轻链2(可变轻链结构域+重链CH1结构域)
-重链1(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+CH3，带有臼突变)
-重链2(可变重链结构域+轻链κ恒定结构域+铰链+CH2+CH3，带有杵突变)；
-一个臂的单链形式(＝一个臂的单链抗体)：包含特异性结合第一表位或抗原的第一结合位点和特异性结合第二表位或抗原的第二结合位点的抗体，从而各个链如下
-轻链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-组合的轻/重链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域+G4S-接头+可变域重链+CH1+铰链+CH2+CH3，带有杵突变)
-重链(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+CH3，带有臼突变)；
-双臂的单链形式(＝双臂的单链抗体)：包含特异性结合第一表位或抗原的第一结合位点和特异性结合第二表位或抗原的第二结合位点的抗体，从而各个链如下
-组合的轻/重链1(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域+G4S-接头+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+CH3，带有臼突变)
-组合的轻/重链2(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域+G4S-接头+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+CH3，带有杵突变)；
-普通轻链双特异性形式(＝普通轻链双特异性抗体)：包含特异性结合第一表位或抗原的第一结合位点和特异性结合第二表位或抗原的第二结合位点的抗体，从而各个链如下
-轻链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-重链1(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+CH3，带有臼突变)
-重链2(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+CH3，带有杵突变)。
在一个实施方案中，二价、双特异性抗体是Crossmab。
在一个实施方案中，二价、双特异性抗体是一个臂的单链抗体。
在一个实施方案中，二价、双特异性抗体是双臂的单链抗体。
在一个实施方案中，二价、双特异性抗体是普通的轻链双特异性抗体。
术语“功能性多聚体”指多价、多特异性抗体的非共价复合体或聚集体，其中每个多价、多特异性抗体分子保持其结合特异性，即仍然可以结合其抗原。例如，“功能性二聚体”是由多价、多特异性抗体的两个分子组成的非共价复合体，其中每个结合位点保持其结合特异性和结合能力，即，例如二价、双特异性抗体的功能性二聚体总计包含四个结合位点，其中每两个结合相同抗原和所有四个结合位点都是功能性的。但是，如果抗体是作为功能性多聚体存在，所有抗体分子可以在同一时间结合到固定的抗原分子(用于捕获多价、多特异性抗体)。与单体分子相比，这增加了功能性多聚体的复合体稳定性，反过来，在测定过程中较不稳定的单体分子可能解离。这导致相对于样品的初始状态，存在显著降低的单体分子的量。由于复合体的检测基于与多价、多特异性抗体的第二结合特异性(其不是用于捕获抗体的)的相互作用，捕获的固定的功能性二聚体将导致增加的测定读数(参见图1)。
例如，如果更不稳定的复合体相互作用被固定，在测试的抗体制剂中功能性多聚体(二聚体)级分的变化导致不同的测定读数。因此，测定多价、多特异性抗体生物活性的测定法，对亲合力驱动的生物活性的表观(apparent)增加敏感。
用于测量测试物质的生物活性的分析方法基于测试系统的特异性、功能性的生物反应。
术语“生物测定法”表示基于测试系统的特异的、功能性生物反应测定测试物质(例如，抗体)的生物活性的分析方法。生物活性可以使用基于动物的体内测定法、基于细胞的体外测定法、或(受体)结合测定法进行评估。在一个实施方案中，术语“生物活性”是指测试物质结合其相互作用的配偶体。在双特异性抗体的情况下，术语“生物活性”是指抗体结合其各自的抗原，或者单独测定(即，对各抗原单独测定)，或同时测定(即，在桥接测定法中同时测定两个抗原)。
特异性是在可预期存在的干扰成分存在下明确评估分析物的能力。典型地，这些干扰成分可能包括杂质、降解产物(如改性的分析物、分析物的片段、或分析物的聚集体)、基质成分(例如，来自血清)、副产物(如分析物的多聚体)等。
多价、多特异性抗体特异性结合不同的靶标，最有可能对每个靶标具有不同的亲和性和复合体稳定性(complexstabilities)。只有完全活性的多价、多特异性抗体可结合所有靶标，并在相应的测定法中示出完全生物活性。
术语“价”是指抗体对抗原的不同结合位点的数目。单价抗体包含对抗原的一个结合位点。二价抗体包含对相同抗原的两个结合位点。
包含多特异性分子(抗体)首先与固定靶标#1(其第一抗原)结合，和其次从溶液中募集靶标#2(其第二抗原)至靶标#1/多特异性分子复合体(抗原#1/多特异性抗体复合体)的测定法设计，以一个活性读数覆盖二个结合事件(桥接法、桥接结合信号)。
多特异性分子的潜在副产物是分子的多聚体形式，如，例如二聚体、三聚体、四聚体和更高阶聚集体。如果多聚体形式还可以结合两个靶标，则与每个靶标的结合是多价而不是单价(＝功能性多聚体)。
术语“结合亲和性”是指单个结合位点与其各自靶标相互作用的强度。实验中，亲和性可以通过例如测量在平衡中抗体和抗原的结合动力学常数(KA)和解离动力学常数(KD)而确定(参见图2)。
术语“结合亲合力”是指一个分子(抗体)的多结合位点与相同靶标相互作用的组合强度。这样，亲合力是键亲和性的组合协同强度，而不是键的总和(参照图3)。对于亲和力的要件是：
-针对一个靶标(抗原)的分子(如抗体)的多价性，或功能性多聚体的多价性，
-在一个可溶性靶标上的多个可接近表位或抗体与不同固定的靶标上的各表位的多结合。
复合体结合在affine结合和avid结合之间并没有差异。然而，avid结合的复合体解离依赖于涉及的所有结合位点的同时解离(见图4)。因此，由avid结合导致的结合强度的增加(相对于affine结合)依赖于解离动力学/复合体稳定性：
-复合体稳定性越大(越高)，涉及的所有结合位点同时解离的可能越低；对于非常稳定的复合体，affine结合与avid结合的差异基本上变成零；
-复合体稳定性越小(越低)，涉及的所有结合位点同时解离的可能越大；affine结合与avid结合的差异增加。
已发现，含有多价、多特异性(例如二价、双特异性抗体)抗体的制剂中存在的这种抗体的功能性多聚体(例如二聚体)，影响测定多价、多特异性抗体的生物活性的测定法的结果(见图1)。如果不使用如本文中所报道的某些框架规则，功能性多聚体(二聚体)导致测定多价、多特异性抗体的生物活性之测定法的不正确的(桥接)结合信号读数。
已发现，测定多价、多特异性抗体(例如，二价、双特异性抗体)生物活性的测定法(例如，基于SPR的测定法)，不受多价、多特异性抗体的功能性多聚体(二聚体)存在的影响，条件是：
i)多价、多特异性抗体的两个(不同)结合功能/特异性，同时在产生测定读数/信号(桥接结合信号)中使用或用于产生测定读数/信号(桥接结合信号)，
ii)使用与抗体具有更稳定的相互作用的抗原捕获抗体(即，抗原与抗体具有更稳定的相互作用，反之亦然，具有与其抗原相互作用的较小KD值(解离常数)的抗体的结合特异性用于固定/捕获该抗体，由此该抗原固定在固相上)，导致高的抗原/抗体复合体的稳定性，因此，降低/消除对功能性多聚体的敏感性，
ⅲ)使用桥接结合信号(即，通过抗体与两个抗原均结合所产生的信号)作为读数，因为该信号依赖于抗体与两个抗原的同时相互作用。
更详细地，与单体、多价、多特异性抗体类似地，功能性多聚体(二聚体)以不同的复合体稳定性结合两个靶标。功能性多聚体(二聚体)每个定义为多价的(二价)。
使用桥接形式的测定多价、多特异性抗体生物活性的测定法，可以使用两个不同的取向设置：靶标#1或靶标#2中的任一可被固定于表面上，和从溶液中募集未固定的第二靶标至靶标/多特异性分子复合体。根据相互作用的强度和由此形成的复合体的稳定性决定测定法读数的不同(参见图5)。
已发现，该测定法设置对测定存在功能性多聚体的多价、多特异性抗体的生物活性的测定法的特异性和稳定性有强烈的影响：
-如果具有较小(较低)的复合体稳定性的相互作用被用于捕获抗体，即，用于表面上，则相对于亲和性驱动的结合，亲合力驱动的结合的影响变大；这过度强调了功能性多聚体(例如二聚体)，测定法对多价、多特异性抗体特异性较低或完全不适合；这可以通过分析多特异性分子和功能性多聚体的混合物显示：在这种情况下，生物活性的读数是超比例的(即，1％多聚体导致检测到超过(>)1％生物活性的增加)；(见图6)；
-如果具有较大(较高)的复合体稳定性的相互作用被用于捕获抗体，即，用于表面上，则相对于亲和性驱动的结合，亲合力驱动的结合的影响变小；这没有过度强调功能性多聚体，测定法对多价、多特异性抗体更特异；在这种情况下，生物活性的读数是成比例的(即，1％多聚体导致检测到大约1％生物活性的增加)；(见图7)。
已发现，低复合体稳定性用于捕获抗体，即，用于表面上，导致过度强调功能性多聚体的检测信号。
已发现，高复合体稳定性用于捕获抗体，即，用于表面上，导致没有过度强调功能性多聚体的检测信号。
除了可以测定多价、多特异性抗体生物活性方面的读数，还可以测定多价、多特异性抗体对固定抗原的各自的生物活性的读数。
除了可以测定多价、多特异性抗体生物活性方面的读数，还可以测定多价、多特异性抗体对桥接抗原的各自的生物活性的读数，假设影响与任何抗原结合的修饰彼此独立地发生，且假设所有抗体结合两个抗原。
在图9示出了ELISA测定法(如图8所示设置)结果的示例性比较，其依赖于递增浓度的功能性多聚体的测定法设置(通过将功能性多聚体掺入(spiking)二价、双特异性抗体的样品中获得样品)。多价、多特异性抗体与靶标#1的相互作用比与靶标#2的相互作用更强(与靶标#1相互作用的KD值(解离常数)比与靶标#2相互作用的KD值小)。可以看出使用固定靶标#2(用作捕获试剂)的测定法取向显示出对功能性多聚体增加的敏感性(斜率大于1)，而用固定靶标#1的取向没有显示出随着功能性多聚体浓度的增加的差异。
在图11示出了基于SPR测定法(如图10所示设置)结果的示例性比较，其依赖于递增浓度的功能性多聚体的测定法设置(通过将功能性多聚体掺入二价、双特异性抗体的样品中获得样品)。多价、多特异性抗体与靶标#1的相互作用比与靶标#2的相互作用更强(与靶标#1相互作用的KD值(解离常数)比与靶标#2相互作用的KD值小)。可以看出使用固定靶标#1的测定法取向没有显示出随着功能性多聚体浓度的增加的差异。
使用SPR允许实时测定生物活性。
这样的桥接测定法和使用如本文所报道的基础发现的测定多价、多特异性抗体的生物活性的测定法，是基于以下效果：通过使用具有更高复合体稳定性的相互作用，即更小的KD值(解离常数)，用于捕获抗体的测定法对功能性多聚体(二聚体、三聚体、四聚体、或低聚体)不敏感。总的读数(＝桥接结合信号；图12，信号R2(8))取决于多价、多特异性抗体的两个相互作用并覆盖多价、多特异性抗体的两个功能。
在使用SPR的情况下，传感图除了桥接信号外，还具有另外的读数：与固定抗原的结合信号给予定量能够与固定的第一抗原结合的分子的机会(图12中，信号R2(8))。可以计算所有浓度的相对结合信号，和可以使用平均相对反应评价多价、多特异性抗体与其第一抗原的结合活性。以这种方式，有可能获得与第一抗原的个别活性顺便获得整体结合活性。
提供了以下实施例和附图来帮助理解本发明，本发明真正的范围列于所附的权利要求中。可以理解可以修改阐述的步骤而不脱离本发明的精神。
附图说明
图1二价、双特异性抗体的功能性二聚体(作为功能性多聚体的例子)的存在对测定结果的影响。
图2抗体亲和性；白箭头：事件的顺序；黑箭头：读数是基于这种差异。
图3抗体亲和力；白箭头：事件的顺序；黑箭头：读数是基于这种差异。
图4抗体亲和性和抗体亲和力的比较。
图5具有低和高复合体稳定性(高和低KD值)的抗体相互作用的比较。
图6在表面上的低复合体稳定性导致测定法信号过度强调功能性低聚体。
图7在表面上的高复合体稳定性没有过度强调功能性低聚体。
图8图示ELISA桥接测定法。
图9在ELISA中，掺入功能性多聚体的二价、双特异性抗体对测定法取向的影响的比较；(A)靶标#1固定；(B)靶标#2固定。
图10图示基于SPR桥接测定法。
图11掺入功能性多聚体的二价、双特异性抗体对基于SPR的测定法的影响。
图12从传感图获得桥接信号；1：出现第一抗原并固定到传感器表面；2：二价、双特异性抗体结合开始；3：二价、双特异性抗体结合停止；4：第二抗原结合开始；5：第二抗原结合停止；6：报告点桥接信号；7：R1；8：R2；9：传感器芯片再生。
图13传感图可以被翻译成基于浓度的函数；(A)传感图覆盖测定的0.35-30μg/ml双特异性、二价抗体(1：1.5稀释系列)；(B)桥接信号(R2)(第二抗原)；(C)信号(R1)(第一抗原)。
实施例1
一般测定法设置
基于表面等离子体共振的测定法(基于SPR的测定法)
该方法是使用BIAcore技术(GEHealthcare)基于SPR的测定法。在第一步骤中，VEGF被固定到CM5传感器芯片。第二，在规定浓度范围内注射抗ANG2/VEGF二价、双特异性抗体。第三，注射人类ANG2(受体结合结构域RBD)。人类ANG2注射后获得的结合反应(共振单位，RU，参见图12)与结合VEGF和ANG2二者的抗ANG2/VEGF抗体的量相关联(ANG2相关桥接信号R2(8)是生物活性计算的基线；VEGF结合信号R1(7)不考虑；参见图12)，并针对使用的抗体浓度范围作图(参见图13)。通过适当的计算机软件(例如XLfit4，IDBS软件)分析所得的线性图，其拟合2-参数线性，因此允许将y轴截距的测定作为生物活性的读数。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
在第一步骤中，人类ANG2被固定在微滴定板上(NuncMaxisorb-MTP)。第二，抗ANG2/VEGF二价、双特异性抗体加到规定浓度范围内的固定的人类ANG2。第三，加入恒定量的人类VEGF。第四，预孵育后，加入小鼠抗VEGF抗体和山羊抗小鼠IgG抗体-POD缀合物(POD＝辣根过氧化物酶)的复合体。最后，加入2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸，ABTS)并在规定的时间后，通过加入磷酸停止反应。用ELISA读数器测量发色ABTS信号。吸光度信号与结合人类ANG2和人类VEGF二者的二价、双特异性抗体的量相关联，并针对使用的抗体浓度作图。XLfit4(IDBS软件)分析该S形图，其拟合4-参数逻辑曲线，因而允许将EC50值的测定作为生物活性的读数。
实施例2
二价、双特异性抗-ANG2/VEGF抗体的结合性质
由表面等离子体共振(SPR)分析表征结合特性
通过使用BIAcoreT100仪器(GEHealthcareBiosciencesAB,Uppsala,Sweden)采用表面等离子体共振(SPR)证实了同时结合两种抗原。使用标准胺偶联化学法将VEGF固定到CM5传感器芯片上。在第一步骤中，在25℃下注射HBS缓冲液(10mMHEPES，150mMNaCl，0.05％Tween20，pH7.4)中浓度10μg/ml的二价、双特异性抗体。抗体与固定的VEGF结合后，在第二步骤中注射10μg/ml的人类ANG2。
在进一步的实验中，测定了二价、双特异性抗体的亲和性和结合动力学。简言之，将山羊抗huIgG-Fcgamma多克隆抗体通过胺偶联固定在CM4芯片上，用于提呈针对ANG2和VEGF的双特异性抗体。在25℃或37℃在HBS缓冲液中测量结合。纯化的ANG2-His或VEGF以0.37nM至30nM之间，或者3.7nM和200nm之间的各种浓度加入到溶液中。通过3分钟的注射测量结合性；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面10分钟测量解离，使用1：1Langmuir结合模型估计KD值。由于ANG2制剂的异质性，没有观察到1:1结合。因此KD值是表观值。测定的二价、双特异性抗体对VEGF的亲和性极高，所计算的解离速率(off-rate)超出了BIAcore说明的规格，即使在37℃。在表1中总结了两种抗原的解离速率。
表1：结合ANG2和VEGF的动力学参数
分析物 表观kD(1/s)
ANG2 6.3*10-04
VEGF <1*10-06
定量二价、双特异性抗体的结合活性的测定法
除了基于SPR的分析，还建立了ELISA来测定活性的二价、双特异性抗体的结合。在该测定法中，在第一步骤中人类ANG2直接包被到Maxisorb微量滴定板(MTP)的孔中。同时，样品/参照标准(二价、双特异性抗体)在另一MTP的孔中与地高辛化的VEGF预温育。预孵育和包被后，通过洗涤ANG2包被的MTP除去过量的未结合ANG2。然后将二价、双特异性抗体和VEGF-Dig的预孵育混合物转移到人ANG2包被的MTP中并孵育。孵育后，通过洗涤除去过量预孵育溶液，然后与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。该抗体-酶缀合物催化底物的显色反应。由ELISA读取器在405nm波长下测量该信号(参考波长：490nm([405/490]nm)。

Claims (12)

1.二价、双特异性抗体与其第一和第二抗原的同时结合在表面等离子体共振或ELISA方法中的用途，用于降低在表面等离子体共振或ELISA方法中二价、双特异性抗体的功能性多聚体形式的干扰，其中，第一抗原作为捕获试剂固定在固体表面，和其中二价、双特异性抗体具有的与第一抗原相互作用的KD值小于与第二抗原相互作用的KD值。
2.根据权利要求1所述的用途，其中固体表面是表面等离子体共振芯片。
3.根据权利要求1至2任一项所述的用途，其中第一抗原是二聚体或三聚体或四聚体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中功能性多聚体是功能性二聚体。
5.根据权利要求1至4任一项所述的用途，其中具有与其抗原相互作用的更高kD值的结合位点的KD值，是具有较小KD值的二价、双特异性抗体的结合位点的KD值的至少1.1倍高。
6.根据权利要求5所述的用途，其中KD值是至少10倍高。
7.根据权利要求5至6任一项所述的用途，其中KD值是至少100倍高。
8.一种用于确定样本中二价、双特异性抗体的功能性多聚体的存在的方法，包括以下步骤
-比较使用其中第一抗原被固定并用于捕获二价、双特异性抗体的测定法测定的二价、双特异性抗体的结合信号，与使用其中第二抗原被固定并用于捕获二价、双特异性抗体的相同测定法测定的二价、双特异性抗体的结合信号，
由此，如果所测定的结合信号的差异超过所实施的测定法的标准偏差，则确定存在二价、双特异性抗体的功能性多聚体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中基于二价、双特异性抗体与其第二抗原的结合测定二价、双特异性抗体与其第一和第二抗原同时结合的结合信号。
10.根据权利要求8至9任一项所述的方法，其中固体表面是表面等离子体共振芯片。
11.根据权利要求8至10任一项所述的方法，其中第一抗原是二聚体或三聚体或四聚体。
12.根据权利要求8至11任一项所述的方法，其中功能性多聚体是功能性二聚体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109791149A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 豪夫迈·罗氏有限公司 用于功能分析多特异性分子的基于spr的双重结合测定法
CN113227789A (zh) * 2018-12-30 2021-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 基于pH梯度SPR的结合测定

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3253788A4 (en) 2015-02-06 2018-08-08 Cell IDX, Inc. Antigen-coupled immunoreagents
WO2017097918A1 (en) * 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining the in vivo interaction mode
WO2018017604A1 (en) * 2016-07-18 2018-01-25 Cell Idx, Inc. Reagent compounds, compositions, kits, and methods for amplified assays
US10871485B2 (en) 2018-04-13 2020-12-22 Rarecyte, Inc. Kits for labeling of biomarkers and methods of using the same
JP7249432B2 (ja) * 2019-03-29 2023-03-30 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 多価分子の機能分析のための、ｓｐｒをベースとする結合アッセイ
CN114088947B (zh) * 2021-11-08 2023-10-13 上海药明生物医药有限公司 一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法
WO2023094282A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantification of low amounts of antibody sideproducts

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010040508A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
WO2011117329A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific, bivalent anti-vegf/anti-ang-2 antibodies

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS62509B1 (sr) * 2012-07-13 2021-11-30 Roche Glycart Ag Bispecifična anti-vegf/anti-ang-2 antitela i njihova upotreba u lečenju očnih vaskularnih bolesti

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010040508A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
CN102753577A (zh) * 2008-10-08 2012-10-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗-vegf/抗-ang-2抗体
WO2011117329A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific, bivalent anti-vegf/anti-ang-2 antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHAEFER W. ET AL: "Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies", 《PROC. NATL. ACAD. SCI.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109791149A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 豪夫迈·罗氏有限公司 用于功能分析多特异性分子的基于spr的双重结合测定法
CN113227789A (zh) * 2018-12-30 2021-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 基于pH梯度SPR的结合测定

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