JP2016540212A - 多価多重特異性分子の生物学的活性を決定するためのsprベースの架橋アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
単一特異性抗体の生物学的活性を決定するためのアッセイは周知である。例えば、
・固定化された(固相に直接または間接的に固定化された)抗原を介した抗体の捕捉、および標識された抗Fc抗体による抗原-抗体複合体の検出、または
・固定化された(固相に直接または間接的に固定化された)抗体を介した抗原の捕捉、および抗原の異なる非重複エピトープに結合する標識された抗体による抗体-抗原複合体の検出
などの、異なるアッセイ構成が知られる。
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、その第2の抗原により得られた(架橋)結合シグナルに由来し、
第2の抗原による(架橋)結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)より小さい、第1の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)を有する。
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、その第2の抗原により得られた(架橋)結合シグナルに由来し、
第2の抗原による(架橋)結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)より小さい、第1の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)を有する。
多価多重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための(架橋)結合シグナルを決定する段階であって、
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、第2の抗原により得られた(架橋)結合シグナルに由来し、
第2の抗原による(架橋)結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)より小さい、第1の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)を有する、段階。
多価多重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための(架橋)結合シグナルを決定する段階であって、
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、その第2の抗原により得られた(架橋)結合シグナルに由来し、
第2の抗原による(架橋)結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)より小さい、第1の抗原との相互作用のためのkD値(解離定数)を有する、段階。
第1の抗原が固定化され、かつ多価多重特異性抗体の捕捉のために使用されるアッセイを用いて、多価多重特異性抗体に関して決定された生物学的活性、すなわち結合シグナルを、第2の抗原が固定化され、かつ多価多重特異性抗体の捕捉のために使用される同アッセイを用いて、多価多重特異性抗体に関して決定された生物学的活性、すなわち結合シグナルと比較する段階であって、
決定された生物学的活性、すなわち結合シグナルが、行われたアッセイの標準偏差を上回って異なるかどうかで、多価多重特異性抗体の機能的多量体の存在が決定される、段階。
本明細書に報告される発見を考慮に入れない原理を用いて生物学的活性を決定するためのアッセイは、多価多重特異性抗体の「機能的」多量体、すなわち機能的二量体、機能的三量体、機能的四量体、およびより高次の機能的集合体に対し、この多量体の結合に基づく結合力が理由で、感受性であることが見出されている。
- クロスマブ(crossmab)形態(=クロスマブ):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、全長IgG抗体であって、個々の鎖が、
- 軽鎖1(可変軽鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン)
- 軽鎖2(可変軽鎖ドメイン+重鎖CH1ドメイン)
- 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異(hole mutation)を有する)
- 重鎖2(可変重鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異(knob mutation)を有する)
である;
- 1アーム単鎖形態(=1アーム単鎖抗体):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、抗体であって、個々の鎖が、
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン)
- 組み合わせた軽鎖/重鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン+G4S-リンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異を有する)
- 重鎖(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異を有する)
である;
- 2アーム単鎖形態(=2アーム単鎖抗体):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、抗体であって、個々の鎖が、
- 組み合わせた軽鎖/重鎖1(可変軽鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン+G4S-リンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異を有する)
- 組み合わせた軽鎖/重鎖2(可変軽鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン+G4S-リンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異を有する)
である;
- 共通軽鎖二重特異性形態(=共通軽鎖二重特異性抗体):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、抗体であって、個々の鎖が、
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖κ定常ドメイン)
- 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異を有する)
- 重鎖2(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異を有する)
である。
- 抗体などの分子の多価性、または1つの標的(抗原)に対する機能的多量体の多価性、
- 1つの可溶性標的の複数のアクセス可能なエピトープ、または抗体と様々な固定化された各標的の1つのエピトープとの複数の結合
である。
-複合体安定性が大きい(高い)ほど、関与する全ての結合部位の同時の解離の可能性は低くなる;非常に安定した複合体では、アフィン結合対アビド結合の差が本質的に零になる;
-複合体安定性が小さい(低い)ほど、関与する全ての結合部位の同時の解離の可能性は高くなる;アフィン結合対アビド結合の差は増加する。
i)多価多重特異性抗体の2つの(異なる)結合機能性/特異性が、アッセイ読み出し値/シグナル(架橋結合シグナル)の生成において/生成のために、同時に使用され、
ii)抗体捕捉のために、抗体とより安定した相互作用を有する抗原が使用されて(すなわち、抗体とより安定した相互作用を有する抗原、または逆もまた同じで、その抗原との相互作用に関してより小さいkD値(解離定数)を有する抗体の結合特異性が、抗原の固定化/捕捉のために使用され、それにより、この抗原が固相に固定化されて)、高い抗原/抗体複合体安定性を生じ、したがって、機能的多量体に対して感受性の減少/消失を生じ、
iii)読み出し値として、架橋結合シグナル、すなわち抗体の、2つの両抗原への結合によって生じるシグナルが、抗体と両抗原との同時の相互作用に依存することから、使用される。
- 小さい(低い)複合体安定性を有する相互作用が、抗体の捕捉のために使用される、すなわち表面上にある場合、親和性による結合と比較して、結合力による結合の影響が高くなる;これは、機能的多量体(例えば二量体)を過度に強調し、アッセイは、多価多重特異性抗体に対して、より特異性が低いか、または全く適合しない;これは、多重特異性分子と機能的多量体の混合物の分析によって示されることができる:この場合、生物学的活性の読み出し値は過度に大きい(over-proportional)(すなわち、1%の多量体は、1%を超える(>)、検出される生物学的活性の増加を生じる);(図6参照);
- 大きい(高い)複合体安定性を有する相互作用が、抗体の捕捉のために使用される、すなわち表面上にある場合、親和性による結合と比較して、結合力による結合の影響が低くなる;これは、機能的多量体を過度に強調することはなく、アッセイは、多価多重特異性抗体に対して、より特異性が高い;この場合、生物学的活性の読み出し値は比例的(proportional)である(すなわち、1%の多量体は、約1%の、検出される生物学的活性の増加を生じる);(図7参照)。
一般的アッセイの構成
表面プラズモン共鳴ベースのアッセイ(SPRベースのアッセイ)
本方法は、BIAcoreテクノロジー(GE Healthcare)を用いたSPRベースのアッセイに基づく。第一段階において、VEGFをCM5センサーチップに固定化した。第二に、抗ANG2/VEGF二価二重特異性抗体を規定された濃度範囲内で注入した。第三に、ヒトANG2(受容体結合ドメインRBD)を注入した。ヒトANG2の注入後に得られた結合反応(共鳴単位、RU、図12参照)は、VEGFおよびANG2の両方に結合した抗ANG2/VEGF抗体の量と相関するものであり(ANG2関連架橋シグナルR2(8)は生物学的活性の計算のためのベースである;VEGF結合シグナルR1(7)は考慮されない;図12参照)、使用された抗体濃度範囲に対してプロットされた(図13参照)。2次パラメトリック線にあてはめ、したがって生物学的活性の読み出し値としてy軸切片の決定を可能にする適切なコンピューターソフトウェア(例えば、XLfit4、IDBSソフトウェア)によって、得られた線形プロットを分析した。
第一段階において、ヒトANG2をマイクロタイタープレート(Nunc Maxisorb-MTP)に固定化した。第二に、抗ANG2/VEGF二価二重特異性抗体を、規定された濃度範囲内で固定化されたヒトANG2に添加した。第三に、一定量のヒトVEGFを添加した。第四に、マウス抗VEGF抗体およびヤギ抗マウスIgG抗体-POD複合体(POD=西洋ワサビペルオキシダーゼ)の複合体を、プレインキュベーション後に添加した。最後に、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸、ABTS)を添加し、規定された時間の後、リン酸の添加によって反応を停止させた。発色性ABTSシグナルをELISAリーダーによって測定した。吸光度シグナルは、ヒトANG2およびヒトVEGFの両方に結合した二価二重特異性抗体の量と関連するものであり、使用された抗体濃度に対してプロットされた。4次パラメトリックロジスティック曲線にあてはめ、したがって生物学的活性の読み出し値としてEC50の決定を可能にする、XLfit4(IDBSソフトウェア)によって、このシグモイドプロットを分析した。
二価二重特異性抗ANG2/VEGF抗体の結合特性
表面プラズモン共鳴(SPR)分析により特徴付けられる結合特性
両抗原の同時の結合を、BIAcore T100装置(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)を適用することによって確認した。VEGFを、標準的なアミンカップリング化学を用いてCM5センサーチップに固定化した。第一段階において、二価二重特異性抗体を、25℃でHBS緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、pH 7.4)中10μg/mlの濃度で注入した。抗体と固定化されたVEGFとの結合の後、第二段階においてヒトANG2を10μg/mlで注入した。
SPRベースの分析に加えて、ELISAが、活性二価二重特異性抗体の結合を決定するために確立された。このアッセイにおいて、ヒトANG2を、第一段階において、Maxisorbマイクロタイタープレート(MTP)のウエルに直接コートする。一方、試料/参照標準(二価二重特異性抗体)を、ジゴキシゲニル化VEGFと共に、別のMTPのウエル中でプレインキュベートした。プレインキュベーションとコーティングの後、ANG2でコートされたMTPを洗浄することによって、過剰な未結合ANG2を除去した。その後、二価二重特異性抗体とVEGF-Digのプレインキュベートされた混合物を、ヒトANG2でコートされたMTPに移動し、インキュベートした。インキュベーションの後、過剰なプレインキュベーション溶液を洗浄によって除去し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。抗体-酵素複合体は、ABTS(登録商標)基質の呈色反応を触媒する。シグナルは、405 nm波長(参照波長:490 nm([405/490] nm))でELISAリーダーによって測定された。
Claims (12)
- 表面プラズモン共鳴またはELISA法における、二価二重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合の使用であって、該第1の抗原が、固体表面に捕捉試薬として固定化され、該二価二重特異性抗体が、該第2の抗原との相互作用のためのkD値より小さい該第1の抗原との相互作用のためのkD値を有する、表面プラズモン共鳴またはELISA法における、二価二重特異性抗体の機能的多量体形態の干渉を減少させるための使用。
- 固体表面が、表面プラズモン共鳴チップである、請求項1に記載の使用。
- 第1の抗原が、二量体、三量体、または四量体である、請求項1または2に記載の使用。
- 機能的多量体が、機能的二量体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- その抗原との相互作用のためのより高いkD値を有する結合部位のkD値が、より小さいkD値を有する二価二重特異性抗体の結合部位のkD値よりも、少なくとも1.1倍高い、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- kD値が、少なくとも10倍高い、請求項5に記載の使用。
- kD値が、少なくとも100倍高い、請求項5または6に記載の使用。
- 以下の段階を含む、試料中の二価二重特異性抗体の機能的多量体の存在を決定する方法:
第1の抗原が固定化され、かつ二価二重特異性抗体の捕捉のために使用されるアッセイを用いて、二価二重特異性抗体に関して決定された結合シグナルを、第2の抗原が固定化され、かつ二価二重特異性抗体の捕捉のために使用される同アッセイを用いて、二価二重特異性抗体に関して決定された結合シグナルと比較する段階であって、
決定された結合シグナルが、行われたアッセイの標準偏差を上回って異なるかどうかで、該二価二重特異性抗体の機能的多量体の存在が決定される、段階。 - 二価二重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための結合シグナルを決定する段階が、二価二重特異性抗体とその第2の抗原との結合に基づく、請求項8に記載の方法。
- 固体表面が、表面プラズモン共鳴チップである、請求項8または9に記載の方法。
- 第1の抗原が、二量体、三量体、または四量体である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 機能的多量体が、機能的二量体である、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
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SCHAEFER W. ET AL.: "Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodie", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 108, no. 27, JPN6018038749, 5 July 2011 (2011-07-05), pages 11187 - 11192, XP002654302, ISSN: 0003892248 * |
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