CN105784895B - 一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物质量测定方法技术领域，尤其涉及一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法。通过试样溶液准备、配制对照品溶液、配制供试品溶液等步骤，杂质色谱系统要求：用高效液相色谱仪对对照品溶液进行色谱定位，杂质与杂质之间分离度＞1.5，以及杂质与主成分之间分离度＞1.5；连续测定5次对照品溶液，主成分峰峰面积的RSD值≤5.0%，即为色谱系统合格。本发明中的检测方法能够在同样的色谱条件下，全面检测左西孟旦中杂质，保障产品的品质；操作简单，时间快，精确度高，数据稳定，成本降低。

Description

一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法

技术领域

本发明属于药物质量测定方法技术领域，尤其涉及一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法。

背景技术

左西孟旦（Levosimendan）是钙增敏剂，以钙离子浓度依赖的方式与心肌肌钙蛋白C结合而产生正性肌力作用，增强心肌收缩力，但并不影响心室舒张；同时本品可通过使ATP敏感的K⁺通道（K_ATP）开放而产生血管舒张作用，使得冠状动脉阻力血管和静脉容量血管舒张，从而改善冠脉的血流供应，另外它还可抑制磷酸二酯酶Ⅲ。在心衰患者中，左西孟旦的正性肌力和扩血管作用可以使心肌收缩力增强，降低前后负荷，而不影响其舒张功能。

其化学名称为：(R)–[[4–(1, 4, 5, 6–四氢–4–甲基–6–氧代–3–哒嗪基)苯基]–亚肼基]–丙二腈。

有这么多的功效，被大量使用。但在制备过程不免会有各样杂质没有去除，使产品达不到规定纯度，或给疗效上带来新的问题。

在产品中，主要杂质为水解杂质、重氮化工艺副产物、起始物料工艺副产物、中间体工艺副产物、及起始物料残留杂质、中间体残留杂质等。这些杂质被命名为A、B、C、D、E、G、H、I、J、P杂质代码，便于在色谱条件监控中进行杂质定位和识别，而这些杂质是影响产品纯度提高的重要原因，同时这些杂质影响产品在临床中的运用，给临床带来安全隐患，就需要发明一种监控条件下能够全部监控杂质的方法，保障产品的品质。

目前有人用高效液相色谱法监控杂质，高效液相色谱法又称"高压液相色谱"、"高速液相色谱"、"高分离度液相色谱"、"近代柱色谱"等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

传统方法没有提供左西孟旦全部杂质的色谱监控方法，而其他文献报道的色谱条件无法全部监控杂质但因这些色谱条件的技术缺陷，无法满足对产品的高品质的要求，而且多个杂质监控方法使质量监控人员工作量增加，不能够及时的监控产品中的全部杂质，与生产监控要求的及时性、准确性等相差甚远。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，能够在同样的色谱条件下，全面检测左西孟旦中杂质，保障产品的品质；操作简单，时间快，精确度高，数据稳定，成本降低。

解决以上技术问题的本发明中一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）试样溶液准备：

流动相A：磷酸盐缓冲液；

流动相B：甲醇；

稀释剂：磷酸盐缓冲液-甲醇，比例为40：60；

（2）配制对照品溶液：

对照品贮备液：称取左西孟旦杂质及左西孟旦对照品，精密称定，分别加入稀释剂溶解并定量稀释制成0.08-0.12mg/ml浓度的溶液，作为对照品贮备液；

这些杂质是起始物料、中间体、工艺杂质、工艺副产物杂质和降解杂质等，实际检测过程中可采用杂质编码（如A、B、C、D、E、G、H、I、J、P等）的形式进行了区别。

对照品溶液：精密量取左西孟旦对照品贮备液，加入稀释剂稀释制成每1ml中含左西孟旦0.5μg的溶液，作为对照品溶液；

（3）配制供试品溶液：

取供试品，精密称定，加稀释剂超声溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；

（4）杂质色谱系统要：

用高效液相色谱仪对对照品溶液进行色谱定位，杂质与杂质之间分离度＞1.5，以及杂质与主成分之间分离度＞1.5；

连续测定5次对照品，主成分峰峰面积的RSD值≤5.0%，即为产品色谱系统合格。

取含杂质对照品的贮备液进行色谱分离，单个杂质峰位置应与混合杂质对照品溶液中的杂质峰位置一致，就可以确定杂质峰的位置。

本发明中用梯度洗脱程序来设计色谱条件，使在同一个色谱条件下分离这些杂质。

所述高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱温28-32℃，流速0.5-1.5ml/min，284nm，进样量：5μl。

优化方案中所述高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱温30℃，流速1ml/min，284nm，进样量：5μl。

进一步优化技术方案中，所述高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱温30℃，流速1ml/min，284nm；进样量：5μl。

所述高效液相色谱仪色谱梯度表如下:

T(min) 0 5-10 20-25 30-35 35-45 45-50 50 60

流动相A相(%):70 40-70 20-45 20-45 20-40 35-65 70 70

流动相B相(%):30 30-60 55-80 55-80 35-65 35-65 30 30

进一步优化方案中所述高效液相色谱仪色谱梯度表如下:

T(min) 0 5 22 30 35 45 50 60

流动相A相(%):70 70 45 45 35 35 70 70

流动相B相(%):30 30 55 55 65 65 30 30

所述的C18色谱柱为：phenomennex Gemini C18 ，150×4.6mm,3m。

所述磷酸盐缓冲液为1.8g磷酸二氢钠溶于1000ml水中，磷酸调pH值至2.1制成的磷酸盐缓冲液。

所述超声溶解中超声条件为25℃/5min。

本发明中所述步骤（4）中对对照组进行色谱定位前用系统适用性溶液进行预检测，系统适用性溶液配制步骤为：分别精密量取各杂质对照品贮备液，加入稀释剂稀释制成每1ml中分别约含各杂质及左西孟旦0.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

是含全部杂质的混合杂质对品溶液，浓度是单个杂质0.5μg/ml，主成分也是0.5μg/ml。此溶液是对样品进行检测前，采用此溶液对高液色谱系统进行考察，符合要求后才能够进行后续的样品分析工作。

色谱条件是根据左西孟旦主成分性质及各杂质在色谱洗脱条件下，主成分中杂质色谱分离情况来确定。确定的色谱条件可以全面监控左西孟旦中杂质的残留情况，给合成车间工业化生产监控产品品质提供可行的检测条件。

在产品中，主要杂质为水解杂质、重氮化工艺副产物、起始物料工艺副产物、中间体工艺副产物、及起始物料残留杂质、中间体残留杂质等，需要在色谱条件监控中进行杂质定位和识别，而这些杂质是影响产品纯度提高的重要原因。 同时这些杂质的极性差异较大，无法采用等度洗脱方式对杂质进行色谱分离并监控，因此，就需要针对不同杂质开发出多种杂质监控方法，这样导致质量监控压力，同时也无法全面评估产品中的杂质残留情况。

本发明具体操作为按已设计好的梯度运行时间表，在高液设备自带的梯度洗脱设置软件上输入运行时间，高液根据时间运行要求自行切换流动性的洗脱比例，达到将不同极性的杂质在同一根色谱柱中依次洗脱出来，而且时间短，杂质监控全面，除了能够监控这些已知杂质外，梯度洗脱程序还可以洗脱出其他未知的杂质，达到全面控制产品品质的目的。

本发明中的检测方法能够在同样的色谱条件下，全面检测左西孟旦中杂质，保障产品的品质；同时此色谱条件的运用，可以全面对左西孟旦中的杂质进行全面监控，保障产品在生产、贮藏、运输、使用中的品质，同时供质量体系追溯、监控使用。

附图说明

图1为本发明中全部杂质色谱试验结果

图2为本发明中的条件3

图3为本发明中的条件6

具体实施方式

以下通过实例对本发明作进一步的说明：

其中，本品化学名称为2-[[（3α, 5β, 7β）-3, 7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物。

所用仪器或设备、杂质：

高效液相色谱仪：Agilent 1100 Series(G1379A脱气机；G1311A泵；G1313A自动进样装置；G1316A柱温箱；G1315A检测器)

色谱柱：phenomennex Gemini C18 (150×4.6mm,3m)，或用十八烷基键合硅胶为填充剂，250×4.6mm,3m。

试剂：甲醇（天津科密欧试剂有限公司，批号131405；色谱纯）；磷酸二氢钠（成都科龙化学试剂有限公司，批号129814,；分析纯） 超纯水

电子天平：METTLER TOLEDO XS105

杂质产品：表1

实施例1

用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，包括以下步骤：

（1）试样溶液准备：

流动相A：磷酸盐缓冲液

流动相B：甲醇

稀释剂：磷酸盐缓冲液-甲醇，比例为40：60；

（2）配制对照品溶液：

对照品贮备液：称取左西孟旦杂质A、B、C、D、E、G、H、I、J、P及左西孟旦对照品，精密称定，分别加入稀释剂溶解并定量稀释制成0.08-0.12mg/ml浓度的溶液，作为对照品贮备液；

对照品溶液：精密量取左西孟旦对照品贮备液，加入稀释剂稀释制成每1ml中含左西孟旦0.5μg的溶液，作为对照品溶液；

（3）配制供试品溶液：

取供试品，精密称定，加稀释剂超声溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；所述超声溶解中超声条件为25℃/5min。

（4）杂质色谱系统要求：

用高效液相色谱仪对对照品溶液进行色谱定位，杂质与杂质之间分离度＞1.5，以及杂质与主成分之间分离度＞1.5；

连续测定5次对照品，主成分峰峰面积的RSD值≤5.0%，即为产品色谱系统合格。

所述高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱温28-32℃，流速0.5-1.5ml/min，284nm，进样量：5μl。

优化方案中，高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱温30℃，流速1ml/min，284nm；进样量：5μl。

所述高效液相色谱仪色谱梯度表如下:

T(min) 0 5-10 20-25 30-35 35-45 45-50 50 60

流动相A相(%):70 40-70 20-45 20-45 20-40 35-65 70 70

流动相B相(%):30 30-60 55-80 55-80 35-65 35-65 30 30

优化方案中，所述高效液相色谱仪色谱梯度表如下:

T(min) 0 5 22 30 35 45 50 60

流动相A相(%):70 70 45 45 35 35 70 70

流动相B相(%):30 30 55 55 65 65 30 30

所述的C18色谱柱为：phenomennex Gemini C18 ，150×4.6mm,3m。

磷酸盐缓冲液为1.8g磷酸二氢钠溶于1000ml水中，磷酸调pH值至2.1制成的磷酸盐缓冲液。

所述步骤（4）中对对照组进行色谱定位前用系统适用性溶液进行预检测，系统适用性溶液配制步骤为：分别精密量取各杂质对照品贮备液，加入稀释剂稀释制成每1ml中分别约含各杂质及左西孟旦0.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

试验例一

其它内容如实施例1中的内容，左西孟旦产品中杂质编号有A、B、C、D、E、G、H、I、J、P，技术人员针对多达10个杂质能够在一种色谱条件下筛选，并最终确定本发明的色谱方法，具体实施列如下：

色谱条件中杂质监控波长的试验：将试样放入高效液相色谱仪检测，经二极管阵列扫描（DAD），结果如下表2：

表2.全部杂质二极管阵列扫描结果

由上述扫描结果可知：杂质P在300nm左右有最大吸收，杂质A、B、C、D、E、L均在280nm~300 nm有最大吸收，其他杂质及左西孟旦在370 nm~380 nm有最大吸收，但是接近可见光区，在有些液相色谱仪上（如岛津）不能设置此波长，且这些杂质在280 nm~300 nm有第二大吸收。因此，在波长选择最初将粗品及杂质混合溶液分别在284 nm与375nm波长下进行检测，进而选择合适的波长。

各已知杂质在284 nm波长下均能检出，检出共计10个杂质，但各已知杂质在375nm波长下不能完全检出，检出4个杂质，各杂质的响应值较284nm下大；粗品溶液在284 nm波长下能检出31个杂质，在375 nm波长下能检出17个杂质，在375nm检出的杂质在284nm下均能检出，其中一些杂质的响应值在375nm下较284nm高，但均能检出。经上述两种波长下的样品检出情况比较，在284nm下所有的杂质均能检出，在375nm下部分已知杂质及未知杂质不能检出，因此，初步确定以第二大吸收波长284nm作为左西孟旦有关物质的检测波长。

试验例二：专属性试验

是指采用酸、碱、氧、高温、紫外光等苛刻的人为设置条件对需要考察的样品进行破坏性的处理，使其降解出更多的杂质供色谱条件进行考察，用这样的方法可以考察色谱条件的检测杂质的能力和专一性。

其它内容如实施例1中的内容，将样品在1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、高温（80℃）、紫外光、3~5%双氧水下进行破坏性处理一定的时间，这样处理后的样品就可以用于考察色谱条件的专属性。

专属性实验中杂质降解多的碱破坏、双氧水破坏、紫外光液体破坏后的较大未知杂质二极管扫描在破坏实验中，降解程度最大的碱破坏、双氧水破坏、自然光液体破坏条件下产生的未知杂质的最大吸收扫描图均与左西孟旦的扫描图一致，在280 nm~300 nm和370nm~380 nm之间有最大吸收，这些未知杂质从理论上讲是从左西孟旦降解出的结构片段，与左西孟旦的响应值应接近，且第一大吸收波长接近可见光区，经后面在284nm波长下进行的左西孟旦检测限及定量限验证，检测限浓度低于设定的报告限（0.02%），未知杂质在此波长下也能检出，进一步验证，我们所选择的波长能满足左西孟旦的有关物质检测。

试验例三：进一步验证波长选择的合理性

其它操作步骤中内容如实施例1中的内容，对样品在两种波长下进行的检测。采用大生产的产品配制成测定溶液（0.5mg/ml），在不同波长（284nm和375nm）下，其他色谱条件一致的情况下进行考察，结果对样品比较，在284nm下检出2个0.02%以上的杂质，在375nm下未检出，进一步说明本品有关物质所选的波长284nm较合理。

试验例四：色谱条件筛选试验：

方法：高效液相色谱法（HPLC法）

流动相：磷酸盐缓冲液（1.8g磷酸二氢钠溶于1000ml水中，磷酸调pH值至2.1）-甲醇（40：60）

检测波长284nm

柱温30℃

流速1.0ml/min

进样量：20μl

杂质溶液：具体配制步骤如下表3：

表3

加流动相超声溶解后，取各杂质储备液及主成分溶液适量，加流动相稀释配制成含各成分浓度约为5μg/ml的溶液作为系统溶液。

取全部杂质进行按此色谱条件进行试验，结果如图1，在此条件下无法分离。

重新设计杂质考察色谱条件，经多次筛选，具体实施案例第二阶段如下表4：

表4梯度洗涤色谱条件筛选案例

（注条件3为图2）

以上述条件为基础，当加入杂质P后为了使杂质P与杂质C之间能分开，使左西孟旦与杂质D之间能分开，又能使杂质A出峰时间延后和杂质K走出，由于杂质K据合成反映不稳定，需用甲醇溶样，所以将稀释剂改为甲醇，将梯度中甲醇与缓冲液比例和时间进行微调（条件4），具体实施例第三阶段如下表5：

表5 左西孟旦色谱条件筛选

在条件6（图3）下对各杂质进行定位，各杂质及主成分保留时间、分离度、理论塔板数、拖尾因子统计如下表6：

表6左西孟旦色谱条件6杂质定位结果

经6次的色谱条件筛选实施案例，最终确定了10个左西孟旦杂质的色谱分离条件，

按下表梯度进行洗脱：

表7

色谱系统要求：精密量取系统适用性溶液（含杂质A、B、C、D、E、G、H、I、J、P各为0.5μg/ml）注入液相色谱仪，记录色谱图。各峰之间分离度不得小于1.5。

试验例五

采用发明的10个杂质在一种色谱分离条件，对多个产品批次进行分析数据汇总见下表8：

表8各批次样品杂质谱检测汇总

参比制剂的杂质谱分析（左西孟旦注射液，批号：1477612，生产厂家OrionCorporation，欧里昂制药）监控见下表9：

表9参比制剂杂质谱检测汇总

从杂质监控可知，参比制剂产品中检测了多个已知杂质，而原料药中没有这些杂质出现，这样的杂质监控色谱条件能够保障产品的质量。

试验六：准确性、稳定性

具体操作方施如实施例1中的内容，对发明的色谱条件中的条件进行试验，结果见表10：

表10色谱方法准确性、稳定性考察

以上可以得知，本发明中的检测方法准确率高、重复性好。

Claims (4)

1.一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）试样溶液准备：

流动相A：磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液为1.8g磷酸二氢钠溶于1000ml水中，磷酸调pH值至2.1制成的磷酸盐缓冲液；

流动相B：甲醇；

稀释剂：磷酸盐缓冲液-甲醇，比例为40：60；

（2）配制对照品溶液：

对照品贮备液：称取左西孟旦杂质及左西孟旦对照品，精密称定，分别加入稀释剂溶解并定量稀释制成0.08-0.12mg/ml浓度的溶液，作为对照品贮备液；

对照品溶液：精密量取左西孟旦对照品贮备液，加入稀释剂稀释制成每1ml中含左西孟旦0.5μg的溶液，作为对照品溶液；

（3）配制供试品溶液：

取供试品，精密称定，加稀释剂超声溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；

（4）杂质色谱系统要求：

先对照组进行色谱定位前用系统适用性溶液进行预检测，系统适用性溶液配制步骤为：分别精密量取各杂质对照品贮备液，加入稀释剂稀释制成每1ml中分别约含各杂质及左西孟旦0.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；

再用高效液相色谱仪对对照品溶液进行色谱定位，杂质与杂质之间分离度＞1.5，以及杂质与主成分之间分离度＞1.5；

连续测定5次对照品溶液，主成分峰峰面积的RSD值≤5.0%，即为色谱系统合格；

其中， 所述高效液相色谱仪色谱梯度表如下:

T(min) 0 5 22 30 35 45 50 60

流动相A相(%):70 70 45 45 35 35 70 70

流动相B相(%):30 30 55 55 65 65 30 30；

所述杂质主要包括：水解杂质、重氮化工艺副产物、起始物料工艺副产物、中间体工艺副产物、及起始物料残留杂质、中间体残留杂质。

2.根据权利要求1所述一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱温28-32℃，流速0.5-1.5ml/min，波长284nm，进样量：5μl。

3.根据权利要求1所述一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，其特征在于：所述甲醇为分析纯甲醇。

4.根据权利要求1所述一种用高效液相色谱仪检测左西孟旦中杂质的方法，其特征在于：所述超声溶解中超声条件为25℃/5min。