CN105779461A - 分离的编码cln5突变体的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CLN5基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码CLN5突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统，用于筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的试剂盒，以及构建药物筛选模型的方法。其中，该分离的编码CLN5突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.935G>A突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症。

Description

分离的编码CLN5突变体的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及分离的编码CLN5突变体的核酸及其应用，更具体地，涉及分离的编码CLN5突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统、用于筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

神经元蜡样脂褐质沉积症在相对常见的进行性神经退行性的青少年疾病，其特征主要为皮质神经元的快速死亡以及神经和外围组织自发荧光高电子密度的胞内脂质(autofluorescentlipopigmentmaterial)的积累，积累的过程主要与细胞逐渐丢失有关，进而影响到大脑和小脑的皮质以及皮层下灰色的核(subcorticalgreynuclei)。CLN5基因上的突变多出现在严重的常染色体遗传的迟发性小儿神经元蜡样脂褐质沉积症，发病年龄多为4到7岁。临床表现主要为视觉下降，小脑性共济失调，耐药渐进，肌肉阵挛性癫痫，行为障碍，精神衰退和早逝。神经元蜡样脂褐质沉积症多为常染色体隐性遗传，但也有少数报道符合常染色体显性遗传，多发于幼儿期和青春期。不到5％的病例发生在成年期，多伴有库夫斯病(Kufsdisease)，这种情况最难被诊断出来。据报道，目前已知的神经元蜡样脂褐质沉积症大约有13种致病基因，和大约400种突变。

因此，仍有待进一步发现新的CLN5突变体。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效筛选神经元蜡样脂褐质沉积症生物样品的方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

发明人采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronalceroidlipofuscinosis，NCLs)患病家系进行了全基因组外显子组测序分析，发现神经元蜡样脂褐质沉积症一个致病基因CLN5的新的纯合突变c.935G>A(p.Ser312Asn)。本发明研究的是一种成年期晚发神经元蜡样脂褐质沉积症，因为它的初期症状比较复杂伴有隐性遗传的小脑性共济失调，因此基因层面的诊断是十分重要的。与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术相比，发明人采用的外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精度更高。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码CLN5突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.935G>A突变。发明人惊奇的发现，该突变体与神经元蜡样脂褐质沉积症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了CLN5基因的致病突变图谱，更深入阐明了神经元蜡样脂褐质沉积症的分子发病机制，为神经元蜡样脂褐质沉积症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：3相比，所述分离的多肽具有p.Ser312Asn突变。具体地，致病基因CLN5的新的纯合突变c.935G>A，导致编码的氨基酸发生突变，即p.Ser312Asn。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.935G>A突变，判断所述生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症。发明人惊奇地发现，利用该系统可以对神经元蜡样脂褐质沉积症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测CLN5基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述CLN5基因突变体具有c.935G>A突变。发明人惊奇地发现，利用该试剂盒，可以对CLN5基因突变体进行高精度的检测，从而对神经元蜡样脂褐质沉积症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码CLN5突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的神经元蜡样脂褐质沉积症患者家系的家系图；

图3显示了根据本发明的一个实施例的CLN5基因c.935G>A突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

CLN5突变体

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码CLN5突变体的核。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.935G>A突变。

在本文中所使用的表达方式“编码CLN5突变体的核酸”，是指与编码CLN5突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与CLN5突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一些具体示例，所述核酸为DNA。

对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQIDNO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码CLN5突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的神经元蜡样脂褐质沉积症的致病基因CLN5的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“目标区域捕获测序”是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。

其中，野生型的CLN5的cDNA的序列如下所示：

ATGCGCCGGAACCTGCGCTTGGGGCCAAGCTCTGGAGCTGACGCGCAGGGGCAAGGCGCCCCGCGTCCCGGACTGGCGGCTCCGCGCATGCTCCTCCCACCGGCGTCGCAGGCCTCGAGAGGCTCCGGAAGTACTGGGTGCAGCCTGATGGCGCAGGAGGTAGACACGGCACAGGGCGCCGAGATGCGGCGGGGCGCGGGCGCGGCTCGGGGACGCGCTTCCTGGTGCTGGGCCCTGGCGCTGCTTTGGCTCGCGGTGGTTCCGGGCTGGTCCCGGGTCTCGGGCATCCCCTCCCGGCGCCACTGGCCGGTGCCCTACAAGCGCTTTGACTTCCGTCCAAAACCTGATCCTTATTGTCAAGCTAAGTATACTTTCTGTCCAACTGGCTCACCTATCCCAGTTATGGAGGGTGATGATGACATTGAAGTTTTTCGATTACAAGCCCCAGTATGGGAATTTAAATATGGAGACCTCCTGGGACACTTGAAAATTATGCATGATGCCATTGGATTCAGAAGTACATTAACTGGCAAGAACTACACAATGGAATGGTATGAACTTTTCCAACTTGGCAACTGTACATTTCCCCATCTCCGACCTGAAATGGATGCCCCTTTCTGGTGTAATCAAGGCGCTGCCTGCTTTTTTGAGGGAATTGATGATGTTCACTGGAAGGAAAATGGGACATTAGTTCAAGTAGCAACTATATCAGGAAACATGTTCAACCAAATGGCAAAGTGGGTGAAACAGGACAATGAAACAGGAATTTATTATGAGACATGGAATGTAAAAGCCAGCCCAGAAAAGGGGGCAGAGACATGGTTTGATTCCTACGACTGTTCCAAATTTGTGTTAAGGACCTTTAACAAGTTGGCTGAATTTGGAGCAGAGTTCAAGAACATAGAAACCAACTATACAAGAATATTTCTTTACAGTGGAGAACCTACTTATCTGGGAAATGAAACATCTGTTTTTGGGCCAACAGGAAACAAGACTCTTGGTTTAGCCATAAAAAGATTTTATTACCCCTTCAAACCACATTTGCCAACTAAAGAATTTCTGTTGAGTCTCTTGCAAATTTTTGATGCAGTGATTGTGCACAAACAGTTCTATTTGTTTTATAATTTTGAATATTGGTTTTTACCTATGAAATTCCCTTTTATTAAAATAACATATGAAGAAATCCCTTTACCTATCAGAAACAAAACACTCTCTGGTTTATAA(SEQIDNO：1)

本发明的CLN5突变体的cDNA序列如下所示，其中突变基因加方框示出，

ATGCGCCGGAACCTGCGCTTGGGGCCAAGCTCTGGAGCTGACGCGCAGGGGCAAGGCGCCCCGCGTCCCGGACTGGCGGCTCCGCGCATGCTCCTCCCACCGGCGTCGCAGGCCTCGAGAGGCTCCGGAAGTACTGGGTGCAGCCTGATGGCGCAGGAGGTAGACACGGCACAGGGCGCCGAGATGCGGCGGGGCGCGGGCGCGGCTCGGGGACGCGCTTCCTGGTGCTGGGCCCTGGCGCTGCTTTGGCTCGCGGTGGTTCCGGGCTGGTCCCGGGTCTCGGGCATCCCCTCCCGGCGCCACTGGCCGGTGCCCTACAAGCGCTTTGACTTCCGTCCAAAACCTGATCCTTATTGTCAAGCTAAGTATACTTTCTGTCCAACTGGCTCACCTATCCCAGTTATGGAGGGTGATGATGACATTGAAGTTTTTCGATTACAAGCCCCAGTATGGGAATTTAAATATGGAGACCTCCTGGGACACTTGAAAATTATGCATGATGCCATTGGATTCAGAAGTACATTAACTGGCAAGAACTACACAATGGAATGGTATGAACTTTTCCAACTTGGCAACTGTACATTTCCCCATCTCCGACCTGAAATGGATGCCCCTTTCTGGTGTAATCAAGGCGCTGCCTGCTTTTTTGAGGGAATTGATGATGTTCACTGGAAGGAAAATGGGACATTAGTTCAAGTAGCAACTATATCAGGAAACATGTTCAACCAAATGGCAAAGTGGGTGAAACAGGACAATGAAACAGGAATTTATTATGAGACATGGAATGTAAAAGCCAGCCCAGAAAAGGGGGCAGAGACATGGTTTGATTCCTACGACTGTTCCAAATTTGTGTTAAGGACCTTTAACAAGTTGGCTGAATTTGGAGCAGAGTTCAAGAACATAGAAACCAACTATACAAGAATATTTCTTTACAATGGAGAACCTACTTATCTGGGAAATGAAACATCTGTTTTTGGGCCAACAGGAAACAAGACTCTTGGTTTAGCCATAAAAAGATTTTATTACCCCTTCAAACCACATTTGCCAACTAAAGAATTTCTGTTGAGTCTCTTGCAAATTTTTGATGCAGTGATTGTGCACAAACAGTTCTATTTGTTTTATAATTTTGAATATTGGTTTTTACCTATGAAATTCCCTTTTATTAAAATAACATATGAAGAAATCCCTTTACCTATCAGAAACAAAACACTCTCTGGTTTATAA(SEQIDNO：2)

发明人惊奇的发现，该突变体与神经元蜡样脂褐质沉积症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了CLN5基因的致病突变图谱，更深入阐明了神经元蜡样脂褐质沉积症的分子发病机制，为神经元蜡样脂褐质沉积症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：3相比，所述分离的多肽具有p.Ser312Asn突变。具体地，致病基因CLN5的新的纯合突变c.935G>A，导致编码的氨基酸发生突变，即p.Ser312Asn。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症。

根据本发明的一些具体示例，所述多肽是由前述的核酸编码的。

其中，野生型的CLN5的cDNA编码的氨基酸序列如下：

本发明的CLN5突变体的cDNA编码的多肽序列如下所示，其中突变的氨基酸加方框示出，

通过比对发现，与SEQIDNO：1相比，CLN5突变体的cDNA具有c.935G>A突变，进而，其编码的产物与野生型的CLN5多肽序列相比，具有p.Ser312Asn，即AGT突变为AAT，其编码的氨基酸相应的由Ser变为Asn，从而引起神经元蜡样脂褐质沉积症。

筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统。参照图1A，该系统包括：

核酸提取装置100，所述核酸提取装置100用于从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，参照图1B，所述核酸提取装置100进一步包括：RNA提取单元101，所述RNA提取单元101用于从所述生物样品提取RNA样本；以及反转录单元102，所述反转录单元102与所述RNA提取单元101相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

核酸序列确定装置200，所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，参照图1C，所述核酸序列确定装置200进一步包括：文库构建单元201，所述文库构建单元201用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及测序单元202，所述测序单元202与所述文库构建单元201相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些具体示例，所述文库构建单元进一步包括：PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有CLN5基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。其中，所述特异性引物具有如SEQIDNO：5-6所示的核苷酸序列。优选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

判断装置300，所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.935G>A突变，判断所述生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症。

发明人惊奇地发现，利用该系统可以对神经元蜡样脂褐质沉积症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测CLN5基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述CLN5基因突变体具有c.935G>A突变。

在发明中，所使用的术语“适于检测CLN5基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测CLN5编码基因的试剂，也可以是检测CLN5突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一些具体示例，所述试剂为核酸探针或引物。由此，能够特异性的检测CLN5基因。优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQIDNO：5-6所示的核苷酸序列。由此，对CLN5基因检测的特异性好，准确性高。

发明人惊奇地发现，利用该试剂盒，可以对CLN5基因突变体进行高精度的检测，从而对神经元蜡样脂褐质沉积症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品。

构建体和重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含权利要求1所述的分离的编码CLN5突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

其中，需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽即可。例如，采用分子生物学技术，对受体细胞产生精确的目标基因定点突变，获得患有神经元蜡样脂褐质沉积症的动物，该动物可以作为模型用于筛选治疗该疾病的药物。例如，可以通过无标记转基因技术，定点整合技术，基因组编辑技术等方法实现目标基因的定点突变，获得本发明的编码CLN5突变体的基因，进而构建CLN5突变体基因的重组载体，将该重组载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞中，使突变的外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而CLN5突变体基因在细胞中得以表达。再将重组细胞植入假孕母体，使其发育成嵌合体动物。利用嵌合体之间的交配，产生纯合体动物，嵌合体动物和纯化体动物均可用于药物筛选模型，从而有效地筛选治疗神经元蜡样脂褐质沉积症的药物。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明发现神经元蜡样脂褐质沉积症致病基因的一个新错义突变。以此为基础，可用于早期筛查神经元蜡样脂褐质沉积症致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗；也可用于神经元蜡样脂褐质沉积症患者的分子诊断及与相关疾病的的鉴别诊断。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为神经元蜡样脂褐质沉积症的早期诊断、鉴别诊断及开发神经元蜡样脂褐质沉积症治疗药物提供科学依据。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

确定神经元蜡样脂褐质沉积症突变基因的步骤如下：

1.样本采集

本实施例的样本是一对意大利的患病兄妹和一个未患病的兄弟，其家系图如图2所示，其中，正方形表示男性，圆形表示女性，图形中未填充颜色表示正常人，图形中为黑色表示患者，“/”代表已死亡，菱形代表性别不明的正常人，其中，先证者为61岁男性(图2中的III-5)，患者表现出步态不稳，发音困难和轻度的认知下降，58岁时的临床检查显示轻微的注意力下降，中度的眼球垂直震颤(modestnystagmuswithverticalcomponent)，口齿不清，轻微的头部震颤和共济失调，我们也观察到轻微的辨距不良和轮替运动障碍步态和姿势混乱，但感觉功能正常，四肢有轻快的深反射伴有正常的跖屈肌的反应，体感诱发电位、脑电图、神经传导速度、血常规检测正常。脑CT扫描和核磁共振显示出严重的小脑萎缩，尤其是小脑蚓体，并伴有严重双侧皮质萎缩——主要是顶叶和颞-没有局灶病变，患者52岁时患有青光眼，58岁时眼睛检查结果显示两眼视野区域受限，左眼近中心区域出现暗点，61岁时患者发音更加困难，不能自主行走，四肢震颤严重，意识受损严重，视觉/空间,语言，推理，逻辑，行为能力进一步下降，相反，时间和空间定位，短期记忆和计算能力保留。

该患者的妹妹55岁时确诊(图2中的III-6)，56岁时出现出步态不稳和发音障碍并逐渐恶化，神经功能结果显示，步态不稳及眼球震颤在各个方向都有所表现，发音困难，下肢明显测距不准，四肢轻快，对称深反射，肌张力、语音及感觉没有受到影响，轻微意识障碍并患有青光眼。

采集了两个患者(III-5、III-6)和一个正常人(III-4)的外周血，并提取DNA，所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。

2.芯片设计、文库构建和高通量测序

利用AglientSureSelectHumanAllExonkit(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)结合soleax高通量测序技术对该家系中的两名患者的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)利用AglientSureSelectHumanAllExonkit(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)捕获芯片对基因组的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。

2)将基因组DNA随机打断成200-300bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头，制备文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

3)文库经纯化后经过ligation-mediatedPCR(LM-PCR)的线性扩增与customcapturearray进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为IlluminaHiseq2000，读取长度为100bp。

3.变异检测、注释及与数据库比较

1)测序后获得的原始数据由IlluminabasecallingSoftware1.7进行处理。然后过滤低质量读段和包含接头污染读段。使用Burrows–WheelerAligner(BWA)和ShortOligonucleotideAnalysisPackage(SOAPaligner2.21)，将高质量读段比对到参考基因组(hg19)，获得比对到基因组上的唯一比对reads。然后对SOAP(version2.21)比对的结果用SOAPsnp1.05进行SNP的检测，对BWA比对的结果用GenomeAnalysisToolKit(GATK1.4)进行indel的检测。

2)对于检出的SNP和indel变异，进行注释，确定变异所处基因组环境，以及变异的类型。重点关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。我们将检出的变异和dbSNP数据库、千人基因组数据库和ESP数据库等公共数据库进行了比较，保留了低频的变异(MAF≤0.01)。根据遗传模式(近亲结婚，隐性病)，我们选取了患者中为隐性纯合而正常的亲戚均为杂合的位点进行优先考虑，对于位于疾病已知基因上的候选致病突变，我们进行了sanger验证。

3)通过以上分析，我们在患者的CLN5基因上发现了未报道过的纯合突变c.935G>A在chr13:77574815，p.Ser312Asn(NM_006493,OMIM*608102,http://www.omim.org/)。该突变在患病的两个样本中纯合，在未患病的兄弟(图2中的III-4)中杂合。

综上所述，CLN5基因上的c.935G>A突变可能导致神经元蜡样脂褐质沉积症。

实施例2

利用实施例1中家系内2个患者样本和1个正常样本(患者：III-5、III-6正常人：III-4)，采用Sanger法对神经元蜡样脂褐质沉积症致病突变位点进行验证，包括引物设计，PCR扩增，产物纯化，测序得到序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证突变与神经元蜡样脂褐质沉积症之间相关性。具体步骤如下：

1、DNA提取

采集的上述3个样本(2个患者样本和1个正常样本)的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。

2)引物设计及PCR反应：

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，具体如下：

a)引物序列：

正向引物：5'-GGTAAACAAATGGGTAGTAAAG-3'(SEQIDNO：5)

反向引物：5'-ATGCAAATCAGTAACGTCTGG-3'(SEQIDNO：6)

b)反应体系：25μL

c)反应条件：

3)将步骤2中获得PCR扩增产物纯化后用ABI的3730进行DNA测序。

在该家系中，患者均为致病突变的纯合体，正常兄弟为致病突变的杂合携带者。图3显示了上述神经元蜡样脂褐质沉积症患者家系中，各样本ACD基因c.935G>A突变位点的代表性Sanger测序验证峰图，如图3所示，只检测到A的波峰而没有检测到G的波峰，证明了该位点G突变为A，且为纯合子，从而，进一步证明了CLN5基因上的c.935G>A(p.Ser312Asn)突变为神经元蜡样脂褐质沉积症的一个致病突变。

实施例3

制备一检测试剂盒，其包含能够检测CLN5基因的c.935G>A突变的引物，用于筛选神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品，其中这些引物为CLN5基因外显子特异性引物，其序列如实施例2中所述SEQIDNO：5-6所示。

利用上述试剂盒筛选神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述CLN5基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.935G>A突变，能够有效地检测本发明的CLN5基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症，进一步，能够从待测者中筛选出神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种分离的编码CLN5突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.935G>A突变，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQIDNO：3相比，所述分离的多肽具有p.Ser312Asn突变，

任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。

3.一种筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.935G>A突变，判断所述生物样品是否易患神经元蜡样脂褐质沉积症。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

5.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有CLN5基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，所述特异性引物具有如SEQIDNO：5-6所示的核苷酸序列，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

7.一种用于筛选易患神经元蜡样脂褐质沉积症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测CLN5基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述CLN5基因突变体具有c.935G>A突变，

任选地，所述试剂为核酸探针或引物，

任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQIDNO：5-6所示的核苷酸序列。

8.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码CLN5突变体的核酸。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求8所述的构建体转化受体细胞而获得的。

10.一种构建药物筛选模型的方法，其特征在于，包括：

使动物的至少一部分细胞表达权利要求1所述的核酸，

任选地，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。