CN1057566C - 生产转基因海带的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产转基因海带的方法，该方法是将外源基因与CAT基因融合，用基因枪将其导入海带雌配子体中，经孤雌生殖再生孤雌海带，再经氯霉素严格筛选获得优质、高产的转基因海带，或利用转基因海带作为生物反应器生产藻胆蛋白、生长因子、抗体、疫苗、防御素等。
Description
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用基因工程生产转基因海带的方法。
利用基因工程生产转基因植物，是培育优质、高产、抗逆植物新品种的一种有效手段。
现有的生产转基因植物技术均是针对高等植物的，这些技术都是根据陆地植物和高等植物，如烟草、棉花等的特点发明的，主要采用的技术其工艺流程为：
上述系统流程的主要技术特征是在于：1、利用农杆菌Ti质粒系统导入外源基因，或利用电击法向原生质体内导入基因，或利用基因枪法向组织细胞中导入基因；2、培养原生质体再生植株，或诱导组织去分化形成愈伤组织，再诱导愈伤组织分化，再生植株；3、筛选标记：大多以NptII基因为选择标记基因，通过卡那霉素或新霉素筛选，获得转基因植株。
海带(
Laminaria
japonica)是生活在海洋环境中的大型藻类，属低等植物，不同于上述高等植物，海带由于1、不具有类似于农杆菌的转化系统；2、原生质体难以再生植株，因此不能配合使用电击法；3、组织培养再生植株的效率很低；4、海带对卡那霉素不敏感，不能使用卡那霉素作为选择压力。因此利用现有的方法不能生产转基因海带，需要针对海带的特点，发明一套生产转基因海带的技术，包括方法、受体和筛选标记等。
本申请的发明人针对上述需求，经过多年研究，发明了一种利用基因工程的技术生产转基因海带的方法，所述方法的简要工艺流程如下：
本发明的方法的详细工艺过程如下：
将外源基因(如藻胆蛋白基因、生长因子基因、抗体基因、疫苗基因、防御素基因等)与CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因融合，重组于特定的启动子下游，用基因枪将其导入海带雌性配子体中，经孤雌生殖再生孤雌海带，然后用氯霉素筛选获得抗氯霉素的海带，由此可以推知，上述这些基因的表达．亦即获得转上述基因的海带。
上述本发明方法中，所述的启动子为SV40启动子、CAMV35S启动子及海带自身启动子。
本发明方法在技术上的优点如下：
1、在所用方法上，因为海带雌配子体具有细胞壁，必须采用透过细胞壁导入外源基因的方法。基因枪是透壁转化的通用方法，但将海带雌配子体作为基因抢新的应用领域是本发明的首创。
2、作为受体，海带是低等植物，具有单倍体 —二倍体交替的生活史，另外，单倍体的雌配子体能经受孤雌生殖染色体自然加倍成为二倍体纯系海带，因而，用雌配子体作为转基因的受体以获得纯系转基因海带是本发明的第二个独创之处。
3、在筛选标记方面，海带对氯霉素敏感，用CAT基因作为选择标记基因，氯霉素作为选择压力是本发明的又一技术特点。
下面的实施例将进一步说明本发明的方法及该方法所达到的效果。
实施例
用SV40启动予—CAT基因质粒转化海带雌配子体。质粒DNA浓度为1mg/ml。采用美国Bio-Rad公司PDS-1000/He型基因枪，整个轰击过程为无菌操作，所有实验用品均经高压蒸汽灭菌或用70％乙醇浸泡。
1、微粒子的准备：
将60mg直径为1.0μm的金粉放进1ml无水乙醇中，高速涡旋振荡三次，然后以10000转/分离心1分钟，除去上清液，加入1ml无菌水中重新悬浮，离心分离去上清液，再重复此操作一次，最后将微粒子悬浮于1ml无菌水中。将50ml上述悬浮液移入1.5ml离心管中，在连续涡旋振荡过程中依次加入5μl质粒DNA(1mg/ml)、50μl 2.5mol/L CaCl2、20μl 0.1mol/L亚精胺，继续振荡3分钟，离心去除上清液。用250μl无水乙醇洗一次，再离心去除上清液，最后将金粉悬浮于60μl无水乙醇中，每次轰击用6μl。
2、雌配子体的转化
用无菌玻璃片研磨丝状雌配子体，使丝状体松动散开，每段配子体不超过5个细胞，靠重力自然沉降收集配子体，将其均匀平铺在0.2μm的无菌微孔滤膜上，位于直径2cm圆形有效轰击范围内。轰击用配子体细胞1.2×106个。另设用不含质粒DNA的金粉轰击的对照组，操作方法相同，只是雌配子体细胞约为6×105个。
3、转化后的培养
转化后，将转化组和对照组海带放入灭过菌的N-P海水(灭菌海水中加入千分之一体积的营养母液，母液成分为NaNO3：0.43mol/L，KH2PO4：0.019mol/L)中黑暗培养48小时，然后转入光照培养，光暗周期为10小时/14小时。
4、氯霉素筛选：
转化两个月后，海带经孤雌生殖长至0.5cm左右时，对照组再生海带15019株，转化组再生海带32300株。此时加入氯霉素进行筛选，每周更换培养基一次。筛选过程如下：
在100ug/ml氯霉素培养基中培养两周，后在200ug/ml氯霉素培养基中培养两周，在250ug/ml氯霉素培养基中培养两周，在300ug/ml氯霉素培养基中培养两周，结果对照海带全部死亡。将转化组存活海带转入会400ug/ml氯霉素的培养基中再培养两周，得到243株存活转基因海带。该海带可转到海上栽培以培育优质、高产、抗逆新品种以及进行各种指标检测。
Claims (1)
1、一种生产转基因海带的方法，其特征在于将外源基因与CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因融合，重组于特定的启动子下游，用基因枪将其导入海带雌性配子体中，经孤雌生殖再生孤雌海带，然后用氯霉素筛选获得抗氯霉素的海带，所述的外源基因选自藻胆蛋白基因、生长因子基因、抗体基因、疫苗基因、防御素基因，所述的启动子选自SV40启动子、CAMV35S启动子或海带自身启动子。
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1996
- 1996-10-23 CN CN96120235A patent/CN1057566C/zh not_active Expired - Fee Related
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