CN105755066B - 猪胃蛋白酶催化不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物的应用及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪胃蛋白酶作为不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物的催化剂的用途及方法，反应底物为α,β‑不饱和醛和巯基乙醛，溶剂为乙腈等有机化合物与无机盐缓冲液按一定比例组成的混合液，操作步骤包括将反应底物、溶剂、酶加入反应容器中，30℃条件下搅拌反应一段时间即可。本发明通过实验证明猪胃蛋白酶具有确切的对所述反应的催化效果；并且本发明通过对反应溶剂、pH值、底物投料比等反应条件进行优化，最终获得了高达84％ee的对映选择性产物，且反应过程中无明显副产物生成。本发明所述合成方法具有低成本、绿色环保及可持续的优点，为合成具有对映选择性的二氢噻吩类化合物提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于化学合成领域，具体涉及一种猪胃蛋白酶作为不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物的催化剂的用途及方法。
背景技术
二氢噻吩类化合物作为一类含硫杂环化合物在生物活性、药理活性、多用途的合成中间体及材料科学等方面具有特殊的利用价值，因此，现有技术中报道了很多关于此类化合物的高效合成方法，但仅有少数方法能够成功合成具有对映选择性的二氢噻吩类化合物，比较典型的有：2009年De Risi课题组报道的合成手性4,5-二氢噻吩的方法(N.Baricordi,S.Benetti,C.De Risi,M.Fogagnolo,G.P.Pollini and V.Zanirato,Lett.Org.Chem.,2009,6,593.)；2010年Xu课题组用手性二苯基脯氨醇硅醚作催化剂通过2,5-二羟基-1,4-二噻烷和α,β-不饱和醛之间的硫杂Michael/aldol串联反应得到高对映选择性的2,5-二氢噻吩(J.Tang,D.-Q.Xu,A.-B.Xia,Y.-F.Wang,J.-R.Jiang,S.-P.Luoand Z.-Y.Xu,Adv.Synth.Catal.,2010,352,2121.)。由于绝大多数天然产物和药物分子的构型对于其生物及药理活性起决定性作用，因此，能够合成具有对映选择性的二氢噻吩类化合物具有重要意义。再者，从低成本、绿色环保及可持续角度来讲，寻求新的手性二氢噻吩类化合物的合成方法也具有现实和长远的利益。
猪胃蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，主要在胃中起消化作用。近些年的研究表明猪胃蛋白酶具有催化多功能性，例如：2010年余课题组报道了猪胃蛋白酶能够催化丙酮和苯甲醛之间的aldol反应，对映选择性最高达44％(C.Li,Y.-J.Zhou,N.Wang,X.-W.Feng,K.Li and X.-Q.Yu,J.Biotechnol.,2010,150,539.)；2015-2016年本发明课题组陆续研究发现猪胃蛋白酶能催化直接不对称aldol反应合成手性邻二醇类化合物，获得了最高达75％的ee值(L.-Y.Li,D.-C.Yang,Z.Guan and Y.-H.He,Tetrahedron,2015,71,1659.)，还能催化芳香醛和环己酮或环戊酮之间的Morita-Baylis-Hillman(MBH)反应(J.-W.Xue,J.Song,I.C.Manion,Y.-H.He and Z.Guan,J.Mol.Catal.B:Enzym.,2016,124,62.)，并通过催化Knoevenagel/Michael/Michael串联反应能够合成高达＞99:1的非对映选择性的螺环氧化吲哚衍生物(Y.-H.He,T.He,J.-T.Guo,R.Li,Y.Xiang,D.-C.Yang and Z.Guan,Catal.Sci.Technol.,2016,DOI:10.1039/c5cy00987a.)。
基于猪胃蛋白酶较好的催化活性和较高的立体选择性，本发明拟深入研究其在不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物中的催化多功能性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪胃蛋白酶作为不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物的催化剂的用途及方法。本发明通过研究表明，猪胃蛋白酶能够较好的催化不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物，尤其能够较好地催化对映选择性二氢噻吩类化合物的合成，产物的ee值可高达84％。
本发明采取的技术方案如下：
1、猪胃蛋白酶作为催化剂在催化α,β-不饱和醛和巯基乙醛不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物中的应用。
优选的，所述α,β-不饱和醛为芳香α,β-不饱和醛、杂环芳香α,β-不饱和醛、或脂肪α,β-不饱和醛。
所述芳香α,β-不饱和醛中芳香基包括苯基和取代苯基类型，取代方式包括卤族元素取代及其它可能的取代方式；所述脂肪α,β-不饱和醛包括直链和支链类型。将α,β-不饱和醛写为通式
则R基可以为表10中所述基团。
优选的，所述反应以乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲苯、1,2-二氯乙烷、乙醚或它们与水或无机盐缓冲液的混合物作为溶剂。
优选的，所述反应以乙腈与磷酸盐缓冲液混合作为溶剂，乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为1:4；磷酸盐缓冲液的pH为6.5。
优选的，所述α,β-不饱和醛与巯基乙醛的摩尔比为1:6。
优选的，所述α,β-不饱和醛浓度为0.23mol/L，猪胃蛋白酶的浓度为11.267KU/mL。
优选的，所述巯基乙醛由2,5-二羟基-1,4-二噻烷原位生成，所述反应主要操作步骤为：将α,β-不饱和醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷按1:3的摩尔比加入反应容器中，并加入溶剂使α,β-不饱和醛的浓度维持在0.23mol/L，然后加入浓度11.267KU/mL的猪胃蛋白酶，30℃条件下搅拌反应96-168小时即可；所述溶剂由乙腈与pH6.5的磷酸盐缓冲液按体积比1:4混合而成。
2、猪胃蛋白酶催化α,β-不饱和醛和巯基乙醛发生不对称硫杂Michael/aldol串联反应生成二氢噻吩类化合物的方法，主要步骤为：将α,β-不饱和醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷按1:3的摩尔比加入反应容器中，并加入溶剂使α,β-不饱和醛的浓度维持在0.23mol/L，然后加入浓度11.267KU/mL的猪胃蛋白酶，30℃条件下搅拌反应96-168小时即可；所述溶剂由乙腈与pH6.5的磷酸盐缓冲液按体积比1:4混合而成。
猪胃蛋白酶催化α,β-不饱和醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷之间串联反应的可能的反应机理如下：首先32位的天冬氨酸残基作为碱从2,5-二羟基-1,4-二噻烷原位生成的巯基乙醛上夺取一个质子，然后活化的巯基乙醛与α,β-不饱和醛发生分子间的硫杂Michael加成反应，所得加成产物接受一个来自215位的天冬氨酸残基上的质子形成烯醇结构。接下来发生分子内的aldol反应生成四氢噻吩骨架，最后经过脱水过程得到二氢噻吩类产物。
本发明的有益效果在于：本发明通过实验证明猪胃蛋白酶具有确切的对所述反应的催化效果；并且本发明通过对反应溶剂、pH值、底物投料比等反应条件进行优化，最终获得了高达84％ee的对映选择性产物，且反应过程中无明显副产物生成。本发明所述合成方法具有低成本、绿色环保及可持续的优点，为合成具有对映选择性的二氢噻吩类化合物提供了一种新思路。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
一、实验仪器与试剂
LC-20AT型液相色谱仪，购自日本岛津公司；大赛璐手性色谱柱(AS-H，OD-H)；核磁共振仪(Bruker AVANCE DMX600型，600MHz，氘代氯仿为溶剂，四甲基硅烷为内标)购自Bruker BioSpin AG Ltd.。
猪胃蛋白酶(Pepsin from porcine gastric mucosa)购自西格玛-奥德里奇(中国上海)，EC号：3.4.23.1，CAS号：9001-75-6，产品货号：P7125-100G，产品批号：SLBD7698V，每毫克蛋白的活力为721U，酶的蛋白含量为18％；其活力定义为在pH 2.0和37℃条件下，每分钟水解血红蛋白所生成的溶于三氯乙酸溶液中的产物在280nm条件下检测吸光度变化0.001所需的酶量。
二、反应最佳条件的确定
选择肉桂醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷之间的不对称硫杂Michael/aldol串联反应作为模型反应，在该反应中，巯基乙醛的二聚体，2,5-二羟基-1,4-二噻烷，可以方便高效的在原位生成巯基乙醛。反应在圆底烧瓶中进行，加入肉桂醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷，溶剂，缓冲液或去离子水，猪胃蛋白酶，在一定温度下搅拌反应。用TLC监测反应，反应结束后过滤除去酶，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液经无水硫酸钠干燥，浓缩后得粗产物。用石油醚/乙酸乙酯做洗脱剂，经快速柱色谱法纯化粗产物得到目标产物。
1溶剂对猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的影响
溶剂作为反应介质对酶催化反应很重要，因为溶剂对酶的稳定性和催化活性，特别是立体选择性都有非常大的影响。为了优化实验条件，首先考察了不同溶剂对模型反应的影响(表1)。分析表1发现，不同溶剂对猪胃蛋白酶的催化效果，尤其是对映选择性有非常明显的影响。在乙腈中，酶表现出最好的对映选择性，获得了41％的ee值和17％的产率(表1，序号1)。在氯仿，甲苯和1,2-二氯乙烷中，该反应得到了较好的产率，达20-21％，但对映选择性非常低(表1，序号6-8)。在其他一些反应溶剂中要么产率更低，要么ee值更低，甚至在有些溶剂包括水中只观察到痕量的产物(表1，序号2-5和9-16)。这些结果可能受底物在溶剂中的溶解性以及猪胃蛋白酶和溶剂之间特定相互作用的影响。为了获得最好的对映选择性，我们选乙腈作为该反应最适合的反应介质。通过与已知文献的手性液相分析数据对比(J.Tang,D.-Q.Xu,A.-B.Xia,Y.-F.Wang,J.-R.Jiang,S.-P.Luo and Z.-Y.Xu,Adv.Synth.Catal.,2010,352,2121.)，所得产物3a的绝对构型为R构型。
表1溶剂的筛选a
a反应条件：肉桂醛(0.5mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(0.35mmol)，溶剂(0.90mL)，去离子水(0.10mL)和猪胃蛋白酶(6.5kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。c产率通过快速柱色谱法分离纯化测定。
2缓冲液pH对猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的影响
因为反应介质的pH影响酶的稳定性和催化活性，因此用磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 4.7-8.7)代替反应体系中的水来优化反应条件(缓冲液/乙腈＝1/9，v/v)(表2)。从表2中可以看出，磷酸缓冲液的加入可以明显的增强该反应的对映选择性。加入pH 6.5的磷酸缓冲液可以获得最好的对映选择性，达57％的ee值(表2，序号6)。然而，加入磷酸缓冲液没能提高反应产率。因此，以pH 6.5的磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH6.5，缓冲液/乙腈＝1/9，v/v)为最佳选择。
表2磷酸缓冲液的pH对模型反应的影响a
a反应条件：肉桂醛(0.5mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(0.35mmol)，乙腈(0.90mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 4.7-8.7，0.10mL)和猪胃蛋白酶(6.5kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
3投料比对猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的影响
如表3所示，考察底物投料比对模型反应的影响，改变底物的投料比，会明显影响反应结果。保持2,5-二羟基-1,4-二噻烷的量不变，增加肉桂醛的量，反应产物的产率增加但对映选择性降低(表3，序号1-6)。当只增加2,5-二羟基-1,4-二噻烷的量而不变肉桂醛的量时，反应产物的产率和ee值都有微弱增高的趋势(表3，序号1和7-10)。当反应底物肉桂醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷的投料比为1:3时，可以获得最高达60％的ee值和19％的产率(表3，序号8)。因此，选择此投料比为最佳投料比做进一步的研究。
表3底物投料比对模型反应的影响a
a反应条件：肉桂醛(0.35-1.75mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(0.35-1.75mmol)，乙腈(0.90mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0.10mL)和猪胃蛋白酶(6.5kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
4缓冲液的含量及溶剂的总体积对猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的影响
为了更进一步的优化反应条件，考察了反应体系中磷酸缓冲液的含量对模型反应的影响(表4)。当磷酸缓冲液(pH 6.5)的含量为20％时(缓冲液/乙腈＝1/4，v/v)，得到最高为24％的产率和59％的ee值(表4，序号5)。然后以此条件继续考察反应溶剂的总体积对模型反应的影响(表5)。值得高兴的是，当溶剂体积从1.00mL增加到1.50mL时，ee值从59％增加到70％，虽然产率有稍微的降低(表5，序号4)。为了获得更好的对映选择性，选择1.50mL作为最佳反应溶剂总体积。
表4磷酸缓冲液的含量对模型反应的影响a
a反应条件：肉桂醛(0.35mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(1.05mmol)，乙腈(1.00-0.60mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0-0.40mL)和猪胃蛋白酶(6.5kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b磷酸缓冲液的含量(％)：磷酸缓冲液在混合溶剂中所占的体积百分数。c产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
表5反应溶剂总体积对模型反应的影响a
a反应条件：肉桂醛(0.35mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(1.05mmol)，乙腈与磷酸缓冲液的体积比为4:1(磷酸缓冲液，NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5)和猪胃蛋白酶(6.5kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
5酶量对猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的影响
当进行酶量优化实验时，发现酶量极大的影响模型反应的产率(表6)。酶量从3.9kU增加到16.9kU，反应产物的产率明显提高，对映选择性基本保持不变(表6，序号1-6)。继续增加酶量到26.0kU，尽管产率有适当的提高，但是对映选择性开始降低(表6，序号6-9)。因此，选择16.9kU为最优酶量进行下一步研究。
表6酶量对模型反应的影响a
a反应条件：肉桂醛(0.35mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(1.05mmol)，乙腈(1.20mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0.30mL)和猪胃蛋白酶(3.9-26.0kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
6温度对猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的影响
温度在酶催化反应中也起着重要的作用，因为温度会影响酶的稳定性，选择性以及反应速率。为了更进一步考察猪胃蛋白酶的活性和选择性，研究了温度对它的影响(表7)。当温度从20℃升高到35℃时，反应产物的产率从33％增加到47％，对映选择性基本保持不变(表7，序号1-4)。然而，温度一旦超过35℃，反应产物的产率和ee值都开始降低(表7，序号5-8)。当温度高于40℃时，反应产物的产率和ee值都快速的减少(表7，序号7和8)，这是因为高温导致了猪胃蛋白酶的失活。总的来说，在30℃时，可以得到一个相对好的结果，46％的产率和70％的ee值(表7，序号3)。因此，在30℃下进行反应证明是最佳选择。
表7温度对模型反应的影响a
a反应条件：肉桂醛(0.35-1.75mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(0.35-1.75mmol)，乙腈(1.20mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0.30mL)和猪胃蛋白酶(16.9kU)在20-60℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
7猪胃蛋白酶催化的不对称硫杂Michael/aldol串联反应的时间进程
在前述优化后的最佳条件下，继续考察了反应时间对猪胃蛋白酶催化的模板反应的影响(表8)。总体来看，在反应早期阶段，随着时间的延长，产率逐渐增加，最后产率基本保持不变。在整个反应进程中，对映选择性都没有明显的改变。
表8模型反应的时间进程a
a反应条件：肉桂醛(0.35mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(1.05mmol)，乙腈(1.20mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0.30mL)和猪胃蛋白酶(16.9kU)在30℃条件下搅拌反应12-120小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
三、对照实验
为了证明猪胃蛋白酶催化该串联反应的具体催化效果，进行了一系列的对照实验(表9)。在没有猪胃蛋白酶的催化作用下，该空白反应仅得到痕量的产物(表9，序号2)，这表明猪胃蛋白酶确实对该串联反应起到了催化作用。猪胃蛋白酶的活性位点由32位和215位的两个天冬氨酸残基组成，羰基二咪唑(CDI)可以不可逆的共价结合羰基，因此，用羰基二咪唑来处理猪胃蛋白酶。用处理过后的猪胃蛋白酶催化该串联反应仅得到4％的产率和5％的ee值(表9，序号3)，这表明羰基二咪唑强烈抑制了猪胃蛋白酶催化该串联反应的活性。同时，实验发现羰基二咪唑本身对该串联反应不具有作用(表9，序号5)。这些实验结果表明，猪胃蛋白酶催化的该串联反应可能发生在活性位点上。另外，尿素作为失活剂，可以改变酶的构象，最终导致酶失去催化活性。因此，用尿素来处理猪胃蛋白酶，从表9，序号4可以看出，处理后的酶完全失去了催化活性。同时，尿素空白实验表明，尿素对该串联反应无作用(表9，序号6)。
表9模型反应对照实验
a除非特别说明，反应条件：肉桂醛(0.35mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(1.05mmol)，乙腈(1.20mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0.30mL)和猪胃蛋白酶(16.9kU)在30℃条件下搅拌反应96小时。b产率和ee值均通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。c猪胃蛋白酶(16.9kU)在CDI溶液中(1.2M，200mg羰基二咪唑溶于1mL四氢呋喃中)室温搅拌4小时，然后减压除掉四氢呋喃。d猪胃蛋白酶(16.9kU)在尿素溶液中(3.3M，200mg尿素溶液1mL去离子水中)室温搅拌24小时，然后冷冻干燥除掉去离子水。
四、猪胃蛋白酶催化不对称硫杂Michael/aldol串联反应的底物扩展
为了考察猪胃蛋白酶催化该串联反应的普遍适应性，优化完反应条件后，在最优反应条件下，用一系列的α,β-不饱和醛来与2,5-二羟基-1,4-二噻烷进行反应。如表10所示，吸电子取代和供电子取代的芳香α,β-不饱和醛都可以很好地与2,5-二羟基-1,4-二噻烷进行串联反应。芳香环上的取代基对产物的对映选择性有明显的影响。总体来说，供电子取代的芳香α,β-不饱和醛可以给出比吸电子取代的芳香α,β-不饱和醛更高的对映选择性(表10，序号2-10)。当芳香环上的取代基为卤原子时，不同卤原子取代的位置也同样影响产物的对映选择性。对位取代给出比邻间位取代更高的ee值(表10，序号5-9)。杂芳香α,β-不饱和醛，3-(2-呋喃基)丙烯醛，也可以很好的参与该串联反应，并且获得了最高的产率达53％和70％的ee值(表10，序号11)。除了(杂)芳香α,β-不饱和醛，脂肪链α,β-不饱和醛同样能参与该串联反应。直链脂肪α,β-不饱和醛给出一般的结果，只有35％的产率和40％的ee值(表10，序号12)，但是支链脂肪α,β-不饱和醛给出了最高的对映选择性，达84％的ee值和38％的产率(表10，序号13)。总体来说，整个底物扩展得到了中等到高的对映选择性，尽管反应产率不是那么高。在所有的反应中，都没有观察到有明显的副产物生成。在整个底物扩展中，发现反应所需的时间普遍较长，这表明酶作用于非天然底物时的速率和效果都不如其作用于天然底物。
表10猪胃蛋白酶催化不对称硫杂Michael/aldol串联反应的底物扩展a
a反应条件：α,β-不饱和醛(0.35mmol)，2,5-二羟基-1,4-二噻烷(1.05mmol)，乙腈(1.20mL)，磷酸缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.067M，pH 6.5，0.30mL)和猪胃蛋白酶(16.9kU)在30℃条件下搅拌反应相应时间。b产率通过快速柱色谱法分离纯化测定。c ee值通过手性高效液相色谱(HPLC)测定。
五、产物表征及分析
1、(R)-2-phenyl-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3a)
1H NMR(600MHz,CDCl3):9.71(s,1H),7.28-7.27(m,4H),7.22-7.19(m,1H),7.01-7.00(m,1H),5.50(d,J＝5.6Hz,1H),4.23-4.19(m,1H),4.02-3.98(m,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ＝187.0,148.8,148.7,142.3,128.6,127.5,54.9,38.8.HPLC analysis:Chiralpak AS-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0mL/min,λ＝240nm,tmajor＝15.4min,tminor＝19.3min.
2、(R)-2-(p-tolyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3b)
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝9.73(s,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,2H),7.09(d,J＝7.9Hz,2H),7.02-7.01(m,1H),5.49(d,J＝5.5 Hz,1H),4.24-4.20(m,1H),4.03-3.99(m,1H),2.30(s,3H)；13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ＝187.1,148.9,148.5,139.3,137.2,129.3,127.3,54.7,38.6,21.1.HPLC analysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 95:5,flowrate 0.5 mL/min,λ＝244 nm,tmajor＝23.0 min,tminor＝25.8 min.
3、(R)-2-(2-methoxyphenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3c)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.80(s,1H),7.20(ddd,J＝1.6,1.1,1.6 Hz,1H),7.12-7.10(m,1H),6.97(dd,J＝1.7,1.5 Hz,1H),6.87-6.85(m,2H),5.88(d,J＝5.6 Hz,1H),4.13-4.09(m,1H),3.98-3.94(m,1H),3.86(s,3H)；13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ＝187.2,156.5,150.1,148.0,130.5,128.5,127.0,120.7,111.0,55.7,47.9,38.2.HPLCanalysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝220 nm,tmajor＝18.8min,tminor＝15.1 min.
4、(R)-2-(4-methoxyphenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3d)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.73(s,1.0 Hz),7.22-7.20(m,2H),7.01-7.00(m,1H),6.83-6.81(m,2H),5.49(d,J＝5.5 Hz,1H),4.24-4.20(m,1H),4.03-4.00(m,1H),3.77(s,3H)；13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ＝187.1,159.0,148.9,148.3,134.4,128.6,114.0,55.3,54.5,38.6.HPLC analysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate1.0 mL/min,λ＝244 nm,tmajor＝14.9 min,tminor＝19.8 min.
5、(R)-2-(4-chlorophenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3e)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.73(s,1H),7.26-7.24(m,4H),7.04-7.03(m,1H),5.48-5.46(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.05-4.02(m,1H)；13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ＝186.8,148.9,148.6,140.8,133.2,128.9,128.7,54.3,38.8.HPLC analysis:ChiralcelOD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝240 nm,tmajor＝11.4 min,tminor＝13.1min.
6、(R)-2-(3-chlorophenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3f)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.74(s,1H),7.26(s,1H),7.22-7.17(m,3H),7.07-7.05(m,1H),5.45(d,J＝5.4 Hz,1H),4.26-4.22(m,1H),4.06-4.02(m,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ＝186.8,149.2,148.4,144.3,134.4,129.8,127.7,127.6,125.9,54.4,38.9.HPLC analysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝240 nm,tmajor＝11.3 min,tminor＝12.9 min.
7、(S)-2-(2-chlorophenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3g)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.74(s,1H),7.26(s,1H),7.22-7.17(m,3H),7.07-7.05(m,1H),5.45(d,J＝5.3 Hz,1H),4.26-4.22(m,1H),4.06-4.02(m,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ＝186.8,149.2,148.4,144.3,134.4,129.8,127.7,127.6,125.9,54.4,38.9.HPLC analysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝228 nm,tmajor＝15.7 min,tminor＝19.2 min.
8、(R)-2-(4-bromophenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3h)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.73(s,1H),7.41-7.40(m,2H),7.18-7.16(m,2H),7.04-7.03(m,1H),5.45(d,J＝5.5 Hz,1H),4.25-4.20(m,1H),4.05-4.01(m,1H)；13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ＝186.8,149.0,148.5,141.3,131.7,129.3,121.3,54.4,38.8.HPLCanalysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝236 nm,tmajor＝12.5 min,tminor＝13.9 min.
9、(S)-2-(2-bromophenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3i)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.81(s,1H),7.55(d,J＝10.0 Hz,1H),7.24-7.20(m,2H),7.09-7.05(m,2H),5.93(d,J＝5.5 Hz,1H),4.17-4.12(m,1H),4.04-4.00(m,1H)；13CNMR(150 MHz,CDCl3):δ＝186.8,150.6,147.6,141.4,133.1,128.8,127.8,123.8,53.9,38.3.HPLC analysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝236 nm,tmajor＝19.0 min,tminor＝23.5 min.
10、(R)-2-(4-nitrophenyl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3j)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.75(s,1H),8.15(d,J＝8.7 Hz,2H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H),7.13(s,1H),5.55(d,J＝5.8 Hz,1H),4.31-4.26(m,1H),4.13-4.09(m,1H)；13CNMR(150 MHz,CDCl3):δ＝186.7,149.8,149.5,148.0,128.5,123.9,54.2,39.1.HPLCanalysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0 mL/min,λ＝220 nm,tmajor＝31.0 min,tminor＝33.9 min.
11、(S)-2-(furan-2-yl)-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3k)
1H NMR(600 MHz,CDCl3):δ＝9.79(s,1H),7.31(d,J＝1.1 Hz,1H),7.08-7.06(m,1H),6.30-6.29(m,1H),6.15(d,J＝3.2 Hz,1H),5.60(d,J＝5.3 Hz,1H),4.23-4.19(m,1H),4.00-3.95(m,1H)；13C NMR(150 MHz,CDCl3):δ＝186.8,153.4,149.8,146.0,142.1,110.7,106.6,47.3,38.3.HPLC analysis:Chiralcel OD-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flowrate 1.0mL/min,λ＝232 nm,tmajor＝16.2 min,tminor＝14.1 min.
12、(R)-2-propyl-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3l)
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝9.75(s,1H),6.85(dd,J＝4.1,2.9Hz,1H),3.97–3.93(m,1H),3.85–3.81(m,1H),2.01–1.95(m,1H),1.57–1.51(m,2H),1.43–1.35(m,2H),0.90(t,J＝7.4Hz,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ＝187.9,149.6,149.4,52.1,38.3,37.5,20.5,13.7.HPLC analysis:Chiralpak AS-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0mL/min,λ＝236nm,tmajor＝6.6min,tminor＝7.4min.
13、(R)-2-isopropyl-2,5-dihydrothiophene-3-carbaldehyde(3m)
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.76(s,1H),6.92–6.90(m,1H),4.54–4.53(m,1H),3.83–3.80(m,2H),2.42–2.39(m,1H),0.95(d,J＝6.8Hz,3H),0.77(d,J＝6.7Hz,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3):δ＝187.8,150.5,148.6,59.5,37.7,30.3,21.8,15.2.HPLC analysis:Chiralpak AS-H,n-hexane/i-PrOH 90:10,flow rate 1.0mL/min,λ＝244nm,tmajor＝7.0min,tminor＝7.9min.
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.猪胃蛋白酶作为催化剂在催化α,β-不饱和醛和巯基乙醛不对称硫杂Michael/aldol串联反应合成二氢噻吩类化合物中的应用，其特征在于，所述α,β-不饱和醛为芳香α,β-不饱和醛、杂环芳香α,β-不饱和醛、或脂肪α,β-不饱和醛；所述反应在30℃条件下搅拌反应96-168小时；
所述α,β-不饱和醛的通式
，其中R为-Ph、4-MeC6H4-、2-OMeC6H4-、4-
OMeC6H4-、4-ClC6H4-、3-ClC6H4-、2-ClC6H4-、4-BrC6H4-、2-BrC6H4-、4-NO2C6H4-、2-furanyl -、
propyl或i-propyl；
所述反应以乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲苯、1,2-二氯乙烷、乙醚或它们与水或无机盐缓冲液的混合物作为溶剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应以乙腈与磷酸盐缓冲液混合作为溶剂，乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为1:4；磷酸盐缓冲液的pH为6.5。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α,β-不饱和醛与巯基乙醛的摩尔比为1:6。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α,β-不饱和醛浓度为0.23mol/L，猪胃蛋白酶的浓度为11.267KU/mL。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述巯基乙醛由2,5-二羟基-1,4-二噻烷原位生成，所述反应主要操作步骤为：将α,β-不饱和醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷按1:3的摩尔比加入反应容器中，并加入溶剂使α,β-不饱和醛的浓度维持在0.23 mol/L，然后加入浓度11.267KU/mL的猪胃蛋白酶，30℃条件下搅拌反应96-168小时即可；所述溶剂由乙腈与pH6.5的磷酸盐缓冲液按体积比1:4混合而成。
6.猪胃蛋白酶催化α,β-不饱和醛和巯基乙醛发生不对称硫杂Michael/aldol串联反应生成二氢噻吩类化合物的方法，其特征在于，主要包括以下步骤为：将α,β-不饱和醛和2,5-二羟基-1,4-二噻烷按1:3的摩尔比加入反应容器中，并加入溶剂使α,β-不饱和醛的浓度维持在0.23 mol/L，然后加入浓度11.267KU/mL的猪胃蛋白酶，30℃条件下搅拌反应96-168小时即可；所述溶剂由乙腈与pH6.5的磷酸盐缓冲液按体积比1:4混合而成；
所述α,β-不饱和醛的通式
，其中R为-Ph、4-MeC6H4-、2-OMeC6H4-、4-
OMeC6H4-、4-ClC6H4-、3-ClC6H4-、2-ClC6H4-、4-BrC6H4-、2-BrC6H4-、4-NO2C6H4-、2-furanyl -、
propyl或i-propyl；
所述反应以乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲苯、1,2-二氯乙烷、乙醚或它们与水或无机盐缓冲液的混合物作为溶剂。
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| Chymopapain-catalyzed direct asymmetric aldol reaction.;Yan Hong He等;《Synthesis & catalysis》;20120331;第354卷(第4期);全文 * |
| Enzyme-catalyzed domino reaction: efficient construction of spirocylic oxindole skeleton using porcine pepsin.;Yan Hong He等;《Catal.Sci.Technol》;20151103;第6卷;全文 * |
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