CN105722987A

CN105722987A - 通过固定C1和生产C3的厌氧微生物培养物的共生布置从合成气生产含有n-丙醇和其他C3碳的产物的方法

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Publication number: CN105722987A
Application number: CN201480014307.5A
Authority: CN
Inventors: R·托比; R·达塔; M·恩泽恩; R·希基; W·莱文森
Original assignee: Coskata Inc
Current assignee: Coskata Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-06-29
Also published as: WO2014140336A1; US20140273123A1

Abstract

本发明提供了生产丙醇的方法和系统。具体而言，本发明的方法和系统使用厌氧微生物培养物的共生布置用于从合成气生产丙醇。

Description

通过固定C1和生产C3的厌氧微生物培养物的共生布置从合成气生产含有n-丙醇和其他C3碳的产物的方法

发明领域

本发明提供了使用固定C1和生产C3的厌氧微生物培养物的共生布置从合成气生产含有n-丙醇和其他C3的产物的方法和系统。

发明背景

丙醇是工业上使用的溶剂，但更重要地，其可以容易地脱水以生产丙烯，丙烯是世界上第二大化学商品，每年生产>7千万吨。目前丙烯主要通过石脑油或液体石油气的蒸汽裂化或气油的流体催化裂化在非常大的设施中作为次级产物生产。蒸汽裂化是制备大多数乙烯和许多其他共产物，诸如丁烯、丁二烯和热解汽油的方法，所述产物全部需要同时纯化和利用。制备丙烯的其他方法是精炼厂FCC(流体催化裂化)，在此丙烯是来自重气油的副产物，比例在3和15wt％之间。也可以通过丙烷的催化脱氢生产丙烯。制备丙烯的另一种方法是经由丁烯与乙烯的置换作用。

许多世纪以来，在酿酒酵母的帮助下将简单的糖发酵为乙醇。已经开发了最近十年的从纤维素和半纤维素开始的新途径以将更复杂的碳水化合物发酵为乙醇。对此，碳水化合物需要从木质纤维素生物质释放。生物质约由30％纤维素、35％半纤维素和25％木质素组成。木质素级分不能作为乙醇定价，因为其芳香性质但仅可以作为能源使用，这在许多情况中对于运行工厂显示出过量。

若干微生物能够使用一碳化合物作为碳源并且一些甚至作为能源。二氧化碳是光养菌、硫酸盐还原菌、产甲烷菌、产乙酸菌和化学无机营养微生物的重要碳源。基本上有4种固定CO₂的系统：(1)卡尔文循环[CO₂固定酶:核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶]，(2)还原性柠檬酸循环[CO₂固定酶:2-酮戊二酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合酶],(3)乙酰-CoA途径[CO₂固定酶:乙酰-CoA合酶，与CO-脱氢酶相联]和(4)3-羟基丙酸循环[CO₂固定酶:乙酰-CoA羧化酶，丙酰-CoA羧化酶](“StructuralandfunctionalrelationshipsinProkaryotes”,L.Barton,Springer2005；“Carbonmonoxide-dependentenergymetabolisminanaerobicbacteriaandarchaea”,E.Oelgeschelager,M.Rother,Arch.Microbiol.,190,第257页,2008；“Lifewithcarbonmonoxide”,S.Ragsdale,CriticalReviewsinBiochem.andMol.Biology,39,第165页,2004)。若干微生物也可以使用一氧化碳：

细菌：

●产乙酸菌(如伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii),巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)等)

●一氧化碳营养菌(如Alcaligenescarboxydus、施氏芽胞杆菌(Bacillusschlegelii)、Pseudomonascarboxydoflava、Pseudomonascompransori)

●甲烷营养菌(如甲烷假单孢杆菌(Pseudomonasmethanica)、甲烷甲基弯曲菌(Methylosinusmethanica)、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus))

●固氮菌(如氮单胞菌属B1、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum))

●光养菌(如Rhodocyclusgelatinosa、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis))

●硫酸盐还原菌(如自养脱硫杆菌(Desulfobacteriumautotrophicum)、乙酸氧化脱硫肠状菌(Desulfotomaculumacetoxidans)、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)、普通脱硫弧菌(Desulfovibriovulgaris))

古细菌:

●产甲烷菌(如甲烷杆菌属、thermoautotrophicum,Methanosarcinabarkeri,Methanothrixsoehngenii)

一氧化碳营养菌使用含有钼的CO-脱氢酶将CO氧化为CO₂并进一步使用卡尔文循环以固定CO₂。产乙酸菌可以使用含有镍-铁的CO-脱氢酶互变CO-CO₂。此CO-脱氢酶与在Wood-Ljungdahl途径中固定CO₂的乙酰-CoA合酶相联。

最近正在开发更有效率的途径，所述途径从含碳的材料生产合成气并随后将其发酵为乙醇(“Bioconversionofsynthesisgasintoliquidorgaseousfuels”,K.Klasson,M.Ackerson,E.Clausen,J.Gaddy,EnzymeandMicrobialTechnology,14(8),第602页,1992；“FermentationofBiomass-GeneratedProducerGastoEthanol”,R.Datar,R.Shenkman,B.Cateni,R.Huhnke,R.Lewis,BiotechnologyandBioengineering,86(5),第587页,2004；“Microbiologyofsynthesisgasfermentationforbiofuelproduction”,A.Hemstra,J.Sipma,A.Rinzema,A.Stams,CurrentOpinioninBiotechnology,18,第200页,2007；“OldAcetogens,NewLight”,H.Drake,A.S.Daniel,Ann.N.Y.Acad.Sci.1125:100–128,2008)。合成气可以通过整个生物质的气化生产而无需释放某些级份。合成气也可以从其他原料经由气化：(i)煤，(ii)市政废品，(iii)塑料废品，(iv)石油焦和(v)来自精炼厂或来自纸工业的液体残余物(黑液)生产。合成气也可以从天然气经由蒸汽重整或自热重整(部分氧化)生产。对于常规的甲醇合成，较高的醇合成或Fischer-Tropsch，需要约2的氢气比一氧化碳比例。在氢气少的原料的气化的情况下，该比例将低于1并因此需要水煤气变换(CO+H₂O→CO₂+H₂)以调整比例。将合成气转化为乙醇的生物化学途径关于氢气比一氧化碳比例的严格性要低得多。

合成气转化的生物化学途径由Wood-Ljundahl途径描述。合成气的发酵提供了若干优势，诸如生物催化剂的高特异性，较低的能量成本(因为低压和低温生物转化条件)，对生物催化剂中毒的更大的抗性和对预先设定的H₂比CO比率几乎没有限制(“Reactordesignissuesforsynthesis-gasfermentations”M.Bredwell,P.Srivastava,R.Worden,BiotechnologyProgress15,834–844,1999；“Biologicalconversionofsynthesisgasintofuels”,K.Klasson,C.Ackerson,E.Clausen,J.Gaddy,InternationalJournalofHydrogenEnergy17,第281页,1992)。产乙酸菌是能够将合成气组分，如CO,CO₂和H₂经由还原性乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径转化为乙酸盐的一组厌氧细菌。

已经分离了具有将合成气发酵为乙醇、乙酸和其他有用终产物的能力的若干种厌氧细菌。扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)和Clostridiumautoethanogenum，是首先得知的将CO,CO₂和H₂转化为乙醇和乙酸的生物中的两种。通常称为产乙酸菌的这些微生物具有将CO₂还原为乙酸盐以生产所需要的能量和生产细胞团的能力。使用合成气组分的三种不同组合的乙醇合成的总体化学计量学如下(J.Vega,S.Prieto,B.Elmore,E.Clausen,J.Gaddy,“TheBiologicalProductionofEthanolfromSynthesisGas”,AppliedBiochemistryandBiotechnology,20-1,第781页,1989):

6CO+3H₂O→CH₃CH₂OH+4CO₂

2CO₂+6H₂→CH₃CH₂OH+3H₂O

6CO+6H₂→2CH₃CH₂OH+2CO₂

产乙酸细菌是严格厌氧微生物，其利用乙酰-CoA途径作为其从CO₂还原性合成乙酰-CoA的主要机制(Drake,H.L.(1994).Acetogenesis.NewYork:Chapman&Hall)。这组微生物在其可以使用简单的气体如CO₂/H₂和CO以及糖、羧酸、醇和氨基酸的意义上来说是甚至更通用的。

扬氏梭菌，最先已知将合成气发酵为乙醇的自养微生物之一，于1987分离，作为产乙酸菌其在其活跃生长期喜好生产乙酸盐(产乙酸)而乙醇主要作为非生长相关产物生产(溶剂产生)(“Biologicalconversionofsynthesisgasintofuels”,K.Klasson,C.Ackerson,E.Clausen,J.Gaddy,InternationalJournalofHydrogenEnergy17,第281页,1992)。

粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)是产乙酸菌，分离自栖息地如人肠、瘤胃、污水和土壤，在高CO浓度下表现出高生长速率，生产乙酸盐、乙醇、丁酸盐和异丁酸盐(I.Chang,B.Kim,R.Lovitt,J.Bang,“EffectofCOpartialpressureoncell-recycledcontinuousCOfermentationbyEubacteriumlimosumKIST612”,ProcessBiochemistry,37(4),第411页,2001)。

产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus)是嗜温的、革兰氏阳性厌氧性球菌，发现于人肠中并且能够代谢CO₂/H₂或CO以生产乙酸盐(W.Lorowitz,M.Bryant,“PeptostreptococcusproductusStrainThatGrowsRapidlywithCOastheEnergy-Source”,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,47(5),第961页,1984)。

Clostridiumautoethanogenum是严格厌氧的、革兰氏阳性的、成孢子的、棒状的、运动细菌，其代谢CO以形成乙醇、乙酸盐和CO₂作为终产物，除其使用CO₂和H₂、丙酮酸盐、木糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖和L-谷氨酸盐作为底物的能力外(J.Abrini,H.Naveau,E.Nyns,“Clostridiumautoethanogenum,Sp-Nov,anAnaerobicBacteriumThatProducesEthanolfromCarbon-Monoxide”,ArchivesofMicrobiology,161(4),第345页,1994)。

ClostridiumcarboxidivoransP7是生产溶剂的厌氧微生物，其分离自农业沉降泻湖的沉积物。其是运动的、革兰氏阳性的、成孢子的并且主要是产乙酸的，形成乙酸盐、乙醇、丁酸盐和丁醇作为终产物(J.Liou,D.Balkwill,G.Drake,R.Tanner,“Clostridiumcarboxidivoranssp.nov.,asolvent-producingclostridiumisolatedfromanagriculturalsettlinglagoon,andreclassificationoftheacetogenClostridiumscatologenesstrainSL1asClostridiumdrakeisp.nov.”,InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,55(5),第2085页,2005)。

产乙酸菌是严格厌氧细菌，其使用还原性乙酰-CoA途径作为其主要的(i)从CO₂还原性合成乙酰-CoA的机制，(ii)末端电子接收、能量保存过程，和(iii)从CO₂合成细胞碳的机制(Drake,H.L.(1994).Acetogenesis.NewYork:Chapman&Hall)。像其他厌氧微生物一样，产乙酸菌需要不同于氧气的末端电子受体。在乙酰-CoA途径中，CO₂充当电子受体并且H₂充当电子供体。从CO₂和H₂合成乙酰-CoA需要涉及以下三个步骤的CO₂的8电子还原：

乙酰-CoA的羰基前体的形成

乙酰-CoA的甲基前体的形成

以上两个前体的缩合以形成乙酰-CoA。

厌氧产乙酸微生物提供了经由发酵方法将废气，诸如合成气，转化为有用的产物，诸如乙醇的可行的途径。此类细菌以比通过传统生产方法可达到的更高的特异性，更高的收率和更低的能量成本催化H₂和CO₂和/或CO转化为酸和/或醇。尽管在乙醇发酵中利用的许多厌氧微生物也生产少量的丙醇作为副产物，迄今，尚没有描述一种能够利用发酵方法以生产高收率的丙醇的厌氧微生物。

因此本领域仍然需要在使用间接发酵生产丙醇中使用微生物的方法。

发明总结

已经发现了生产丙醇和/或丙酸的方法，所述方法通过在有效将气体底物转化为乙醇或乙酸盐的条件下，将一氧化碳和/或二氧化碳和氢气的气体底物暴露给在第一发酵区中的固定C1的微生物；并在有效将乙醇和/或乙酸盐转化为丙酸盐的条件下，将在第一发酵区中生产的乙醇和/或乙酸盐传给第二发酵区中含有的生产C3的微生物。在大多数情况下生产C3的微生物是产丙酸菌。也在大多数情况下第二发酵区生产丙酸盐，将其传给第一发酵区以生产丙醇。此外，气体通常是合成气。

在该方法的修改的形式中，在浮游态下培养固定C1的微生物并且作为固定在支持物上的细胞培养固定C3的微生物。固定的支持物可采取膜的形式，所述膜确定了其中保留细胞的孔。

在替代的形式中，公开了用于将合成气转化为丙醇和/或丙酸的厌氧共生系统，该系统包含合成气、培养基、第一发酵区中的固定C1的微生物、第二发酵区中的生产C3的微生物、CO₂和H₂源和用于在第一发酵区中的固定C1的微生物和第二发酵区中的生产C3的微生物之间交换培养基的转移导管。同样在大多数情况下，生产C3的微生物是产丙酸菌。

附图简述

本发明的这些和其他目的、特征和实施方式将从以下详细描述与附图的组合中更好地理解，其中：

图1是本发明的厌氧微生物培养物的共生关联的实施方式的示意图。固定C1的微生物从合成气生产乙醇和乙酸盐。共生的生产C3的微生物将乙醇、乙酸盐和(其次地H₂/CO/CO₂)转化为含有C3的产物，即丙酸盐和丙醇。固定C1的微生物也将丙酸盐转化为丙醇，丙醇变为主要终产物。

图2是厌氧微生物所使用的用于C3(丙酸盐)生产的甲基丙二酰-琥珀酸途径的详细说明。

图3是厌氧微生物所使用的用于C3(丙酸盐/丙醇)生产的乳酸-丙烯酸途径的详细说明。

图4显示了本发明的发酵区的布置的一个实施方式，其中固定C1的厌氧微生物在浮游发酵反应器中发酵并且生产C3的厌氧微生物在膜发酵反应器中发酵。

发明详述

本发明提供了通过厌氧微生物培养物的共生布置从合成气生产含有丙醇和其他C3的产物的方法。在其他方面，本发明提供了用于将合成气转化为丙醇的厌氧系统。

如本文所用，合成气(synthesisgas)(合成气(syngas))是含有一氧化碳、二氧化碳和通常氢气的气体。“合成气”包括这样的气流，其含有二氧化碳与氢气的组合并且可包括少量或不包括一氧化碳。“合成气”也可以包括可有少量或没有氢气的一氧化碳气流。

如本文所用，术语“共生的”指两种或多种不同类型(例如，生物、种群、株、种、属、科等)的厌氧微生物的关联，所述厌氧微生物能够形成紧密关联的代谢共生。

在图1中说明的本发明的实施方式中，利用两类厌氧微生物以创造共生关联用于生产丙醇。共生关联中的第一类微生物是主要的固定C1的微生物，其利用合成气作为唯一碳源和电子源并且生产乙醇和乙酸盐作为异化代谢产物。共生关联中的第二类微生物能够在固定C1的微生物的异化代谢物(乙醇和乙酸盐)上生长作为其唯一碳源和/或电子源以生产C3碳分子，诸如丙醇或丙酸，作为其主要产物或连同合成气(作为额外的碳和/或电子源)将固定C1碳的微生物的代谢物转化为C3碳分子。该第二种微生物在本文应当称为生产C3微生物。有利地，固定C1的微生物也可以能够将由生产C3的微生物生产的丙酸盐转化为丙醇。

本发明的固定C1的微生物也是同型产乙酸菌。在厌氧条件下，同型产乙酸菌具有从底物，CO+H₂O,或H₂+CO₂或CO+H₂+CO₂生产乙酸和乙醇的能力。CO或CO₂提供了碳源并且H₂或CO提供了电子源，用于生产乙酸和乙醇的反应。根据以下反应由同型产乙酸菌通过CO和/或H₂和CO₂的发酵所生产的主要产物是乙醇，如此使得固定C1的微生物充当了使用乙酰-CoA途径的产溶剂同型产乙酸菌：

6CO+3H₂O→C₂H₅OH+4CO₂

6H₂+2CO₂→C₂H₅OH+3H₂O

同型产乙酸菌也可以生产乙酸盐。乙酸盐生产经由以下反应发生：

4CO+2H₂O→CH₃COOH+2CO₂

4H₂+2CO₂→CH₃COOH+2H₂O

适用于本发明方法中的固定C1的微生物包括，但不限于，同型产乙酸菌诸如扬氏梭菌,Clostridiumautoethanogenum,Clostridiumragsdalei,和Clostridiumcoskatii。适用于本发明的额外的固定C1的微生物包括Alkalibaculumbacchi,Clostridiumthermoaceticum,和乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)。

生产具有三个碳的氧化物的途径：丙酸生产：丙酸杆菌属(Propionibacterium)物种：(产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、环己烷丙酸杆菌(Propionibacteriumcyclohexanicum)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacteriumfreudenreichiishermanii))和若干其他厌氧细菌诸如丙酸脱硫叶菌(Desulfobulbuspropionicus)、福瑞森加梳状菌(Pectinatusfrisingensis)、丙酸暗杆菌(Pelobacterpropionicus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、月形单胞菌属(Selenomonas),梭杆菌属(Fusobacterium)和梭菌属(Clostridium)，特别是丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)，生产丙酸作为主要发酵产物(PlayneM.,“Propionicandbutyricacids”,于:Moo-YoungM,编著.Comprehensivebiotechnology,NewYork:PergamonPress,第3卷,第731-759页,1985；SeshadriN,MukhopadhyayS.,“InfluenceofenvironmentalparametersonpropionicacidupstreambioprocessingbyPropionibacteriumacidi-propionici”,J.Biotechnology29,第321-328页,1993)。在瑞士型干酪中，丙酸杆菌消耗乳酸盐并生产丙酸、乙酸和CO₂。一般而言，可以将广泛范围的底物转化为丙酸，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油和乳酸盐。丙酸杆菌是革兰氏阳性的、非运动性的、不形成孢子的、短棒状的、嗜温厌氧微生物。属于高G+C放线菌纲的丙酸杆菌属分为两组：“皮肤的”和“乳制品的”丙酸杆菌属，基于其栖息地(Stackebrandt,E.,Cummins,C.,Johnson,J.,“TheGenusPropionibacterium”,于TheProkaryotes,E.Balows,H.Truper,M.Dworkin,W.Harder,K.Scheifer,编辑,2006)。

二羧酸途径：丙酸杆菌主要经由二羧酸途径(也称为Wood-Werkman循环或甲基-丙二酰-CoA途径)转化碳源以生产丙酸作为主要产物，如图2中所显示。糖酵解途径将葡萄糖分解代谢为磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)，富含能量的代谢物。存在两个备选的糖酵解途径：Embden-Meyerhorf-Parnaz(EMP)途径和己糖单磷酸(HMP)途径。在EMP途径中，将1摩尔葡萄糖转化为2摩尔PEP和2摩尔NADH，而在HMP途径中1摩尔葡萄糖提供5/3摩尔的PEP和11/3摩尔的NADH。PEP进一步转化为两种可能的中间物，丙酮酸盐和草酰乙酸盐。大部分PEP转化为丙酮酸盐而剩余的PEP转化为草酰乙酸盐。对于丙酮酸盐生产，1摩尔PEP转化为1摩尔的丙酮酸盐并且1摩尔ATP获自一个磷酰基部分从PEP转移至ADP。获自EMP和HMP途径的总ATP每摩尔葡萄糖分别是2和5/3摩尔。经由EMP途径的糖酵解提供了更低量的NADH(EMP:HMP＝2:11/3)但更高量的ATP(EMP:HMP＝2:5/3)。糖酵解中EMP与HMP途径贡献的比例依赖于丙酸杆菌物种，底物和发酵条件。在丙酮酸盐节点处，丙酮酸盐指向三个主要途径。大多数丙酮酸盐经由Wood-Werkman循环转化为丙酸。一些丙酮酸盐转化为乙酸盐而一些并入到生物质中。在丙酸盐形成途径中，丙酮酸盐经由羧基部分从甲基丙二酰-CoA至丙酮酸盐的转羧基作用，进入Wood-Werkman循环，所述转羧基作用由草酰乙酸转羧酶在丙酮酸盐至草酰乙酸盐和甲基丙二酰CoA至丙酰CoA的偶联反应中催化。在此偶联的反应中，从甲基丙二酰CoA转移至丙酮酸盐以形成丙酰CoA和草酰乙酸盐的羧基基团从未从反应中释放或未观察到此羧基基团与发酵肉汤中溶解的CO₂之间的交换(WoodHG.,“Metaboliccyclesinthefermentationofpropionicacid”,于CurrentTopicsinCellularregulation,Estabrook和SreraRW,编辑,NewYork:AcademicPress.第18卷,第225-287页,1981)。因为此转羧基反应，CO₂固定是最低的并且仅仅用于生产催化剂量的草酰乙酸盐以再次启动循环当例如琥珀酸盐作为终产物积累时。在此类情况下，通过由PEP羧化酶催化的CO₂与磷酸烯醇丙酮酸盐的缩合生成草酰乙酸盐。随后，通过苹果酸脱氢酶将草酰乙酸盐转化为苹果酸盐，通过延胡索酸酶将苹果酸盐转化为延胡索酸盐并且进一步延胡索酸盐转化为琥珀酸盐，由琥珀酸脱氢酶催化。在此之后，琥珀酸盐转化为琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA然后转化为甲基丙二酰-CoA。甲基丙二酰-CoA由草酰乙酸转羧酶转化为丙酰-CoA。在循环末，丙酰-CoA转化为丙酸盐，连同琥珀酸盐至琥珀酰-CoA的偶联的反应，由丙酰-CoA：琥珀酸转移酶催化。在1摩尔丙酮酸盐进入Wood-Werkman循环后，生成1摩尔丙酸盐，2摩尔NAD+，和1摩尔ATP。除了作为主要的发酵产物，在Wood-Werkman循环中生产的丙酸之外，在此循环中也发生用于糖酵解的NAD+再生。

在乙酸盐分支途径中，丙酮酸盐转化为乙酰-CoA和CO₂，由丙酮酸脱氢酶复合物催化。乙酰-CoA由磷酸转乙酰酶转化为乙酰磷酸并进一步乙酰磷酸转化为乙酸盐，由乙酸激酶催化。在乙酸盐分支途径中，1摩尔乙酸盐，CO₂，NADH，和ATP获自1摩尔丙酮酸盐。丙酸生产通常伴有乙酸盐形成作为主要ATP生产途径供应细胞代谢的能量。以下等式代表了来自葡萄糖或乳酸盐的丙酸发酵的理论方程式(P.Piveteau,Lait,79,第23页,1999)：

1.5葡萄糖+6Pi+6ADP→2丙酸盐+乙酸盐+CO₂+2H₂O+6ATP

3乳酸+3Pi+3ADP→2丙酸盐+乙酸盐+CO₂+2H₂O+3ATP

根据这些等式，来自葡萄糖的理论最大收率是66.7C-摩尔％或54.8wt％的丙酸，22.2C-摩尔％或22wt％的乙酸，11.1C-摩尔％或17wt％的CO₂。理论上丙酸比乙酸(P/A)摩尔比是2:1。可以通过使用具有更高还原性水平的碳源完成代谢途径朝向丙酸生产的变化(从异型发酵到同型发酵的酸生产的变化)。底物的更高还原性水平可以导致P/A比例的显著增加，由于细胞内NADH/NAD+平衡。能够预期从甘油生产丙酸的更好的效率因为其较之常规底物的更高的还原水平。有效地，使用产丙酸丙酸杆菌已经从甘油获得了84.4C-摩尔％的丙酸收率和低乙酸生产(P/A摩尔比例达到37)(Barbirato,F.,Chedaille,D.和Bories,A.,“Propionicacidfermentationfromglycerol:comparisonwithconventionalsubstrates”,ApplMicrobiolBiotechnol,47,第441-446页,1997)。该菌株也从甘油生产一些丙醇，提示当底物具有更高还原水平时，也可以生产具有更高还原水平的产物因为更好的NADH/NAD+平衡。

甘油→丙酸盐+1H₂O

Himmi等人比较了产丙酸丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌谢氏亚种的甘油和葡萄糖的发酵和产物形成。发酵终产物是丙酸作为主要产物，乙酸作为主要副产物和两种少量代谢物，n-丙醇和琥珀酸。丙酸的收率高至79C-摩尔％(64wt％)而甘油作为碳源(Himmi,E.H.,Bories,A.,Boussaid,A.和Hassani,L.,“PropionicacidfermentationofglycerolandglucosebyPropionibacteriumacidipropioniciandPropionibacteriumfreudenreichiissp.Shermanii”,ApplMicrobiolBiotechnol,53,第435-440页,2000)。经由二羧酸途径发酵乳酸盐的瘤胃微生物，当添加氢气时相对于乙酸盐生产更多丙酸盐(M.Schulmanda和D.Valentino,“FactorsInfluencingRumenFermentation:EffectofHydrogenonformationofPropionate”,JournalofDairyScience,vol.59(8),第1444-1451页,1976)。当在使用含有氢化酶的栖树丙酸螺菌(Propionispiraarboris)的发酵期间施用高H₂压力时，几乎消除了乙酸(ThompsonT.E,ConradR,ZeikusJ.G.,“RegulationofcarbonandelectronflowinPropionispiraarboris:Physiologicalfunctionofhydrogenaseanditsroleinhomopropionateformation”,FEMSMicrobiolLett22,第265-271页,1984和美国专利4732855)。

根据Wood-Werkman循环，通过丙酸杆菌从葡萄糖、乳糖、或乳酸盐发酵释放内源CO₂并形成乙酸(DebordeC.,BoyavalP.2000,InteractionsbetweenpyruvateandlactatemetabolisminPropionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermanii:Invivo13Cnuclearmagneticresonancestudies,ApplEnvironMicrobiol66:2012-2020)。CO₂可以在丙酸杆菌中固定以通过PEP羧化酶催化从PEP形成草酰乙酸盐并然后导致琥珀酸盐生成。基于代谢途径(Wood-Werkman循环)，需要CO₂(HCO₃-)以将磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)由酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸盐。通过若干顺序反应，草酰乙酸盐最终转化为丙酸。在甘油作为底物的情况下，几乎没有乙酸盐并因此生产CO₂。在发酵期间施用外源CO₂对代谢物生产速率并且特别是更高的琥珀酸盐积累具有积极效果，由于更高的PEP羧化活性(“EffectofcarbondioxideonpropionicacidproductivityfromglycerolbyPropionibacteriumacidipropionici”,AnZhang和Shang-TianYang,SIMannualmeetingandExhibition,SanDiego,2008)。

大多数生产丙酸的细菌具有三羧酸循环(TCA)的酶，这解释了不同菌株的可变P/A比例。在TCA循环中通过与丙酮酸盐缩合为柠檬酸盐可以利用一些乙酰-CoA(见图2)。最终结果是通过脱羧作用在TCA循环中生产更多的CO₂并分泌较少的乙酸盐。已经报道了来自葡萄糖的从2.1至14.7的P/A比例和从1.0至6.3的CO₂/乙酸盐比例(WoodHG.,“Metaboliccyclesinthefermentationofpropionicacid”,于CurrentTopicsinCellularregulation,Estabrook和SreraRW,编辑,NewYork:AcademicPress.第18卷,第225-287页,1981)。

已经显示使用二羧酸途径的丙酸暗杆菌在作为底物的乙醇上生产同时在CO₂存在下生产丙酸盐(Schink,B.,Kremer,D.和Hansen,T.,“PathwayofpropionateformationfromethanolinPelobacterpropionicus”,Arch.Microbiol.147,321-327,1987和S.Seeliger,P.Janssen,B.Schink,“Energeticsandkineticsoflactatefermentationtoacetateandpropionateviamethylmalonyl-CoAoracrylyl-CoA”,FEMSMicrobiologyLetters,211,第65-70页,2002)。当将乙醇与CO₂和氢气共同进料时，生产显著量的丙醇。乙醇转化为乙酰-CoA(经由乙醛)同时生产电子用于乙酰-CoA羧化为丙酮酸盐，由丙酮酸合酶催化。与二羧酸途径组合，从乙醇和CO₂生产丙酸盐(Schink等人,1987)。

3乙醇+2HCO₃-→2丙酸盐-+乙酸盐-+H++3H₂0

丙酸暗杆菌不能将乙酸盐和CO₂还原性地转化为丙酸盐然而丙酸脱硫叶菌从乙酸盐和CO₂制造丙酸盐(Schink等人,1987).

乙酸盐-+HCO₃-+3H₂→丙酸盐-+3H₂0

丙烯酸盐途径：尽管许多细菌能够将多种底物厌氧发酵为乳酸盐作为终产物，一些通过使用丙烯酰-CoA途径(见图3)能够进一步将乳酸盐还原为丙酸盐，如丙酸梭菌、Clostriumneopropionicum,埃尔登氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)和栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)(P.Boyaval,C.Corre,“Productionofpropionicacid”,Lait,75,453-461,1995)。可以转化为作为中间物的丙酮酸盐的若干底物(糖、乙醇和一些氨基酸)可以进一步还原为作为主要产物的丙酸盐，和作为共产物的乙酸盐和丁酸盐。关键反应是乳酰-CoA脱水为丙烯酰-CoA，所述丙烯酰-CoA随后还原为丙酰-CoA。通过丙酮酸盐/乳酸盐氧化为乙酸盐和CO₂提供用于此还原的电子(G.Gottschalk,“BacterialMetabolism”,第2版,Springer,NewYork,1986)。

使用丙烯酸盐途径的Clostridiumneopropionicum(菌株X4)能够将乙醇和CO₂转化为乙酸盐、丙酸盐和一些丙醇(J.Tholozan,J.Touzel,E.Samain,J.Grivet,G.PrensierandG.Albagnac,“Clostridiumneopropionicumsp.Nov.,astrictanaerobicbacteriumfermentingethanoltopropionatethroughacrylatepathway”,Arch.Microbiol.,157,第249-257页,1992)。对于二羧酸途径，从底物乙醇生产的中间物乙酰-CoA经由丙酮酸合酶连接至丙烯酸盐途径，所述丙酮酸合酶将乙酰-CoA通过与CO₂羧化转化为丙酮酸盐。

最近，导致丙烯酰-CoA的备选途径是乙酰-CoA通过与CO₂羧化转化为丙二酰-CoA。丙二酰-CoA经由4个步骤进一步转化为丙烯酰-CoA，所述4个步骤涉及丙二酸盐-半醛，羟基丙酸盐、羟基丙酰-CoA和最终地丙烯酰-CoA。通过此途径生产的丙烯酰-CoA随后还原为丙酰-CoA，与通过乳酰-CoA的脱水导致丙烯酰-CoA的反应相似(J.Zarzycki,“Identifyingthemissinsstepsoftheautotrophic3-hydroxypropionateCO2fixationcycleinChloroflexusaurantiacus,PNAS,106(50),第21317页,2009；I.Berg,“A3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrateautotrophiccarbondioxideassimilationpathwayinarchaea,Science,318,第1782页,2007)。

优选地，本发明的共生的生产C3的微生物能够在作为其主要碳源的乙醇和/或乙酸盐上生长。这些微生物包括，但不限于，丙酸暗杆菌、Clostridiumneopropionicum、丙酸梭菌、丙酸脱硫叶菌、沃氏共养杆菌(Syntrophobacterwolinii)、普氏共养杆菌(Syntrophobacterpfennigii)、Syntrophobacterfumaroxidans、Syntrophobactersulfatireducens、Smithellapropionica、Desulfotomaculumthermobenzoicumsubspeciesthermosyntrophicum、Pelotomaculumthermopropionicum、和Pelotomaculumschinkii。在本发明特别的实施方式中，生产C3的微生物是产丙酸菌。产丙酸菌指能够将合成气中间物，诸如乙醇和乙酸盐，转化为丙酸和丙醇的任何微生物。本发明的产丙酸菌利用用于将合成气转化为丙酸盐的至少两种不同途径中的一种：甲基丙二酰-琥珀酸途径(图2中显示)和乳酸-丙烯酸途径(图3中显示)。

通过本文描述的共生布置，本发明的厌氧微生物培养物具有在空间上分离的共生关系中从气态碳和电子源生产丙醇的能力。培养物的适当的碳和电子源的来源包括“废”气诸如合成气、油精炼废气、制钢废气、蒸汽产生的气体、天然气或石脑油的自热或组合重整、生物质的生物气和产物、煤或精炼残余物的气化或后者的混合物。来源可包括气体(含有一些H2)，其是通过酵母、梭菌发酵生产的、和气化的纤维素材料。此类气态底物可作为其他过程的副产物生产或可特异性地生产用于本发明的方法中。本领域技术人员将认识到底物气体的任何来源可用于本发明的实践中，只要能够在适于细菌实施发酵反应的条件下为固定C1的微生物培养物提供充足量的底物气体。

在本发明的一个优选的实施方案中，CO、CO₂和H₂的来源是合成气。用作底物的合成气可例如，作为煤或精炼残余物的气化的气态产物获得。也可以通过重整天然气或石脑油，例如通过在蒸汽甲烷重整器中重整天然气生产合成气。备选地，可以通过明确用于细菌发酵目的的容易获得的低成本农业原材料的气化生产合成气，从而提供将生物质间接发酵为醇的途径。存在多种能够转化为合成气的原材料的实例，因为多数类型的植物可用于此目的。适当的原材料包括，但不限于，多年生牧草诸如柳枝稷、作物残余物诸如玉米秸、加工废料诸如锯屑、来自甘蔗收获(甘蔗渣)或棕榈油生产的副产物，等。本领域技术人员熟知从此类起始材料生成合成气。一般而言，在气化炉中主要通过热解、部分氧化和蒸汽重整从干燥的生物质生成合成气，主要产物是CO，H₂和CO₂。术语“气化”和“热解”指相似的过程；两个过程均限制生物质所暴露于的氧气的量。术语“气化”有时用于包括气化和热解两者。

也可以使用进料入间接发酵过程中的底物气体的组合来源以改变生物反应器的进料气流中组分的浓度。例如，CO,CO₂和H₂的主要来源可以为通常展示出37％CO,35％H₂,和18％CO₂的浓度比例的合成气，但合成气也可以补充有来自其他来源的气体以富集CO(即，轧钢废气富含CO)或H₂的水平。

在一些情况下，本方法受益于将生产C3的微生物暴露于二氧化碳和氢气。通过将固定C1的微生物暴露于气态底物也能够生产二氧化碳和氢气。

本发明的微生物必须在厌氧条件下培养。如本文所用，“厌氧条件”意为在微生物所暴露的环境的气相中氧气(O2)的水平低于百万分之0.5。本领域技术人员将熟悉用于培养这些微生物的标准厌氧技术(Balch和Wolfe,1976,Appl.Environ.Microbiol.32:781-791；Balch等人,1979,Microbiol.Rev.43:260-296)。

目前，在自然环境中尚未发现能够从合成气生产丙醇或丙酸的天然共生配对物。然而，当在正确的养分条件和选择压力下共同配对时，可以迫使来自自然环境的微生物形成这些“非天然的”代谢共生配对物，其将从合成气生产丙醇。

可以以若干种方式生成用于本发明的共生培养物。一种方法涉及使用养分选择压力以在含有混合的厌氧微生物群落的环境样品中发现的微生物中的至少两种之间形成代谢共生。在此方法中，微生物生长可用的唯一碳和电子源是合成气和/或合成气发酵产物，诸如乙醇和乙酸盐。在这些养分选择压力下，能够在这些养分上生长的微生物将富集。用于形成上述共生关联的方法的变化涉及稀释。该方法允许样品中生产C3的产丙酸菌非常缓慢生长以达到较高的细胞密度。富集培养物的稀释可以用连续进料的厌氧发酵罐进行或通过富集样品的系列稀释手动进行。这两种稀释技术施加相同的前述碳和电子源的养分选择压力。建立能够将合成气转化为丙醇的共生关联的另一方法涉及培养两个或多个确定的培养物并建立这些单独培养物的配对。本领域技术人员将理解有多种配对两个或多个确定的培养物的方法。例如，一种方法涉及首先在发酵罐中培养已知的固定C1的同型产乙酸菌，以合成气作为唯一的碳和电子源。这称作固定C1的发酵区。在优选的实施方式中，固定C1的同型产乙酸菌将从合成气生产乙醇。同时，在单独的发酵罐区中培养已知的生产C3的产丙酸菌培养物。这称为生产C3的发酵区。

一旦固定C1的发酵区中的同型产乙酸菌培养物关于乙醇和/或乙酸盐生产力已经达到稳态，来自固定C1的发酵区的乙醇和/或乙酸盐传递到生产C3的发酵区中的产丙酸菌培养物。生产C3的产丙酸菌培养物与固定C1的同型产乙酸菌培养物的适当的体积比例是约1:50–1:1，最优选约1:10–1:2。优选地，同型产乙酸菌将生产比乙酸高两倍的乙醇并且在将培养基从固定C1的发酵区转移到生产C3的发酵区之前已经达到约1.0–10.0，最优选2.0–3.0的光密度(OD)。另外，优选的是在培养基转移时，生产C3的产丙酸菌将具有约0.1–5.0之间，最优选约0.4–1.5之间的OD。为了促进丙酸盐的生产，生产C3的微生物也将接受CO₂和(H₂或N₂)的连续供应。CO₂和(H₂或N₂)可传给生产C3的微生物的发酵区的液体培养基。备选地，可以通过使用适当的手段建立CO₂和(H₂或N₂)与生产C3的微生物的气态接触，诸如如本文所述的膜支持的布置。然后将含有由生产C3的微生物所生产的丙酸的来自生产C3的发酵区的培养基返回到固定C1的发酵区。固定C1的微生物将还原丙酸以生产丙醇作为产物。

优选地，固定C1和生产C3的发酵区之间培养基的循环转移将在两个发酵区中均创造连续共生环境。然而，在将培养基从一个发酵区转移到另一个发酵区的过程中，也可以转移一部分培养物。例如，在从生产C3的发酵区转移培养基时，也可以将一部分产丙酸菌转移至固定C1的发酵区。备选地，在从区1或区2转移发酵肉汤之前，可以使用细胞再循环系统，藉此在转移至随后的容器之前从其肉汤移出或浓缩来自各个发酵罐的细胞。收集的细胞返回至其各自的发酵容器中。细胞回收系统的实例包括同轴连续离心机或切向流动过滤单元。

用于生长和维持上述共生培养物的适当的培养基组合物包括确定的培养基制剂。从储液制备标准生长培养基，这导致以下最终成分每升培养基。给出的量为克除非另外声明。矿物质：NaCl,2；NH₄Cl,25；KCl,2.5；KH₂PO₄,2.5；MgSO₄·7H₂O,0.5；CaCl₂·2H₂O,0.1。痕量金属:MnSO₄·H₂O,0.01；Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H2O,0.008；CoCl₂·6H2O,0.002；ZnSO₄·7H2O,0.01；NiCl₂·6H2O,0.002；Na₂MoO₄·2H₂O,0.0002,Na₂SeO₄,0.001,Na₂WO₄,0.002。维生素(量,mg):吡哆醇HCl,0.10；硫胺素HCl,0.05,核黄素,0.05；泛酸钙,0.05；硫辛酸,0.05；p-氨基苯甲酸,0.05；烟酸,0.05；维生素B12,0.05；巯基乙醇磺酸,0.05；生物素,0.02；叶酸,0.02。以半胱氨酸(游离碱)，0.1；和Na₂S·2H₂O，0.1的终浓度(g/L)向培养基添加还原剂混合物。此生长培养基的最终pH目标可以调整为在约5-7之间，优选在约5.5至6.0之间。培养基成分也可以由酵母提取物或玉米浆提供或用此类液体补充。

在固定C1的同型产乙酸菌培养物的初始生长期间，将合成气连续鼓进培养基中以提供充足的溶解的CO和H₂浓度以支持细胞生长和发酵产物，乙醇和乙酸。贯穿于过程中，持续将合成气添加至固定C1的同型产乙酸菌反应器中以维持健康的生溶剂的发酵合成气的培养物。C3-产丙酸菌的初始生长需要在共生配对步骤之前将乙醇和/或乙酸盐添加至培养基以支持这些微生物的生长。对培养基连续进料浓度在1-50g/L之间的乙醇、乙酸盐或其组合，优选地在1-20g/L之间并且最优选地在1-10g/L之间。一旦C3-产丙酸菌与C1-同型产乙酸菌或发酵肉汤组合，不再对培养基进料乙醇和乙酸盐。因为上述的发酵区方法需要在含有固定C1和生产C3的培养物的发酵罐之间培养基的自由交换，这两个发酵区将均使用基本相同的培养基组成并将在相似的温度条件和存在合成气下运行。在另一个实施方式中，培养基均独立于两个发酵区优化同时维持两个发酵区的健康环境。还在另一个实施方式中，可以对两个发酵区均进料不同的合成气组成和/或浓度。

本发明的方法可以在本领域技术人员所知的若干类型的发酵装置中的任一种中进行，具有或没有额外的修饰，或在当前正在开发中的其他类型的发酵仪器中进行。实例包括但不限于气泡柱反应器、两段式生物反应器、滴流床反应器、膜反应器、含有固定化的细胞的填充床反应器，等。这些装置将用于发展和维持用于建立互养代谢关联的固定C1的同型产乙酸菌和生产C3的产丙酸菌培养物。此类装置的主要要求包括：

a.无菌；

b.厌氧条件；

c.用于维持温度、压力和pH的适当的条件；

d.对培养物供给充足的底物量；

e.进行最优传质以对发酵培养基提供气体

f.可以从细菌肉汤容易地回收发酵的终产物。

每种发酵反应器可以是，例如，传统的搅拌罐反应器、具有固定化的或悬浮的细胞的柱发酵罐，连续流动型反应器、高压反应器、具有细胞再循环的悬浮的细胞反应器，和先前列出的其他实例。此外，可以以含有任何上述反应器的串联和/或并联反应器系统布置每种类型的多个反应器。例如，多个反应器在一组条件下可用于生长细胞并在另一组条件下生成n-丙醇(或其他产物)并具有最少生长。

在一个实施方式中，生产C3的产丙酸菌培养物首先在具有静态的或在发酵罐内漂浮的生物膜支持材料的发酵罐中生长。在此以其整体并入的美国专利公开20090035848显示了在移动床生物反应器中使用漂浮的支持材料。此类支持材料的实例是MutagBiochips。此方法允许生产C3的微生物首先在载体材料上建立生物膜，从而增加细胞保留时间对发酵罐的水力停留。

一般而言，将允许共生培养物的发酵继续进行直到在培养基中生产想要的水平的丙醇。优选地，生产的丙醇的水平处于2克/升至75克/升的范围并且最优选地处于4克/升至50克/升的范围。备选地，当达到某生产速度时可以停止生产，例如，当想要的产物的生产速度已经降低由于，例如，细菌废物积累、底物可用性降低、产物的反馈抑制、活细菌数降低、或由于本领域技术人员所知的任何其他原因中的任一种。此外，存在连续培养技术，其允许连续补充新鲜培养基而同时移出使用的培养基，包括其中的任何液体产物(即恒化器模式)。也可以使用细胞再循环技术以控制细胞密度和因此发酵罐的容积生产率。

乙醇和/或乙酸盐从固定C1的发酵区至生产C3的发酵区的转移可以以维持不同培养物隔离的任何方式完成。可以过滤含有乙醇和/或乙酸盐的培养基以移出固定C1的微生物并然后转移至含有生产C3的培养物的发酵罐中。

C3产丙酸菌培养物可受益于固定底物的使用，诸如其上保留培养物的膜。在美国专利公开20080305540(以其整体并入本文)中显示了用于支持膜上的微生物培养物的系统和方法，其中微生物存在于发酵液体中并形成生物膜用于保留在膜基质上。在此类布置中，基质或膜可提供用于隔离不同培养物的方便的工具。

转移乙醇和乙酸盐的优选的方法是通过使用膜类型发酵区以在膜孔中保留生产C3的微生物。美国专利公开20090215163(以其整体并入本文)显示了此类系统和布置，其中膜孔保留气相环境中的微生物而含有养分和/或底物的液体从膜的相对侧渗透至微生物。

图4显示了本发明的实施方式，其利用了固定C1的发酵区和生产C3的发酵区的布置。在此实施方式中，发酵反应器10，浮游发酵反应器，使固定C1的微生物悬浮在液体培养基中并且膜发酵反应器12保留生产C3的微生物。至少包含CO和H₂的进料气体通过进料气体线路14进入发酵反应器10。气体喷射器16混合进料气体与经由线路20从发酵反应器10收回并由泵18经由线路22和线路24循环至气体喷射器16的培养基的再循环流。主要包含CO₂、H₂和未反应的进料气体组分的废气经由线路26退出反应器。线路28将一部分液体培养基引导至膜发酵反应器12并进入中空纤维膜32的腔30中。膜32控制培养基从腔30穿过膜渗透至其外表面，在此多个孔(未显示)保留气体氛围中的生产C3的微生物，其填充环形空间34并包围了膜32的外侧。气体氛围保持生产C3的微生物暴露于高分压的CO₂和H₂而培养基的渗透为微生物提供了乙醇和/或乙酸盐连同其他养分用于生产丙酸盐。进气线路36为环状空间38供应了含有CO₂和H₂的气体。可以以美国专利公开20090215163中描述的方式控制跨膜的相对压力以防止过量液体在膜外侧的积累。

含有丙酸盐的生产C3的发酵区的培养基经由线路40离开膜反应器12。如果需要，可以经由线路42收回全部或部分培养基用于从培养基回收丙酸盐。在大多数情况下，线路44将含有丙酸盐的培养基返回至发酵反应器10中的固定C1的发酵区用于将丙酸盐转化为丙醇。

膜32的使用消除了从循环至生产C3的微生物的培养基中彻底分离固定C1的微生物的需要。该膜也充当屏障以隔绝保留在培养基中的任何固定C1的微生物接触生产C3的微生物。

线路46从发酵反应器10收回了一部分基质培养物用于回收产物诸如丙醇和，任选地，乙醇和/或乙酸盐。由本发明的微生物生产的产物可以通过本领域技术人员已知的若干方法中的任何一种从培养物中移出并纯化。例如，可以通过在大气压或在真空下蒸馏，通过吸收或通过其他基于膜的分离方法诸如渗透蒸发、蒸气渗透等移出n-丙醇并进一步加工诸如通过化学/催化脱水以生产丙烯。来自分离n-丙醇的回收的液体可含有显著量的乙醇和/或乙酸盐，其可以作为循环培养基的一部分直接返回至膜反应器。

更特别地在以下描述本发明并且本文示出的实施例仅旨在作为说明性的，因为其中多种修改和变化对本领域技术人员是显而易见的。如本文说明书和其后权利要求书全文中所用，单数形式“a”，“an”和“the”的意义包括复数参考除非上下文明确指示。说明书中使用的术语一般而言在本发明的背景中，和在每个术语使用的具体背景中，具有其在本领域中的普通含义。已经更具体地定义了一些术语以为从业者提供关于本发明的描述的额外的指导。

实施例

以下实施例说明本发明的具体实施方式，及其多种使用。其仅以解释性的目的示出，并且不被理解为是限制本发明。

实施例1

C ¹³ -标记的丙酸转化为丙醇

为了证明在合成气上生长的同型产乙酸菌培养物将丙酸转化为丙醇和其他发酵副产物，进行C¹³-丙酸实验。将C¹³-丙酸进料给血清瓶中浓度为100mM的同型产乙酸菌培养物，Clostridiumcoskatti，并在37℃孵育。在2hr、24hr和1周时从血清瓶收回样品。使用GC-MS以鉴定含有重稳定同位素C¹³的产物。在丙醇峰中发现C¹³产物并且没有生产不带有C¹³标签的丙醇。此外，没有形成含有C¹³重碳同位素或其质量碎片的其他产物，证明当在合成气上生长时同型产乙酸菌可以将丙酸还原为丙醇并且没有其他终产物。

实施例2

同型产乙酸菌发酵罐中丙酸至丙醇

对生产乙醇的同型产乙酸菌发酵罐连续进料丙酸以研究丙醇的速率和收率。在开始丙酸进料前，发酵罐中乙醇的初始浓度是500mmol/L。在200mmol/L丙酸的进料速率时，发酵罐中丙醇的浓度达到167mmol/L。发酵罐中的剩余丙酸是27mmol/L；因此至丙醇的转化效率为97％。发酵罐中乙醇的浓度随着丙醇浓度增加而稳步降低。在167mmol/L丙醇时发酵罐含有250mmol/L的乙醇。醇的该比例展示了基于发酵罐中合成气的气体消耗速率的电子平衡。在发酵罐中实现了0.22g/L/hr的稳态时丙醇的生产速率。结果显示了通过在合成气上生长的同型产乙酸微生物的丙酸至丙醇的高转化效率和速率。此外，这些结果也显示高至10g/L(167mmol/L)的丙醇浓度对合成气消耗没有影响。这些结果表明在与同型产乙酸菌伙伴诸如C.coskatii的共发酵中，丙酸容易地转化为丙醇并且剩余的乙酸被回收并由此共生共培养物转化为丙醇。

实施例3

在发酵罐中由产丙酸菌从乙醇生产丙酸

以在作为电子源的乙醇和作为碳源的碳酸氢盐和乙醇上生长的Clostridiumneopropionicum起始发酵罐。在培养基中进料的乙醇浓度是213mmol/L。在稳态时发酵罐达到89mmol/L丙酸、5mmol/L的丙醇、和27mmol/L的剩余乙醇的浓度。这代表了76％的从乙醇到丙酸的转化效率，基于1.5摩尔乙醇生产的每摩尔丙酸的理论转化化学计量学。其他反应产物包括乙酸和少量的丁酸。

这些实验证实在合成气发酵条件下以高收率将乙醇转化为丙酸的可行性。

实施例4

通过同型产乙酸菌和使用丙烯酸盐途径的产丙酸菌的共培养物生产丙醇

在发酵罐中在合成气上生长并生产乙醇和乙酸盐的C.coskatii的同型产乙酸菌培养物，与具有乳酸盐丙烯酸盐途径、在乙醇上生长并生产丙酸盐和低水平的丙醇的C.neopropionicum的厌氧批次(瓶)培养物混合。瓶中的共培养物在合成气下孵育，通过添加稀释的碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液调整pH。共培养物中的初始乙醇浓度为约180mM(8.3g/L)，其源自合成气发酵。初始丙酸盐浓度为～3mM(0.22g/L)，其引入具有C.neopropionicum培养基的共培养物混合物中。在初始组成为～38％CO、～38％H₂、～15％CO₂和～9％CH₄的合成气氛围下培养共培养物。周期性地调节pH以保持pH6.0或高于pH6.0的水平。在48h后，取得并分析样品。分析显示乙醇被消耗并且丙醇生产峰在36mM(2.2g/L)，是初始摩尔丙酸盐浓度12倍的水平，表明丙醇源自合成气生产的乙醇并且不仅仅是初始存在的丙酸盐的转化的产物。在孵育的第三天时(当实验结束时)在这些条件下丙酸盐浓度也增加至33mM(2.4g/L)。这些结果提示生溶剂的代谢合成气的同型产乙酸菌和代谢乙醇的生产丙酸盐的厌氧细菌的共培养物可以以显著的收率从源自合成气的乙醇生产丙醇。

实施例5

在发酵罐中在合成气上生长并生产乙醇的C.coskatii的同型产乙酸菌培养物，与使用甲基丙二酰–琥珀酸途径、在乙醇上生长并生产丙酸盐和低水平的丙醇的丙酸暗杆菌的厌氧批次(瓶)培养物混合。共培养物中的初始乙醇浓度为约120mM(5.6g/L)，其大部分源自合成气发酵。初始丙酸盐浓度为～1.8mM，其引入具有丙酸暗杆菌培养基的共培养物混合物中。在初始组成为约38％CO、38％H₂、15％CO₂和9％CH₄的合成气氛围下在30℃在瓶中孵育共培养物并搅拌。通过添加稀释的碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液调整共培养物混合物的初始pH至～7.0。在8天孵育时间末时取得的用于分析的样品显示乙醇利用和丙醇生产。约40％的原来存在于混合物中的乙醇被消耗(47.44mM)，这导致最终总C3化合物(丙醇+丙酸盐)浓度为17.5mM。丙醇代表了大多数C3生产，终浓度为14.43mM而丙酸盐浓度为3.07mM。这些浓度分别代表丙醇和丙酸盐初始值的13倍和1.67倍增加，和14.56mMC3化合物的净生产。在其中不存在丙酸暗杆菌细胞的对照实验中没有净C3化合物生产。这些结果表明生溶剂的代谢合成气的同型产乙酸菌和代谢乙醇的生产丙酸盐的厌氧细菌的共培养物可以以显著的收率从源自合成气的乙醇生产丙醇。

实施例6

在单独的生物反应器中使用固定C1和C3的生物从合成气生产丙醇

在此实验中，首先将已知的产丙酸菌，Clostridiumneopropionicum，接种在具有海绵样孔结构的亲水聚砜中空纤维(SpectrumLab,型号#M7-500S-300-01N)的MSBR的孔中。纤维ID为0.5mm并且OD为0.66mm。膜具有500k的名义分子量截断。整个膜模块直径为3.12cm并且长度为20.6cm，总膜表面积为0.41m²。

以由矿物质、维生素和额外的0.5g/L酵母提取物组成的培养基和约0.2g/hr的乙醇的连续进料培养产丙酸菌。培养基的典型组成是：

矿物质:NaCl,2；NH₄Cl,25；KCl,2.5；KH₂PO₄,2.5；MgSO₄·7H₂0,0.5；CaC12·2H₂0,0.1.痕量金属:MnSO₄·H₂0,0.01；Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂0,0.008；CoC1₂·6H₂0,0.002；ZnSO₄·7H₂0,0.01；NiCl₂·6H₂0,0.002；Na₂Mo0₄-2H₂0,0.0002,Na₂Se0₄,0.001,Na₂W04,0.002。

维生素(量,mg):吡哆醇HC1,0.10；硫胺素HCI,0.05,核黄素,0.05；泛酸钙,0.05；硫辛酸,0.05；p-氨基苯甲酸,0.05；烟酸,0.05；维生素B12,0.05；巯基乙醇磺酸,0.05；生物素,0.02；叶酸,0.02。

以半胱氨酸(游离碱)的终浓度(g/L)向培养基添加还原剂混合物。此实验的pH从6开始。除了确定的培养基试剂外，也添加0.5g/L酵母提取物以补充未知的养分组分用于生产C3的细菌。

在超过3周的产丙酸菌的初始生长后，将同型产乙酸菌，Clostridiumautoethanogenum，接种到使用CSTR容器的发酵罐中。用于MSBR中产丙酸菌和CSTR中同型产乙酸菌的生长的培养基均与上文相同。

贯穿于实验，MSBR的壳侧上使用的气体组成是20mol％CO₂和80％N₂流速100mL/min。用于CSTR中同型产乙酸菌的生长的气体组成初始为7％CO、34.5％H₂、23.8％CO₂、4.8％CH₄和余下N2，但随后转变为56mol％H₂、21mol％CO、4.8％CO₂和余下CH₄。

同型产乙酸菌发酵罐的气体摄入增加并在约900hr时H₂和CO均达到约15mmole/l/hr。此时，主要产物的产物浓度(g/l)为：乙醇＝3.29；丙醇＝0.24；乙酸＝14.15和丙酸＝0.52。

这确立了可以运行产丙酸菌在一个生物反应器中而同型产乙酸菌在单独的生物反应器中的两阶段生物反应器，即由同型产乙酸菌将合成气转化为其主要产物乙醇和乙酸并且在单独的生物反应器中产丙酸菌将这些转化为C3产物丙醇和丙酸。

Claims

1.生产丙醇的方法，所述方法包括:

a)在有效将气体底物转化为乙醇或乙酸盐的条件下，将选自由一氧化碳、二氧化碳和氢气或其组合组成的组的气体底物暴露给在第一发酵区中的固定C1的微生物；和

b)在有效将乙醇和/或乙酸盐转化为丙酸盐和/或丙醇的条件下，将来自步骤a)的乙醇和/或乙酸盐传给第二发酵区中的生产C3的微生物。

2.权利要求1的方法，其中固定C1的微生物是使用乙酰-CoA途径的生溶剂产乙酸菌。

3.权利要求1的方法，其中固定C1的微生物选自由ClostridiumCoskatii、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、Clostridiumauthoethanogenium、Clostridiumragsdalei、Alkalibaculumbacchi、Clostridiumthermoaceticum、和乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)组成的组。

4.权利要求1的方法，其中生产C3的微生物是产丙酸菌。

5.权利要求4的方法，其中产丙酸菌使用乳酸盐-丙烯酸盐途径用于生产丙酸盐。

6.权利要求4的方法，其中产丙酸菌使用甲基丙二酰-琥珀酸途径用于生产丙酸盐。

7.权利要求1的方法，其中生产C3的微生物选自由Clostridiumneopropionicum、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)、丙酸暗杆菌(Pelobacterpropionicus)、丙酸脱硫叶菌(Desulfobulbuspropionicus)、沃氏共养杆菌(Syntrophobacterwolinii)、普氏共养杆菌(Syntrophobacterpfennigii)、Syntrophobacterfumaroxidans、Syntrophobactersulfatireducens、Smithellapropionica、Desulfotomaculumthermobenzoicumsubspeciesthermosyntrophicum、Pelotomaculumthermopropionicum、和Pelotomaculumschinkii组成的组。

8.权利要求1的方法，其中在有效生产丙醇的条件下通过将来自第二发酵区中的生产C3的微生物的丙酸盐的至少一部分传给第一发酵区中的固定C1的微生物生产丙酸。

9.权利要求1的方法，其中气体底物是合成气。

10.权利要求1的方法，其中第一发酵区中固定C1的微生物和第二发酵区中生产C3的微生物的pH维持在约5.0至7.0之间。

11.权利要求1的方法，其中固定C1的微生物维持在浮游条件下而固定C3的微生物作为固定在支持物上的细胞维持。

12.权利要求1的方法，其中固定C3的微生物维持在浮游条件下而固定C1的微生物作为固定在支持物上的细胞维持。

13.权利要求11和12的方法，其中细胞的支持物包含膜，所述膜确定其中保留细胞的孔。

14.权利要求1的方法，其中以生产C3的微生物从乙醇和/或乙酸盐有效生产丙酸盐的条件包括将生产C3的微生物暴露给至少含有二氧化碳和氢气的合成气。

15.权利要求14的方法，其中通过将固定C1的微生物暴露于气体底物生产二氧化碳和氢气。

16.用于将合成气转化为丙醇和/或丙酸的厌氧共生系统，所述系统包含合成气、培养基、第一发酵区中的固定C1的微生物、第二发酵区中的生产C3的微生物、CO2和H2源和用于在第一发酵区中的固定C1的微生物和第二发酵区中的生产C3的微生物之间交换培养基的转移导管。

17.权利要求16的方法，其中固定C1的微生物是使用乙酰-CoA途径的生溶剂产乙酸菌。

18.权利要求16的厌氧共生系统，其中固定C1的微生物选自由ClostridiumCoskatii、扬氏梭菌、Clostridiumauthoethanogenium、和Clostridiumragsdalei和Alkalibaculumbacchi、Clostridiumthermoaceticum、和乙酸梭菌组成的组。

19.权利要求16的厌氧共生系统，其中生产C3的微生物是产丙酸菌。

20.权利要求16的厌氧共生系统，其中生产C3的微生物选自由Clostridiumneopropionicum、丙酸暗杆菌和丙酸脱硫叶菌、沃氏共养杆菌、普氏共养杆菌、Syntrophobacterfumaroxidans、Syntrophobactersulfatireducens、Smithellapropionica、Desulfotomaculumthermobenzoicumsubspeciesthermosyntrophicum、Pelotomaculumthermopropionicum、和Pelotomaculumschinkii组成的组。

21.权利要求19的厌氧共生系统，其中产丙酸菌使用乳酸盐-丙烯酸盐途径用于生产丙酸盐。

22.权利要求19的厌氧共生系统，其中产丙酸菌使用甲基丙二酰-琥珀酸途径用于生产丙酸盐。

23.权利要求16的厌氧共生系统，其中培养基的pH维持在约5.0至约7.0之间。