CN105713949A - 一种低碳零排放制取氢气的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以微藻生物质作为发酵底物的低碳零排放制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：(1)微藻生物质预处理；(2)暗发酵产氢；(3)光发酵产氢；(4)氢气的纯化和微藻的培养。本发明的方法产氢率、产氢速率、底物利用率和能量转化效率均十分优异，实现了在减少温室气体排放的同时，循环供给制氢底物的有益技术效果。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源生产技术领域，具体涉及一种以微藻生物质作为发酵底物的低碳零排放制取氢气的方法。
背景技术
氢气作为一种可再生能源，具有能量密度大，利用过程中产物只有水、清洁无污染等优点，很适合作为传统化石能源的替代能源，其在研究领域和工业应用领域正受到越来越多的重视。利用生物质产氢对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意义。
生物制氢的原料广泛，所述原料可以是淀粉、纤维素类等可再生生物质，也可以是海洋微藻等富含糖类的生物质。与陆地植物相比，海洋微藻具有以下几个优点：(1)生长速度很快，能在短时间内获得大量生物质；(2)可以在海洋中生长，不占用陆地面积，不消耗淡水资源；(3)对环境的适应性强，对环境因素如温度、pH值、盐度等具有较宽的耐受范围；(4)可以利用电站烟气中的CO2作为碳源迅速生长，实现很高的脱碳效率，同时对烟气中的SOX和NOX也会有一定的脱除效果；(5)微藻的生物质可被用于生物能源转换(例如，利用微藻固定的糖类制取氢气，或利用微藻固定的脂肪类生产生物柴油)。因此微藻是在减少CO2的排放的同时进行生物能源转化的良好生物反应器。
生物制氢的反应条件温和，能量需求小，具有无可替代的优势。传统生物质暗发酵产氢的主要瓶颈问题是产氢率低和能源转化效率低，发酵尾液中含有大量有机酸和醇类，既浪费了能量又污染了环境。例如，CN103667352A公开了一种以有机废水为菌种的生物制氢方法，将污水处理厂的厌氧消化污泥在80℃的条件下进行10分钟的热处理后作为菌种，将可溶性淀粉和营养液作为反应底物，控制一定温度进行发酵产氢。CN103627729A公开了一种玉米芯发酵制氢的方法，该方法以牛粪堆肥为暗发酵菌种。然而，这种单纯暗发酵制氢的产率有限，理论最高产率只有4mol/mol(方程1和方程2)。也有些学者利用暗光发酵耦合产氢的方式提高产氢效率。如CN100532566C将生物质及固体有机废弃物水解、酸化，生成丙酮酸、短链脂肪酸和少量H2、CO2，然后丙酮酸和短链脂肪酸混合物在暗发酵产氢细菌作用下生成大量氢气，并得到小分子有机酸副产物乙醇、乙酸、丙酸和丁酸，然后将小分子有机酸乙醇、乙酸、丙酸和丁酸接种光合产氢细菌后在光合作用下继续生成氢气。CN202576411U公开了利用暗-光发酵耦合产氢模拟反应装置，通过周期性的暗-光照明，实现暗-光发酵耦合产氢。这种发酵方式提高了产氢效率，但仍有大量温室气体CO2排放到环境中，给环境带来负面影响。
C6H12O6→CH3CH2CH2COOH+2CO2+2H2(方程1)
C6H12O6+2H2O→2CH3COOH+2CO2+4H2(方程2)
发明内容
为了解决现有生物产氢工艺中产氢效率低下、发酵尾液中含有大量小分子有机酸且尾气中含有的温室气体CO2的问题，本发明提供了一种以微藻生物质作为发酵底物的低碳零排放制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)微藻生物质预处理：通过离心将微藻生物质从微藻培养液中分离，将得到的湿微藻干燥至恒重，随后将干燥后的微藻磨碎成微藻干粉；
(2)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(1)获得的微藻干粉，接入暗发酵产氢菌种和暗发酵培养基，保持厌氧环境进行暗发酵，将气相产物(主要为H2、CO2)导出；
(3)光发酵产氢：将步骤(2)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，作为光发酵产氢的底物，接入光发酵产氢菌种和光发酵培养基，保持厌氧环境进行光发酵，将气相产物(主要为H2、CO2)导出；
(4)氢气的纯化和微藻的培养：将步骤(2)和步骤(3)的气相产物输送到气体分离设备，将H2与CO2进行分离，将分离后的CO2通入微藻生长反应器，并接入微藻和微藻培养基，利用所述气相产物中的CO2作为微藻生长的营养；对H2进行收集；对于液相的微藻培养液，任选进行步骤(1)的处理。
具体而言，本发明是通过如下技术方案实现的：
1.一种以微藻生物质作为发酵底物制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)微藻生物质预处理：通过离心将微藻生物质从微藻培养液中分离，将得到的湿微藻干燥至恒重，随后将干燥后的微藻磨碎成微藻干粉；
(2)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(1)获得的微藻干粉，接入暗发酵产氢菌种和暗发酵培养基，保持厌氧环境进行暗发酵，将气相产物导出；
(3)光发酵产氢：将步骤(2)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，作为光发酵产氢的底物，接入光发酵产氢菌种和光发酵培养基，保持厌氧环境进行光发酵，将气相产物导出；
(4)氢气的纯化和微藻的培养：将步骤(2)和步骤(3)的气相产物输送到气体分离设备，将H2与CO2进行分离，将分离后的CO2通入微藻生长反应器，并接入微藻和微藻培养基，利用所述气相产物中的CO2作为微藻生长的营养；对H2进行收集；对于液相的微藻培养液，任选进行步骤(1)的处理。。
2.如段落1所述的方法，其中，步骤(1)或步骤(4)中所述的微藻是选自于螺旋藻、硅藻、小球藻、蓝藻、微拟球藻、雨生红球藻中的一种或多种。
3.如段落1所述的方法，其中，步骤(1)中所述的微藻干粉的粒径≤200μm。
4.如段落1所述的方法，其中，步骤(2)中所述的暗发酵产氢菌种为选自于由丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、巴氏梭菌、嗜热芽孢杆菌、热纤维梭菌所组成的组中的一种或多种。
5.如段落1所述的方法，其中，步骤(2)中所述的暗发酵培养基的组成为：4g/L蛋白胨、0.5g/LL-半胱氨酸、4g/LNaCl、0.1g/LMgCl2、0.1g/LFeCl2、1.5g/LK2HPO4、10mL维生素液、以及10mL微量元素液；其中，所述维生素液的成分为：0.025g/L抗坏血酸、0.02g/L柠檬酸、0.01g/L叶酸、以及0.01g/L对氨基苯甲酸；所述微量元素液的成分为：0.01g/LMnCl2、0.05g/LZnCl2、0.01g/LH3BO3、0.01g/LCaCl2以及0.01g/LAlK(SO4)2。
6.如段落1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述暗发酵产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。
7.如段落1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述微藻干粉与暗发酵培养基的加入量之比为5％-30％(w/v)。
8.如段落1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述暗发酵的发酵溶液温度为25℃～45℃。
9.如段落1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述发酵溶液初始pH值为6.0～9.0。
10.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，在将步骤(2)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，用去离子水稀释2-6倍，再进行光发酵。
11.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵菌种为选自于红螺菌属、红假单胞菌属或红杆菌属细菌的一种或多种。
12.如段落11所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵菌种为选自于深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红杆菌中的一种或多种。
13.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵培养基为：0.5g/LKH2PO4、0.6g/LK2HPO4、0.2g/LNaCl、0.2g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2·2H2O、2.0g/LNaHCO3、1.87g/L谷氨酸钠、1.0mL维生素液、以及1.0mL微量元素液；其中，所述微量元素液的成分为：2.0g/LEDTA-2Na、2.0g/LFeSO4·7H2O、0.1g/LZnCl2、0.05g/LCu(NO3)2·5H2O、0.1g/LMnCl2·4H2O、以及0.02g/LNiCl2·6H2O；所述维生素液的成分为：0.1g/L生物素、0.35g/L烟酸、0.2g/L对氨基甲苯、0.1g/L泛酸钙、以及0.05g/L维生素B12。
14.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，按照与任选稀释后的暗发酵尾液相等的体积加入光发酵培养基。
15.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。
16.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵的发酵溶液温度为28℃～35℃。
17.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵初始pH值为5.5～9.0。
18.如段落1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述光发酵的光照度为1000lux～20000lux。
20.如段落1所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述微藻培养基的组成为：0.5g/LK2HPO4、2.5g/LNaNO3、1.0g/LK2SO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、0.04g/LCaCl2、0.01g/LFeSO4·7H2O、以及1.0mL/L微量元素液；其中，所述微量元素液的组成为：其中，所述微量元素液的组成为：2.86g/LH3BO3、1.81g/LMnCl2·4H2O、0.22g/LZnSO4·7H2O、0.08g/LCuSO4·5H2O以及0.01g/LMoO3。
21.如段落1所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述微藻在所述微藻培养基中的接种量为0.4～0.8g微藻种子/L培养基。
22.如段落1所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述微藻培养的温度为25℃～40℃恒温培养。
23.如段落1所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述微藻培养液的pH值为5.5～10.0，
24.如段落23所述的方法，其中，所述微藻培养液的pH值为8.0～9.5。
25.如段落1所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述光发酵的光照度为1000lux～20000lux，昼夜比为12h/12h。
26.如段落1-25中任一项所述的方法，其中，对本发明的步骤(1)至步骤(4)进行循环。
有益效果
本发明通过利用暗发酵与光发酵耦合的两步产氢，显著提高了发酵过程的整体产氢率、产氢速率、底物利用率和能量转化效率。光发酵的进行使得暗发酵尾液中的小分子有机酸等副产物几乎被全部利用，极大地降低了生物制氢过程中的污染物排放。具体而言，暗发酵结束后，光发酵产氢步骤所使用的光发酵细菌在光照条件下可以利用暗发酵尾液中残留的乙酸、丁酸等小分子有机酸副产物进行再次发酵，生成H2和CO2(方程3)。暗发酵与光发酵耦合的两步产氢法可以将己糖的理论产氢率从单纯暗发酵的4molH2/mol六碳糖(方程2)提高到12molH2/mol六碳糖(方程4)，突破性地提高了整体发酵过程的理论和实际产氢率。
C6H12O6+6H2O→12H2+6CO2(方程4)
此外，为了减少氢气制取过程中的二氧化碳排放，本发明将微生物暗-光耦合制氢和微藻固定二氧化碳相结合，利用微藻的光合作用吸收固定暗发酵和光发酵阶段生成的二氧化碳来合成微藻自身的生物质，从而将微藻生物质作为原料之一(发酵底物)，循环供给发酵过程，持续产氢。物质的循环利用既提高了系统整体的能源转化效率，同时也实现了产氢系统的有机酸和二氧化碳的零排放，创造更加低碳、绿色、环保的自然环境和社会环境。
附图说明
图1是本发明所述方法的工艺流程图。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
本发明装置中的暗发酵反应器为现有技术的常规反应器，如塞流式反应器(PFR)、完全混合式反应器(CSTR)、厌氧接触反应器(ACR)、升流式厌氧污泥床(UASB)、升流式固体反应器(USR)、膨胀颗粒污泥床(EGSB)、内循环厌氧反应器(IC)、外循环厌氧反应器(EC)、厌氧序批间歇式反应器(ASBR)、折流式反应器(ABR)、厌氧滤器(AF)、纤维填料床(FPB)、复合厌氧反应器(UBF)、厌氧流化床(FBR)、厌氧膨胀床(ESB)、干发酵反应器(DA)。
本发明装置中的光发酵反应器和微藻生长反应器为封闭式光生物反应器，可以是柱状式光生物反应器或管状式光生物反应器、板式光生物反应器、光源内置发酵罐式光生物反应器或光导纤维光生物反应器，优选光源内置发酵罐式光生物反应器。
对于本发明的微藻生物质预处理步骤(1)，本领域技术人员可根据本说明书的记载，选择适当的预处理的方式对微藻培养液进行处理，以获得适宜作为发酵底物的微藻生物质。在一个实施方式中，所述微藻是选自于螺旋藻(Spirulina)、硅藻(Bacillariaceae)、小球藻(Chlorella)、蓝藻(Cyanophyta)、微拟球藻(Nannochloropsis)、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)中的一种或几种。在一个实施方式中，所述微藻干粉的粒径≤200μm。
对于本发明的暗发酵产氢步骤(2)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择暗发酵培养基的组成、暗发酵培养基加入量、暗发酵产氢菌种的种类、暗发酵产氢菌种的接种量以及相应的暗发酵条件等。在本发明的一个实施方式中，暗发酵培养基的组成为：4g/L蛋白胨、0.5g/LL-半胱氨酸、4g/LNaCl、0.1g/LMgCl2、0.1g/LFeCl2、1.5g/LK2HPO4、10mL维生素液、以及10mL微量元素液；其中，所述维生素液的成分为：0.025g/L抗坏血酸、0.02g/L柠檬酸、0.01g/L叶酸、以及0.01g/L对氨基苯甲酸；所述微量元素液的成分为：0.01g/LMnCl2、0.05g/LZnCl2、0.01g/LH3BO3、0.01g/LCaCl2以及0.01g/LAlK(SO4)2。在本发明的一个实施方式中，按照所加入的微藻干粉与暗发酵培养基之比为5％-30％(w/v)的比例加入微藻干粉与暗发酵培养基。在本发明的一个实施方式中，暗发酵产氢菌种为选自于由丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、巴氏梭菌(Clostridiumbarati)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusthermophilus)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)所组成的组中的一种或几种。在本发明的一个实施方式中，暗发酵产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。在本发明的一个实施方式中，暗发酵的发酵溶液温度为25℃～45℃。在本发明的一个实施方式中，暗发酵的发酵溶液初始pH值为6.0～9.0。
对于本发明的光发酵产氢步骤(3)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择暗发酵尾液的稀释程度、光发酵培养基的组成、光发酵培养基的加入量、光发酵产氢菌种的种类、光发酵产氢菌种的接种量以及相应的光发酵条件等。在本发明的一个实施方式中，所述光发酵培养基为：0.5g/LKH2PO4、0.6g/LK2HPO4、0.2g/LNaCl、0.2g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2·2H2O、2.0g/LNaHCO3、1.87g/L谷氨酸钠、1.0mL维生素液、以及1.0mL微量元素液；其中，所述微量元素液的成分为：2.0g/LEDTA-2Na、2.0g/LFeSO4·7H2O、0.1g/LZnCl2、0.05g/LCu(NO3)2·5H2O、0.1g/LMnCl2·4H2O、以及0.02g/LNiCl2·6H2O；所述维生素液的成分为：0.1g/L生物素、0.35g/L烟酸、0.2g/L对氨基甲苯、0.1g/L泛酸钙、以及0.05g/L维生素B12。在本发明的一个实施方式中，在将步骤(2)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，用去离子水稀释2-6倍。在本发明的一个实施方式中，按照与稀释后的暗发酵尾液相等的体积加入光发酵培养基。在本发明的一个实施方式中，光发酵产氢菌种选自于红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudanonas)和红杆菌属(Rhodobacter)，例如但不限于深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonaspalustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulata)、球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)中的一种或几种。在本发明的一个实施方式中，光发酵产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。在本发明的一个实施方式中，光发酵的发酵溶液温度为28℃～35℃。在本发明的一个实施方式中，光发酵初始pH值为5.5～9.0。在本发明的一个实施方式中，光发酵的光照度为1000lux～20000lux。
对于本发明的氢气的纯化和微藻的培养步骤(4)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择微藻的种类、微藻培养基的组成和反应条件等。在一个实施方式中，所述微藻是选自于螺旋藻、硅藻、小球藻、蓝藻、微拟球藻、雨生红球藻中的一种或几种。在一个实施方式中，微藻培养基的组成为：0.5g/LK2HPO4、2.5g/LNaNO3、1.0g/LK2SO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、0.04g/LCaCl2、0.01g/LFeSO4·7H2O、1.0mL/L微量元素液；其中，所述微量元素液的组成为：0.5g/LK2HPO4、2.5g/LNaNO3、1.0g/LK2SO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、0.04g/LCaCl2、0.01g/LFeSO4·7H2O、1.0mL/L微量元素液；其中，所述微量元素液的组成为：2.86g/LH3BO3、1.81g/LMnCl2·4H2O、0.22g/LZnSO4·7H2O、0.08g/LCuSO4·5H2O以及0.01g/LMoO3。在一个实施方式中微藻在微藻培养基中的接种量为0.4～0.8g微藻种子/L培养基。在本发明的一个实施方式中，微藻培养的温度为25℃～40℃恒温培养。在本发明的一个实施方式中，微藻培养液的pH值为5.5～10.0，优选8.0～9.5。在本发明的一个实施方式中，光发酵的光照度为1000lux～20000lux，昼夜比为12h/12h。
在优选的实施方式中，可对本发明的步骤(1)至(4)进行循环。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。
本发明实施例使用的高温烘箱为上海博迅实验有限公司GZX-9070MBE型号，离心机为艾本德中国有限公司5804R型号，磨粉机为上海淀久中药机械制造有限公司DJ-10A型号，光照采用上海博迅实验有限公司SPX-300I-G型号微电脑光照培养箱。
本发明实施例使用的暗发酵反应器为内循环厌氧反应器；光发酵反应器和微藻生长反应器为封闭式光生物反应器。
本发明实施例所采用的菌株来源为：
丁酸梭菌：浙江省微生物研究所，编号为20036；
产气肠杆菌：浙江省微生物研究所，编号为20051；
阴沟肠杆菌：浙江省微生物研究所，编号为10450；
沼泽红假单胞菌：浙江省微生物研究所，编号为15007；
球形红杆菌：浙江省微生物研究所，编号为18626；
钝顶螺旋藻：中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB-882；
小球藻：中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB-36；
硅藻：中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB-228；
在以下的实施例和对比例中，如果没有其它特别说明，所使用的暗发酵培养基、光发酵培养基和微藻培养基的组成如下：
暗发酵培养基：4g/L蛋白胨、0.5g/LL-半胱氨酸、4g/LNaCl、0.1g/LMgCl2、0.1g/LFeCl2、1.5g/LK2HPO4、10mL维生素液、以及10mL微量元素液；其中，所述维生素液的成分为：0.025g/L抗坏血酸、0.02g/L柠檬酸、0.01g/L叶酸、以及0.01g/L对氨基苯甲酸；所述微量元素液的成分为：0.01g/LMnCl2、0.05g/LZnCl2、0.01g/LH3BO3、0.01g/LCaCl2以及0.01g/LAlK(SO4)2。
光发酵培养基：0.5g/LKH2PO4、0.6g/LK2HPO4、0.2g/LNaCl、0.2g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2·2H2O、2.0g/LNaHCO3、1.87g/L谷氨酸钠、1.0mL维生素液、以及1.0mL微量元素液；其中，所述微量元素液的成分为：2.0g/LEDTA-2Na、2.0g/LFeSO4·7H2O、0.1g/LZnCl2、0.05g/LCu(NO3)2·5H2O、0.1g/LMnCl2·4H2O、以及0.02g/LNiCl2·6H2O；所述维生素液的成分为：0.1g/L生物素、0.35g/L烟酸、0.2g/L对氨基甲苯、0.1g/L泛酸钙、以及0.05g/L维生素B12。
微藻培养基：0.5g/LK2HPO4、2.5g/LNaNO3、1.0g/LK2SO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、0.04g/LCaCl2、0.01g/LFeSO4·7H2O、以及1.0mL/L微量元素液；其中，所述微量元素液的组成为：0.5g/LK2HPO4、2.5g/LNaNO3、1.0g/LK2SO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、0.04g/LCaCl2、0.01g/LFeSO4·7H2O、1.0mL/L微量元素液；其中，所述微量元素液的组成为：2.86g/LH3BO3、1.81g/LMnCl2·4H2O、0.22g/LZnSO4·7H2O、0.08g/LCuSO4·5H2O、以及0.01g/LMoO3。
实施例1：以微藻生物质作为发酵底物，低碳零排放制取氢气
本实施例所采用的微藻为钝顶螺旋藻。
(1)微藻生物质预处理：在离心机中以8000转/分钟的速度对含有微藻生物质的微藻培养液离心10分钟，将微藻生物质与微藻培养液分离，将得到的湿微藻在烘箱中于105℃加热干燥12小时至恒重，随后用磨粉机将干燥后的微藻磨碎成粒径≤200μm的微藻干粉。
(2)暗发酵产氢：在300-mL的暗发酵反应器中加入步骤(1)获得的微藻干粉10g，并加入20mL丁酸梭菌(2g/L)和170mL灭菌的暗发酵培养基。暗发酵培养基的初始pH用6MHCl或6MNaOH调为6.5，通入N220min以保持厌氧环境，置于黑暗环境中的35℃水浴锅中进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸等小分子有机酸。其中乙酸和丁酸占绝大部分。该步骤所生成的H2和CO2的体积以及有机酸的浓度如表1所示。
(3)光发酵产氢：以转速为4800rpm对步骤(2)的暗发酵尾液沉淀离心30分钟，收集上清液，并用去离子水稀释3倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，控制光发酵培养基的初始pH值为7.0，接入沼泽红假单胞菌。将光发酵培养物转移至1000-mL光发酵反应器中，通入N220min以保持厌氧环境，然后置于6000lux光照条件下进行培养，发酵温度为30℃。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为光发酵尾液，所述光发酵尾液中大部分有机酸被利用，如表2所示。
(4)氢气的纯化和微藻的培养：将步骤(2)和步骤(3)的气相产物输送到气体分离设备，将其中的H2与CO2进行分离，使用1L的集气装置对H2进行收集，并测量H2的量(如表1所示)。
在无菌条件下，以0.4g/L将钝顶螺旋藻和微藻培养基接种于5L的微藻生长反应器中，将分离后的CO2通入微藻生长反应器中，控制pH为8.0～9.5、光照度为6000lux、昼夜比为12h/12h，30℃恒温静置培养，该培养利用步骤(2)和步骤(3)的气相产物中的CO2作为微藻生长的营养。通过微藻生长反应器后，几乎全部的CO2均被微藻吸收利用。将液相的微藻培养液进行步骤(1)的处理。
实施例2：以微藻生物质作为发酵底物的低碳零排放制取氢气
本实施例所采用的微藻为小球藻。
(1)微藻生物质预处理：在离心机中以8000转/分钟的速度对含有微藻生物质的微藻培养液离心10分钟，将微藻生物质与微藻培养液分离，将得到的湿微藻在烘箱中于105℃加热干燥12小时至恒重，随后用磨粉机将干燥后的微藻磨碎成粒径≤200μm的微藻干粉。
(2)暗发酵产氢：在300-mL的暗发酵反应器中加入步骤(1)获得的微藻干粉20g，并加入20mL产气肠杆菌(2g/L)和160mL灭菌的暗发酵培养基。暗发酵培养基的初始pH用6MHCl或6MNaOH调为6.7，通入N220min以保持厌氧环境，置于黑暗环境中的36℃水浴锅中进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸等小分子有机酸。其中乙酸和丁酸占绝大部分。该步骤所生成的H2和CO2的体积以及有机酸的浓度如表1所示。
(3)光发酵产氢：以转速为4800rpm对步骤(2)的暗发酵尾液沉淀离心30分钟，收集上清液，并用去离子水稀释3倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，控制光发酵培养基的初始pH值为6.8，接入沼泽红假单胞菌。将光发酵培养物转移至1000-mL光发酵反应器中，通入N220min以保持厌氧环境，然后置于6500lux光照条件下进行培养，发酵温度为32℃。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为光发酵尾液，所述光发酵尾液中大部分有机酸被利用，如表2所示。
(4)氢气的纯化和微藻的培养：将步骤(2)和步骤(3)的气相产物输送到气体分离设备，将其中的H2与CO2进行分离，使用1L的集气装置对H2进行收集，并测量H2的量(如表1所示)。
在无菌条件下，以0.6g/L将小球藻和微藻培养基接种于5L的微藻生长反应器中，将分离后的CO2通入微藻生长反应器中，控制pH为8.0～9.5、光照度为6500lux、昼夜比为12h/12h，32℃恒温静置培养，该培养利用步骤(2)和步骤(3)的气相产物中的CO2作为微藻生长的营养。通过微藻生长反应器后，几乎全部的CO2均被微藻吸收利用。将液相的微藻培养液进行步骤(1)的处理。
实施例3：以微藻生物质作为发酵底物的低碳零排放制取氢气
本实施例所采用的微藻为硅藻。
(1)微藻生物质预处理：在离心机中以8000转/分钟的速度对含有微藻生物质的微藻培养液离心10分钟，将微藻生物质与微藻培养液分离，将得到的湿微藻在烘箱中于105℃加热干燥12小时至恒重，随后用磨粉机将干燥后的微藻磨碎成粒径≤200μm的微藻干粉。
(2)暗发酵产氢：在300-mL的暗发酵反应器中加入步骤(1)获得的微藻干粉30g，并加入20ml阴沟肠杆菌(2g/L)和150ml灭菌的暗发酵培养基。暗发酵培养基的初始pH用6MHCl或6MNaOH调为7.0，通入N220min以保持厌氧环境，置于黑暗环境中的37℃水浴锅中进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸等小分子有机酸。其中乙酸和丁酸占绝大部分。该步骤所生成的H2和CO2的体积以及有机酸的浓度如表1所示。
(3)光发酵产氢：以转速为4800rpm对步骤(2)的暗发酵尾液沉淀离心30分钟，收集上清液，并用去离子水稀释3倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，控制光发酵培养基的初始pH值为7.0，接入球形红杆菌。将光发酵培养物转移至1000-mL光发酵反应器中，通入N220min以保持厌氧环境，然后置于7000lux光照条件下进行培养，发酵温度为28℃。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为光发酵尾液，所述光发酵尾液中大部分有机酸被利用，如表2所示。
(4)氢气的纯化和微藻的培养：将步骤(2)和步骤(3)的气相产物输送到气体分离设备，将其中的H2与CO2进行分离，使用1L的集气装置对H2进行收集，并测量H2的量(如表1所示)。
在无菌条件下，以0.8g/L将硅藻和微藻培养基接种于5L的微藻生长反应器中，将分离后的CO2通入微藻生长反应器中，控制pH为8.0～9.5、光照度为7000lux、昼夜比为12h/12h，33℃恒温静置培养，该培养利用步骤(2)和步骤(3)的气相产物中的CO2作为微藻生长的营养。通过微藻生长反应器后，几乎全部的CO2均被微藻吸收利用。将液相的微藻培养液进行步骤(1)的处理。
在各实施例中，根据公式1计算各步骤的产氢率：
各步骤产氢率＝各步骤产生气体体积(mL)×气相产物中氢气的体积浓度(％)/初始加入的微藻干粉重量(g)(公式1)
气相产物中氢气的体积浓度利用气相色谱法测定。另外，在各实施例中，暗发酵和光发酵的发酵尾液中有机酸的测量方法如下：
暗发酵液成分主要为挥发性脂肪酸和醛类有机物，包括乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、糠醛等物质，使用带有氢火焰离子检测器(FID)的气相色谱仪(GC，型号：ThermoFiniganTrace2000，美国)来测定液相成分及其含量。气相色谱仪中的色谱柱型号为DB-Waxtre(φ5mm×2m)，实验中程序升温方法：初始温度50℃，保持2min，升温速率为10℃/min，终止温度为210℃，停留2min。运行时载气为He，流量为50ml/min；H2和空气流量分别为35ml/min和350ml/min，检测器温度为280℃，柱温为240℃。测试样pH调至2.0左右，进样量为1.0μl。实验中标准溶液中含有浓度为0.05％(V/V)的乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸，测试样品得到相应色谱图后，通过出峰时间和峰面积对比得到发酵液的各成分及其含量。
表1各实施例中各步骤的产氢率、氢气浓度与有机酸去除率(实施1次)
表2各实施例的总产氢率、氢气浓度与有机酸去除率
Claims (8)
1.一种以微藻生物质作为发酵底物制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)微藻生物质预处理：通过离心将微藻生物质从微藻培养液中分离，将得到的湿微藻干燥至恒重，随后将干燥后的微藻磨碎成微藻干粉；
(2)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(1)获得的微藻干粉，接入暗发酵产氢菌种和暗发酵培养基，保持厌氧环境进行暗发酵，将气相产物导出；
(3)光发酵产氢：将步骤(2)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，作为光发酵产氢的底物，接入光发酵产氢菌种和光发酵培养基，保持厌氧环境进行光发酵，将气相产物导出；
(4)氢气的纯化和微藻的培养：将步骤(2)和步骤(3)的气相产物输送到气体分离设备，将H2与CO2进行分离，将分离后的CO2通入微藻生长反应器，并接入微藻和微藻培养基，利用所述气相产物中的CO2作为微藻生长的营养；对分离出的H2进行收集；对于液相的微藻培养液，任选进行步骤(1)的处理。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)或步骤(4)中所述的微藻是选自于螺旋藻、硅藻、小球藻、蓝藻、微拟球藻、雨生红球藻中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中所述的微藻干粉的粒径≤200μm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)具有如下条件中的一个或多个：
所述的暗发酵产氢菌种为选自于由丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、巴氏梭菌、嗜热芽孢杆菌、热纤维梭菌所组成的组中的一种或多种；
所述的暗发酵培养基的组成为：4g/L蛋白胨、0.5g/LL-半胱氨酸、4g/LNaCl、0.1g/LMgCl2、0.1g/LFeCl2、1.5g/LK2HPO4、10mL维生素液、以及10mL微量元素液；其中，所述维生素液的成分为：0.025g/L抗坏血酸、0.02g/L柠檬酸、0.01g/L叶酸、以及0.01g/L对氨基苯甲酸；所述微量元素液的成分为：0.01g/LMnCl2、0.05g/LZnCl2、0.01g/LH3BO3、0.01g/LCaCl2以及0.01g/LAlK(SO4)2；
所述暗发酵产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L；
所述微藻干粉与暗发酵培养基的加入量之比为5％-30％(w/v)；
所述暗发酵的发酵溶液温度为25℃～45℃；和/或
所述发酵溶液初始pH值为6.0～9.0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，在将步骤(2)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，用去离子水稀释2-6倍，再进行光发酵。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)具有如下条件中的一个或多个：
所述光发酵菌种为选自于红螺菌属、红假单胞菌属或红杆菌属细菌的一种或多种，优选为选自于深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红杆菌中的一种或多种；
所述光发酵培养基为：0.5g/LKH2PO4、0.6g/LK2HPO4、0.2g/LNaCl、0.2g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2·2H2O、2.0g/LNaHCO3、1.87g/L谷氨酸钠、1.0mL维生素液、以及1.0mL微量元素液；其中，所述微量元素液的成分为：2.0g/LEDTA-2Na、2.0g/LFeSO4·7H2O、0.1g/LZnCl2、0.05g/LCu(NO3)2·5H2O、0.1g/LMnCl2·4H2O、以及0.02g/LNiCl2·6H2O；所述维生素液的成分为：0.1g/L生物素、0.35g/L烟酸、0.2g/L对氨基甲苯、0.1g/L泛酸钙、以及0.05g/L维生素B12；
按照与任选稀释后的暗发酵尾液相等的体积加入光发酵培养基；
所述光发酵产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L；
所述光发酵的发酵溶液温度为28℃～35℃；
所述光发酵初始pH值为5.5～9.0；和/或
所述光发酵的光照度为1000lux～20000lux。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述步骤(4)具有如下条件中的一个或多个：
所述微藻培养基的组成为：0.5g/LK2HPO4、2.5g/LNaNO3、1.0g/LK2SO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、0.04g/LCaCl2、0.01g/LFeSO4·7H2O、以及1.0mL/L微量元素液；其中，所述微量元素液的组成为：其中，所述微量元素液的组成为：2.86g/LH3BO3、1.81g/LMnCl2·4H2O、0.22g/LZnSO4·7H2O、0.08g/LCuSO4·5H2O以及0.01g/LMoO3；
所述微藻在所述微藻培养基中的接种量为0.4～0.8g微藻种子/L培养基；
所述微藻培养的温度为25℃～40℃恒温培养；
所述微藻培养液的pH值为5.5～10.0、优选8.0～9.5；和/或
所述光发酵的光照度为1000lux～20000lux，昼夜比为12h/12h。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，对本发明的步骤(1)至步骤(4)进行循环。
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