CN105707659A - 纳米硒霉菌毒素解毒剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米硒霉菌毒素解毒剂及其制备方法和用途，由纳米硒、壳聚糖配比复合制成。本发明利用饲用益生菌制备的纳米硒具有抗氧化、免疫调节和抗霉菌毒素等多种功能，功能纳米硒的使用可以发送动物机体的免疫功能，强化肝脏解毒功能，缓解霉菌毒素中毒的临床症状；纳米硒霉菌毒素解毒剂制备工艺简单，条件温和，易于实现规模化生产。

Description

纳米硒霉菌毒素解毒剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种纳米硒霉菌毒素解毒剂及其制备方法和用途。

背景技术

霉菌毒素是一类在霉菌生长过程中产生的有毒次级代谢物，目前大约有300多种霉菌代谢产物对人类和动物具有毒性，其中对人类和动物健康影响最大的霉菌毒素有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素和呕吐毒素等。在农作物和饲料生产、加工、贮存和运输过程中，由于霉菌及其毒素的污染导致饲料霉变、消化率降低、动物霉菌毒素中毒等危害，给饲料业和养殖业造成巨大经济损失，更为重要的是霉菌毒素不仅可以直接对动物造成毒害,还可以通过食物链从动物转移到人体中，危害人类健康。饲料被霉菌及其毒素污染一直是饲料业和畜牧业生产普遍存在的事件，当前饲料及原料霉菌毒素污染范围更广，污染程度更高，且多种霉菌毒素共存的现象更为普遍，高达96.48%的饲料及原料受到2种及以上霉菌毒素污染（杜妮.2015年上半年饲料及原料霉菌毒素污染及调查报告[J].今日养猪业,2015,7:48-51），动物采食了主要含呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的自然霉变饲料可导致氧化损伤，免疫功能降低，生长受到抑制（朱祖贤，朱风华，王友令等．霉菌毒素对肉鸡抗氧化和免疫功能的影响[J].中国畜牧杂志，2014,50(19):78-83），因此如何预防和控制饲料中的霉菌毒素，降低其危害，已成为当前农业、环境、卫生及食品等领域迫切需要解决的问题。在实际生产中，目前国内外防控饲料霉菌及其毒素污染的主要方法是使用防霉脱霉剂。常用的防霉脱霉剂主要为有机酸及其盐类、硅铝酸盐及其衍生物类、酵母细胞壁类、微生物类、酶类和中草药类等等。大部分脱霉剂作用的机理是依靠其较强的吸附毒素的性能，减少霉菌毒素被机体吸收，减轻其对机体的毒害作用，从而达到脱毒的效果。但总有少量霉菌毒素不被吸附并被机体吸收，对机体产生毒害作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高效吸附霉菌毒素的纳米硒霉菌毒素解毒剂及其制备方法和用途。

本发明的技术解决方案是：

一种纳米硒霉菌毒素解毒剂，其特征是：由纳米硒、壳聚糖配比复合制成。

一种纳米硒霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征是：步骤如下：

（1）在活化的饲用益生菌培养液中加入硒盐溶液进行培养；

（2）收集培养液，超声破碎洗涤后，即得红色的纳米硒;

（3）透射电子显微镜观察纳米硒的表征；

（4）测定纳米硒含量及其抗氧化活性；

（5）将纳米硒、壳聚糖混合均匀制得纳米硒霉菌毒素解毒剂。

使用的饲用益生菌为地衣芽孢杆菌。

使用的硒盐为亚硒酸钠或二氧化硒中的任意一种。

步骤（1）的培养条件为30-37℃，100-200RPM培养24-48h。

纳米硒与壳聚糖配比为1:0.1-10。

一种纳米硒霉菌毒素解毒剂在制备吸附霉菌毒素和消除霉菌毒素毒害制剂中的应用。

本发明制备的纳米硒霉菌毒素解毒剂具有以下优点：

A.利用饲用益生菌制备的纳米硒具有抗氧化、免疫调节和抗霉菌毒素等多种功能，功能纳米硒的使用可以发送动物机体的免疫功能，强化肝脏解毒功能，缓解霉菌毒素中毒的临床症状；

B.生物多聚物壳聚糖是由甲壳动物外壳提取的一种高效物质，具有较强的抗细菌、真菌活性，其多孔径的结构可以大面积的吸附霉菌毒素；

C.将纳米硒与壳聚糖集成制备的纳米硒霉菌毒素解毒剂，使解毒剂在高效吸附霉菌毒素的同时，提高动物机体的免疫机能和抗氧化能力，从体内和体外两个方面减轻或消除霉菌毒素对畜禽健康和生产性能的影响，在纳米硒霉菌毒素解毒剂抗霉菌毒素应用效果试验中，添加纳米硒霉菌毒素解毒剂可以完全消除霉菌毒素DON对蛋鸡体重、产蛋率、非正常蛋比例和血清总抗氧化能力等的影响，解毒效果极显著；

D.纳米硒霉菌毒素解毒剂制备工艺简单，条件温和，易于实现规模化生产。

附图说明

图1为利用饲用益生菌制备的红色纳米硒图。图中A在地衣芽孢杆菌培养液中加入一定量的亚硒酸钠溶液，30-37℃、100-200r/min振荡继续培养24-48h，亚硒酸钠被地衣芽孢杆菌还原为红色单质硒；B正常的衣芽孢杆菌培养液对照。。

图2为利用饲用益生菌制备的红色纳米硒的电镜观察图。将饲用益生菌制备的红色纳米硒滴于铜网，染色后透射电子显微镜下观察，纯化后的红色纳米硒颗粒粒径大小为100nm左右。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明，但并不将本发明限制在所述的具体实施方式的范围中。如无特别说明，实施例所用方法和实验材料均为常规方法和实验材料。

实施例1红色纳米硒的生物合成

从保存管中吸取一定量的饲用益生菌地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis.)，划LB琼脂板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种4mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养过夜，按1%接种100mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养4h，使OD600值达0.4-0.8，加入终浓度为2mmol/L经过滤除菌的亚硒酸钠溶液，37℃、150r/min振荡继续培养24h，地衣芽孢杆菌将亚硒酸钠还原为红色单质硒（图1）。

实施例2红色纳米硒的生物合成

从保存管中吸取一定量的饲用益生菌地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis.)，划LB琼脂板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种4mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养过夜，按1%接种100mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养4h，使OD600值达0.4-0.8，加入终浓度为1mmol/L经过滤除菌的亚硒酸钠溶液，37℃、100r/min振荡继续培养24h，地衣芽孢杆菌将亚硒酸钠还原为红色单质硒。

实施例3红色纳米硒的生物合成

从保存管中吸取一定量的饲用益生菌地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis.)，划LB琼脂板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种4mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养过夜，按1%接种100mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养4h，使OD600值达0.4-0.8，加入终浓度为5mmol/L经过滤除菌的亚硒酸钠溶液，37℃、200r/min振荡继续培养48h，地衣芽孢杆菌将亚硒酸钠还原为红色单质硒。

实施例4红色纳米硒的生物合成

从保存管中吸取一定量的饲用益生菌地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis.)，划LB琼脂板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种4mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养过夜，按1%接种100mLLB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养4h，使OD600值达0.4-0.8，加入终浓度为2mmol/L经过滤除菌的亚硒酸钠溶液，30℃、150r/min振荡继续培养48h，地衣芽孢杆菌将亚硒酸钠还原为红色单质硒。

实施例5纳米硒的提取与纯化

收集培养后的菌液，4000r/min离心15min，弃去上清，沉淀用生理盐水清洗三次后使用一定量的去离子水重悬，超声震荡破碎（100kV，间歇5s，30min）。4000r/min离心15min，沉淀后用含1%SDS的1.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.3)洗涤3次，取4mL重悬液和2mL仲辛醇于10mL试管中，充分混匀。2000r/min离心10min，4℃沉淀24h，沉淀依次通过氯仿、乙醇、和无菌水洗涤后于4℃保存备用，按照GB5009.93-2010中的方法测定硒浓度。

实施例6纳米硒的表征观察

透射电子显微镜观察发现，纯化后的红色纳米硒颗粒粒径基本在50～200nm，绝在部分处于100nm以下（图2）。纳米级红色单质硒具有毒性小，抗氧化和免疫调节活性高，能够充分被机体吸收等优点。本发明提供的利用饲用益生菌地衣芽孢杆菌还原亚硒酸盐得到活性单质硒的方法，操作简便，易于扩大化，在工业上具有广阔的应用前景。

实施例7纳米硒的抗氧化活性

对合成的红色纳米硒进行DPPH试验。紫色的DPPH具有自由基，遇到抗氧化剂的时候会变成黄色，在517nm处具有吸收峰，因此常作为抗氧化剂的鉴定指示剂。DPPH自由基清除率的大小可以作为评价抗氧化剂抗氧化能力大小的一个重要指标。将纳米硒配制成10个等差浓度，取1mL纳米硒与1mLDPPH溶液（溶于无水乙醇，50μg/mL）充分混匀，再加入3mL甲醛充分混合，室温避光处反应30min以上。同时，配置与纳米硒同样浓度的Na2SeO3和BHT试剂（常用抗氧化剂）做对照进行试验。所有样品和对照均重复三次。自由基清除率计算公式：

自由基清除率（%）=[1-(Aa-Ab)/Ac]×100%

Aa：样品和DPPH混合溶液在517nm处吸光度。

Ab：样品在517nm处吸光度。

Ac：去离子水和DPPH混合液在517nm处的吸光度。

结果表明，SeNPs与Na2SeO3均具有清除自由基的能力，且SeNPs清除自由基的能力高于Na2SeO3s清除自由基的能力，这改变了人们传统上认为硒单质（Se0）无生物活性的认识，这也正是红色单质硒有别于灰色或黑色等其它一般单质硒的重要特性。

实施例8纳米硒霉菌毒素解毒剂的配制

按重量配比计，依次向反应器内加入1Kg纳米硒和1Kg壳聚糖，并不停搅动，搅动时间10分钟得纳米硒霉菌毒素解毒剂。本纳米硒霉菌毒素解毒剂在饲料中建议添加量为1g/t。

实施例9纳米硒霉菌毒素解毒剂的配制

按重量配比计，依次向反应器内加入1Kg纳米硒和1Kg壳聚糖，并不停搅动，搅动时间30分钟得纳米硒霉菌毒素解毒剂。本纳米硒霉菌毒素解毒剂在饲料中建议添加量为1g/t。

实施例10纳米硒霉菌毒素解毒剂抗霉菌毒素应用效果

将购买的20周左右蛋鸡32只（平均产蛋率维持在95%以上），随机分成4组，每组8只蛋鸡，第一组为空白对照组，第二组为霉菌毒素DON组，第三组霉菌毒素DON+纳米硒霉菌毒素解毒剂组，第四组为纳米硒霉菌毒素解毒剂组。试验期28天，通过体重、产蛋率、血液生化等指标的检测评估纳米硒霉菌毒素解毒剂对霉菌毒素DON的解毒效果。

应用效果，霉菌毒素DON组的蛋鸡在试验周期内产蛋率、体重和血清总抗氧化能力均显著（P<0.05）低于其它三组，说明霉菌毒素DON可显著引起产蛋鸡体重和产蛋率的下降，DON+纳米硒霉菌毒素解毒剂组蛋鸡的体重、产蛋率和血清总抗氧化能力与正常组无显著差异，说明添加纳米硒霉菌毒素解毒剂可以显著改善DON造成的蛋鸡体重、产蛋量和血清总抗氧化能力下降的情况。DON组非正常蛋比例显著（P<0.05）高于其余三组，添加纳米硒霉菌毒素解毒剂可以显著（P<0.05）降低非正常蛋（血斑蛋、雀斑蛋、软壳蛋）比例。以上结果证明，本发明制备的纳米硒霉菌毒素解毒剂可以有效的吸附霉菌毒素，降低和消除霉菌毒素引起的体重下降、产蛋率降低、非正常蛋增加、总抗氧化能力下降等毒害作用，在抗霉菌毒素毒性作用方面取得非常好的应用效果，具有广阔的开发应用前景。

Claims (7)

1.一种纳米硒霉菌毒素解毒剂，其特征是：由纳米硒、壳聚糖配比复合制成。

2.一种权利要求1所述的纳米硒霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征是：步骤如下：

（1）在活化的饲用益生菌培养液中加入硒盐溶液进行培养；

（2）收集培养液，超声破碎洗涤后，即得红色的纳米硒;

（3）透射电子显微镜观察纳米硒的表征；

（4）测定纳米硒含量及其抗氧化活性；

（5）将纳米硒、壳聚糖混合均匀制得纳米硒霉菌毒素解毒剂。

3.根据权利要求2所述的纳米硒霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征是：使用的饲用益生菌为地衣芽孢杆菌。

4.根据权利要求2或3所述的纳米硒霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征是：使用的硒盐为亚硒酸钠或二氧化硒中的任意一种。

5.根据权利要求2或3所述的纳米硒霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征是：步骤（1）的培养条件为30-37℃，100-200RPM培养24-48h。

6.根据权利要求2或3所述的纳米硒霉菌毒素解毒剂的制备方法，其特征是：纳米硒与壳聚糖配比为1:0.1-10。

7.一种权利要求1所述的纳米硒霉菌毒素解毒剂在制备吸附霉菌毒素和消除霉菌毒素毒害制剂中的应用。