CN105705934B - 用于确定测量颗粒的电荷的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
确定测试颗粒电荷的方法：在连接腔室的孔径上施加电流或电压其中之一，使腔室填充电解液，且使测试颗粒悬浮在腔室电解液中；测量表明孔径上的电流或电压中另一的数值；确定第一和第二时间点的时间间隔，第二时间点对应于电流或电压达到在第一时间点测量的电流或电压的特定比例时的时间点；确定表明具有已知电荷的校准颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到校准颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；确定表明测试颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到测试颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；以及利用表明测试颗粒和校准颗粒的电速度分量的所确定数值来校准测试颗粒的电荷与所确定的时间间隔之间的量化关系。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测量颗粒的电荷的方法，特别是悬浮在流体中的纳米到微米尺寸的颗粒的表面电荷。本发明还扩展到用于在前述方法中使用的设备，以及对于这样的设备所使用的用于实施前述方法的计算机程序。
背景技术
处于纳米和微米范围内的物体的表面电荷是其稳定性和一般活性的关键因素。表面电荷以及表面电荷的改变还可以被用来检测和量化样本中的特定目标的存在。因此，准确地测量物体的表面电荷的能力对于从工业(例如颜料、墨水和涂料制造)到制药(例如疫苗QA)和科学研究(例如开发纳米医学和特定分子诊断测试)等领域的用户都是非常重要的。
用于测量颗粒的表面电荷的当前实践包括动态光散射(DLS)(相位分析光散射——准电光散射)。动态光散射被用来测量颗粒和分子尺寸。这种技术测量在布朗运动下移动的颗粒的扩散，并且利用Stokes-Einstein关系将其转换成尺寸和尺寸分布。
与DLS相结合，激光多普勒微电泳被用来测量颗粒的ζ电位或表面电荷。在这种方法中，对分子的溶液或颗粒的分散体施加电场，所述分子或颗粒随后以与其ζ电位相关的速度移动。利用激光干涉技术来测量这一速度(相位分析光散射或PALS)。这样就允许计算电泳淌度，并且由此计算ζ电位和ζ电位分布。
但是本发明的发明人已经认识到，这种方法存在限制。由于所述分析的性质，单独的颗粒尺寸和ζ电位没有被测量，这是一种“系综(ensemble)”技术。因此，基于表面电荷来划分尺寸类似的群体是不可能的；对于一组颗粒的表面电荷的细微偏移的识别也是不可能的，而所述识别可以被用作诊断测量。本发明的发明人已经认识到，这样就限制了可以应用所述技术的应用范围。
本发明的发明人认识到，DLS分析的另一项限制在于，混合颗粒群体的平均尺寸分布被人为地朝向更大的颗粒偏斜，其散射大量的光从而可能会遮挡较小的颗粒。
对于颗粒表面电荷的测量所使用的另一种方法是纳米颗粒跟踪分析或NTA。与DLS一样，NTA测量纳米颗粒在2维中的布朗运动，其运动速度或扩散系数Dt通过Stokes-Einstein方程与颗粒尺寸相关。在NTA中，通过视频来分析该运动；在二维中跟踪单独的颗粒位置改变，从而确定颗粒扩散。在知道Dt的情况下，随后可以在逐个颗粒的基础上确定颗粒流体动力学直径(hydrodynamic diameter)。通过对样本施加偏置电压，NTA还可以测量电泳速度并且导出ζ电位。
本发明的发明人已经认识到，NTA的限制包括对相对较少数目的颗粒进行分析，以及有可能对相同的颗粒测量几次。此外，应用了复杂的算法来计算颗粒尺寸和电荷，并且如果输入设定是错误的或者未知的，则答案可能是严重错误的。此外，还需要应用补偿因数以便平衡由于激光加热效应而导致的电渗透流动(electro-osmotic flow)和对流。
特别被用于颗粒表面电荷的测量的另一种方法是通过使用通过电阻脉冲感测而测量的颗粒平移速率(translation rate)或持续时间。
已经描述了用以测量各个颗粒群体的相对电泳速度的多种技术，这是通过调节在纳米孔隙上施加的电压或压力并且观察电阻脉冲的颗粒移位速率(translocation rate)或持续时间(通常是FWHM)中的改变而实现的。
Vogel(Vogel,R.等人的“A Variable Pressure Method for CharacterizingNanoparticle Surface Charge Using Pore Sensors(利用孔隙传感器来表征纳米颗粒表面电荷的可变压力方法)”，Analytical Chemistry，2012.84(7):p.3125-3131)描述了这样的一种应用，其中把样本颗粒放置在纳米孔隙的全部两侧上，并且调节施加在纳米孔隙上的压力直到颗粒流动的方向反转为止。达到该“逆转点”所需要施加的压力被用作电泳淌度的度量。在该逆转点处，颗粒穿过孔隙移位所花费的时间趋向于无穷大，因此移位持续时间也可以被用作一个指标。
本发明的发明人认识到，这些方法的主要限制在于其是系综方法(不是逐个颗粒)，并且由于其需要调节许多参数和许多测量因此较为耗时。此外，特别对于压力扫描方法，测量的持续时间和流体流动的反转大大增加了颗粒部分地阻塞感测区块的几率。
Kozak描述了用于表面颗粒电荷的测量的另一种方法(Kozak,D.等人的“Simultaneous size andζ-potential measurements of individual nanoparticles indispersion using size-tunable pore sensors(利用尺寸可调谐的孔隙传感器对分散体中的各个单独的纳米颗粒同时进行尺寸和ζ电位测量)”，ACS nano，2012.6(8):6990-6997)。该方法通过分析电阻脉冲数据提供了单个颗粒电荷测量。Kozak等人描述了一种对锥形纳米孔隙进行建模并且计算经过纳米孔隙的颗粒上的所有力的方法。该方法产生可以基于表面电荷对具有类似尺寸的颗粒进行区分的逐个颗粒表面电荷数据，并且对于不同的偏置电压给出一致的ζ电位结果。
本发明的发明人认识到，该方法的缺点在于感测孔隙的几何结构和ζ电位必须是精确地已知的，必须在分析期间是不变的，并且能够被建模。在Kozak等人所描述的实例中，假设孔隙的几何结构是完美的锥形，并且计算是基于该假设。本发明的发明人已经认识到，在实践中，孔隙通常不是锥形的，并且在许多情况下甚至不是旋转对称的。在应用中，Kozak等人所描述的方法要求对感测孔隙的精确几何结构和规格进行测量和建模，并且要求孔隙电荷是准确地已知的。这在商业上是不实际的。简单地把Kozak等人所描述的锥形模型应用作为近似也是不实际的，因为这要求孔隙入口和出口的实际纳米尺寸连同实际孔隙电荷必须是已知的。因此，本发明的发明人认识到，在实践中，所述模型的正确地预测不同压力下的流体流动的能力是非常有限的。
Arjmandi等人描述的最后一种方法(Arjmandi等人的“Measuring the electricCharge and Zeta potential of Nanometer-Sized Objects Using Pyramidal-ShapedNanopores(利用金字塔形状的纳米孔隙测量纳米尺寸物体的电荷和ζ电位)”，AnalyticalChemistry，2012.84：8490-8496)是基于测量作为所施加的电压的函数的经过纳米孔隙的颗粒的移位的持续时间。
除了前面所描述的缺点之外，本发明的发明人所认识到的现有方法的另外的缺点还包括：
1、纯粹基于电泳的方法可能是不实际的。举例来说，具有范围较宽的ζ电位(潜在地从正值达到负值)的颗粒样本可能需要施加外部压力以便捕获整个颗粒ζ电位范围。此外，在测量非常稀释的颗粒悬浮液的电荷/ζ电位时，纯粹基于电泳的方法由于低计数率而变得不实际。此外，在没有施加任何压力的情况下测量具有较大比例的接近中性的颗粒的颗粒悬浮液时，大多数中性颗粒可能不会穿过孔隙移位，因此可能不会被测量，从而使得结果发生偏斜。
2、孔隙材料的ζ电位的改变常常未被考虑。对于生物样本，特别是原位生物分子反应，颗粒和/或生物分子(比如DNA或蛋白质)可能会涂覆孔隙。如果发生这种情况，则对于颗粒运动的电渗透贡献可能会变得重要。
3、现有的方法常常仅在感测区段的末端评估平均速度和电场。
4、忽略电渗透会大大限制关于可以使用的纳米孔隙材料的选择。与典型的生物颗粒相比，许多纳米孔隙材料更加高度带电。
5、对于颗粒电荷的准确测量在很大程度上取决于电子装置的采样频率。
发明内容
通过提供一种用于测量颗粒表面电荷的方法，本发明的实施例克服或者至少减轻了与现有方法相关联的至少其中一些问题，所述方法：允许逐个颗粒的电荷测量；能够测量大量颗粒；不受限于在分析之前以高精度测量系统几何结构的要求；包括在其理论方法中考虑到对流和电渗透；并且合并了纳米孔隙上的差分压力，其可以被用来放慢颗粒的移位，从而允许对于每一个颗粒更好地解析阻滞(blockade)形状，这对于利用具有已知ζ电位的颗粒准确地校准纳米孔隙是特别有用的。
在某些实施例中，本发明提供一种使用由行经具有已知或未知的几何结构的电阻脉冲传感器的各个单独物体生成的信号的尺寸和形状来测量其相对电泳淌度的方法，所述电阻脉冲传感器例如是纳米孔隙或微孔隙(或者更一般来说是孔径)。通过分别利用具有已定义的表面电荷密度或ζ电位的颗粒来校准电阻脉冲传感器，可以计算每一个物体的表面电荷密度和ζ电位。
经过用于分析的孔隙的物体可以由任何材料构成，其中包括固体(例如碳、二氧化硅、聚合物、金属)、生物颗粒(例如病毒、细菌、微泡、外来体、脂质体、细胞)、液体(例如乳状液)或者气体(例如纳米气泡)。在优选的形式中，使用固体校准颗粒(例如羧化聚苯乙烯)。因此，穿过孔隙的物体在后面被称作“颗粒”。
当每一个颗粒穿过孔隙时，存在所得到的电阻脉冲或“阻滞”。对于具有较小高宽比的(在很大程度上是球形的)物体，任何给定的阻滞的一般形状由孔隙的形状决定——取决于每一个颗粒的尺寸和速度，该一般形状在量值(高度)和持续时间(宽度)方面被“拉伸(stretched)”。
通过利用对应于每一项阻滞的相对量值进行工作，可以从电荷分析计算中消除颗粒尺寸的差异。当比例阻滞量值对于任何给定的颗粒都相等时，这些颗粒处于孔隙中的相同位置(或者至少被认为处于相同位置)。因此，通过比较颗粒从阻滞脉冲上的任何一致的已定义点到达该点所花费的时间，可以直接导出这些颗粒的相对速度。
在净压力和电压偏置下行经孔隙的颗粒将具有三个速度分量：
1、对流——压力驱动的流体流动将随之携带颗粒
2、电泳——颗粒电荷将导致颗粒朝向电性相反的电极移动经过周围的流体
3、电渗透——孔隙隔膜的表面电荷(其通常是负的)吸引更高密度的电性相反的(其通常是正的)离子存在于孔隙的附近。这些正离子朝向负电极移动，并且随之携带水分子从而产生流体的“活塞流(plug flow)”。
通常来说，仅有电泳分量将基于表面电荷在颗粒之间变化。本发明提供了这样一种方法，其将颗粒速度解析成所述三个分量，并且通过把所测量的电泳速度与具有已知表面电荷的校准颗粒的电泳速度进行比较而导出未知颗粒的表面电荷。
对于相同实验条件下的任何两个颗粒，当相对阻滞量值相同时，传感器内的有效颗粒位置将是相同的。因此，对于由具有未知表面电荷(ζ电位)的颗粒生成的电阻脉冲，所测量的速度连同从校准颗粒导出的已知的对流和电渗透分量被用来计算所测量的颗粒的电泳速度。随后通过把该所测量的电泳速度与具有已知表面电荷(ζ电位)的校准颗粒进行比较来计算颗粒表面电荷(ζ电位)。
这种新颖方法的长处在于其简单性。所述方法不需要关于传感器的几何结构的任何先前的知识，所述几何结构在商业的基础上测量起来过于昂贵并且耗时(利用电子显微镜检查或类似方法)。纯粹地基于电阻脉冲量值和形状，简单地针对已知的颗粒集合来校准每一个单独的未知物体的相对电泳速度，并且所需的时间和处理能力是最小的。
这种电荷测量方法在以下条件下会最佳地工作：
-将要测量的物体悬浮在电解液中，其浓度允许测量多个物体(为了操作人员方便，理想地在几分钟的时间段内)。
-将要测量的物体小于感测区域以避免阻滞。
-电流的采样频率快到足以在每一个脉冲上捕获若干数据点。如果采样频率对于特定设置过于缓慢，可以通过在孔隙上施加压力差或者调节(甚至反转)所施加的偏置电压来放慢脉冲。
-脉冲的信噪比大到足以能够以良好的准确度测量参考感兴趣点。如果信噪比过小，则可以通过增大所施加的偏置电压以及(对于灵活的孔隙)减小传感器的尺寸来增大信号。
-电泳占到作用在所测量的物体(特别是校准颗粒)上的总的力当中的很高比例。这通常可以通过增大偏置电压以及减小压力差来实现。
对于具有孔隙的真实生活样本的测量，特别是生物派生的样本，可能存在若干复杂化因素。这些复杂化因素包括：
i)样本颗粒(或者样本流体的其他成分)基于相反的极性结合到孔隙上。
ii)样本颗粒(或者样本流体的其他成分)到孔隙的非特异性结合。这些情形当中的任一种都可能导致隔膜的ζ电位ξm的改变，从而预期将会直接影响对应于每一个样本颗粒的绝对ζ电位的计算数值。
在孔隙被带电颗粒或生物分子(比如蛋白质或DNA)涂覆的情况下，孔隙ζ电位可能会改变并且影响电渗透。对孔隙ζ电位进行评估，以便准确地测量颗粒ζ电位。可以利用对孔隙施加的可变外部压力通过流动电位测量在原位确定孔隙ζ电位。通过施加某种程度上的可变外部压力，液体经过孔隙的移动产生流动电位和流动电流。通过考虑到孔隙的几何结构，从流动电位与压力斜率的关系计算孔隙ζ电位。
当在电阻脉冲传感器中监测化学和/或生物反应时，对于孔隙ζ电位的该原位测量是有用的。不同的生物系统可能会以非常不同的方式影响孔隙，在测量生物样本之前和之后检查孔隙的ζ电位允许检测和量化这些改变。
补偿这种结合效应的另一种方法是通过将校准颗粒(其具有已知的ζ电位)添加到样本流体中，随后将在对于样本完全相同的条件下对其进行测量。这种方法可以提供绝对表面电荷测量，即使孔隙的ζ电位已经例如被外来体、脂质体、蛋白质、核酸适体(aptamer)、DNA、RNA或者任何其他试剂所修改。这种方法的一个优点在于，如果孔隙特性在分析期间和/或作为分析的结果发生改变，则校准颗粒可以被用来解决分析过程中的改变，并且提供正确的样本测量。通过添加分别具有不同的已知ζ电位的多个校准颗粒集合可以增强这种方法。
应对与结合效应相关联的问题的另一种方法是通过对孔隙进行表面处理来防止结合。这可以包括利用防污试剂对孔隙表面进行永久性涂覆。或者，所述应对可以涉及紧接在测量之前把“阻断剂(blocking agent)”添加到孔隙，其结合到孔隙的表面上的所有可用附着位点，并且对于校准和样本测量的持续时间给出已知的稳定ζ电位。使用阻断剂的一个优点在于，阻断剂可以被匹配以便适应不同的样本颗粒类型和载体流体。
附图说明
图1是对应于一般锥形孔径的从以相同速度行进的更大和较小颗粒得到的阻滞形状的示意性比较。
图2是对应于不同孔径形状的从以相同速度行进的更大和较小颗粒得到的阻滞形状的示意性比较。
图3是对应于校准颗粒的平均(Vx)tot(即1/Tx)与偏置电压V的关系的曲线图(实例1)。
图4是对应于校准颗粒的作为dR max的百分比的函数从dR max的10％到40％所计算的(Vx)c的曲线图(实例1)。
图5是对应于多个所施加的压力的ζ电位与尺寸的关系的曲线图，其中示出了可重复的结果。
图6是对应于多个所施加的偏置电压的ζ电位与尺寸的关系的曲线图，其中示出了可重复的结果。
图7是对应于高度带电(羧化)和带电程度较低(普通)的PS颗粒的ζ电位与尺寸的关系的曲线图。
图8是ζ电位与尺寸的关系的曲线图，其中示出了通过检测ζ电位的改变来检测脂质体的表面修改。
图9是ζ电位与尺寸的关系的曲线图，其中示出了对于“添加(spiked)”有羧化校准颗粒的脂质体的悬浮液的测量。
具体实施方式
本发明的某些实施例涉及使用在WO2013017671中公开的设备，其全部内容被合并在此以作参考。
在本发明的某些实施例中，利用了形成在不可渗透的隔膜中的具有固定或可变几何结构的纳米孔隙或微孔隙。该孔隙的确切的几何结构和规格可以是已知的，但是所述孔隙的确切几何结构和规格通常将是未知的。
所述隔膜被装配到设备中，其允许把电解液的阱(或贮液器或腔室)放置在隔膜的任一侧——各个阱只通过孔隙本身彼此连接。在一种形式中，所述孔径或孔隙可以被提供作为薄板中的(小)孔洞，所述薄板形成两个腔室之间的(部分)壁面，从而把所述腔室彼此分开。所述设备包含与每一个电解液阱接触的至少一个电极，从而可以孔隙上施加用户定义的偏置电压，并且可以监测所得到的流过孔隙的电流。在本发明的某些实施例中，可以替换地施加流经孔隙的用户定义的电流，并且可以监测所得到的孔隙上的电压。
所述设备包括用于改变施加到任一个或全部两个电解液阱的压力的装置，从而可以在孔隙上的任一个方向上施加用户定义的差分压力(Pap)，从而得到电解液从一个阱到另一个的对流流动或者反之亦然。
由于重力和/或表面张力导致的系统的固有压头(Pin)是已知的，并且在(通常使用相同体积的流体实现的)各项测量之间是一致的。
经过用于分析的孔隙的物体可以由任何材料构成，其中包括固体(例如碳、二氧化硅、聚合物、金属)、生物颗粒(例如病毒、细菌、微泡、脂质体、细胞)、液体(例如乳状液)或者气体(例如纳米气泡)。在优选的形式中，使用固体校准颗粒(例如羧化聚苯乙烯)。因此，穿过孔隙的物体在后面被称作“颗粒”。
所述方法允许对改动颗粒ζ电位的颗粒表面上的化学/生物化学反应进行量化测量。检测颗粒ζ电位中的这种改变的能力构成基于孔隙的诊断化验的基础。表面反应可以包括核酸适体、蛋白质、抗体、凝集素、DNA、RNA、其他化学或生物化学试剂到颗粒表面的特异性结合。所述颗粒可以包括细胞、细胞外囊泡、亚细胞络合物、脂质体、合成颗粒，但是不限于此。可以通过在适当的条件下利用表面改性剂培育颗粒一段时间之前和之后的颗粒ζ电位的比较测量来对反应进行量化，或者可以实时地连续监测反应过程。
当每一个颗粒穿过孔隙时，存在所得到的电阻脉冲或“阻滞”。对于具有较小高宽比的(在很大程度上是球形的)物体，任何给定的阻滞的一般形状由孔隙的形状决定；取决于每一个颗粒的尺寸和速度，该一般形状在量值(高度)和持续时间(宽度)方面被“拉伸”。
图1示出了更大的颗粒(图1的上半部分)和较小的颗粒(图1的下半部分)以相同的速度行经孔隙的经过，其中相应的电阻与时间关系曲线图示出了所得到的阻滞形状。
所述方法识别出信号迹线中的最大电阻点(阻滞峰值)，其在优选的孔隙设置中靠近阻滞的开头。对于每一项阻滞，所述峰值发生的时间被定义成t100(100％峰值量值处的时间)，并且脉冲的最大量值(相对于局部基线电阻)被记录为dR max。
在最简单的实施例中，阻滞被划分成“n”个节段，并且对于每一个节段记录从t100算起的持续时间。在图1所示出的实例中存在n＝4个节段：dR max的40％、30％、20％和10％。从t100到这些节段当中的每一个的持续时间被定义在t40、t30、t20和t10处。
通过利用对应于每一项阻滞的相对量值进行工作，可以从电荷分析计算中消除颗粒尺寸的差异。当比例阻滞量值对于任何给定的颗粒都相等时，这些颗粒处于孔隙中的相同位置。因此，通过比较颗粒从t100到达该点所花费的时间，可以直接导出这些颗粒的相对速度。
在净压力和电压偏置下行经孔隙的颗粒将具有三个速度分量：
1、对流——压力驱动的流体流动将随之携带颗粒
2、电泳——颗粒电荷将导致颗粒朝向电性相反的电极移动经过周围的流体
3、电渗透——孔隙隔膜的表面电荷(其通常是负的)吸引更高密度的电性相反的(其通常是正的)离子存在于孔隙的附近。这些正离子朝向负电极移动，并且随之携带水分子从而产生流体的“活塞流”。
对流分量的量值随着所施加的压力线性增大，并且电分量的量值随着所施加的电压线性增大。
组合电力
如果颗粒电荷(ζ电位“ξp”)与隔膜电荷(ζ电位“ξm”)具有相同的极性，则电泳和电渗透是相反的力。其每mV的ζ电位的相对速度分量是相等并且相反的，因此如果颗粒和孔隙的ζ电位都是已知的(比如在使用校准颗粒时的情况)，则速度分量可以被简化到两个：
1、对流速度或“vc”
2、通过把孔隙的有效ζ电位设定到零并且如下设定颗粒的净ζ电位而获得的电速度或“ve”：
等式A：
ξnet＝ξp-ξm
对应于孔隙内的空间x中的任何给定点(在时间Ti x之后到达)的颗粒i的相对速度“(vi x)tot”由下式给出：
等式B：
应当注意的是，x在孔隙入口处被设定成等于0。vtot是经过时间平均的电速度分量和对流速度分量的总和(等式C)。通过把vtot替换成ve或vc，按照与等式B中的vtot类似的方式计算经过时间平均的电速度和对流速度。经过时间平均的速度通过等式B与时间的倒数相关。
等式C：
应当提到的是，该等式可以被应用在孔隙中的任何给定的参考点x处——对于简单的工作实例，在四个参考点t40、t30、t20和t10当中的每一个参考点处计算颗粒的表面电荷，并且对答案进行平均。可以应用更加先进的分析方法以便改进数据质量，正如后面详细描述的那样。
如等式D中所示，在N个校准颗粒(通常是200个)上对时间倒数1/Ti x进行平均：
等式D：
按照的相同方式在N个校准颗粒上对(vi x)tot进行平均：
等式E：
(vi x)tot与1/Ti x成比例(等式B)。出于计算的目的，自此之后将(vi x)tot设定到等于1/Ti x，其中Ti x是颗粒i从进入孔隙算起到达孔隙内的位置x所花费的持续时间。
等式E对于ve和vc也适用，因此等式F适用：
等式F：
(vx)tot＝(vx)e+(vx)c
校准孔隙以及量化对流分量
量化等式F中的对流分量vc将留下电分量ve，其可以被用来计算颗粒的表面电荷密度和ζ电位。
通常使用具有受到紧密控制的直径和已知的ζ电位ξp的带电校准颗粒来校准孔隙。在一定数目的所施加的电压V(例如V＝0.3V、0.5V和0.7V)下在孔隙中分析一定数目的校准颗粒(通常是每项分析多于200个)，并且通过在N个颗粒上对(vi x)tot进行平均来计算平均(vx)tot(参见等式E)。
(vx)tot随着电压的改变完全是由于(vx)e项而导致的，这是因为压力在三项测量之间未发生改变。
可以通过几种方式来计算(vx)c：
方法1：绘制(vx)tot与电压的关系曲线图，并且把所定义的线外插回到V＝0，在该点处颗粒上没有电力，因此没有电速度贡献((vx)e＝0)，因此(vx)c＝(vx)tot。
方法2：通过在不同压力下测量校准并且绘制(vx)tot与压力的关系曲线图来确定校准的(vx)c。(vx)tot与P的关系的线性曲线的斜率与每单位压力的相对对流速度vx P成比例，其被定义成：
等式G：
其中Pin是固有压头(对应于任何给定的装备设置的已知常数)，并且Pap是所施加的压力。
vx P可以被用来计算任何压力或真空设定Pap下的对流速度(vx)c。(vx)c和(vx)e可以被一同确定(通过计算其中一项并且从(Vx)tot中减去该项以确定另一项)，或者可以通过施加一定数目的压力和电压来独立地计算(分别通过绘制1/Ti x与P和1/Ti x与V的关系曲线图)。当在较大的压力和电压范围内分析样本和校准颗粒时，后一种方法可以给出更好的测量可重复性。具体来说，通过分开计算所述两个分量，有可能在速度分量占主导地位时更加准确地对其进行评估，并且对于电分量的情况也是类似的。当一个分量占主导地位时，对于另一个分量所计算的数值可能较不准确。如果调节设定(电压和压力)以使得一个力(对流或电力)相比于另一个占主导地位，则有可能更加准确地计算该力和相应的速度分量。随后可以调节设定以使得另一个力占主导地位，以便更加准确地计算该另一个力和相应的速度分量。这种方法可以避免随着各个力的相对贡献的变化而放大非主导分量的测量误差。举例来说，对流速度分量在电压扫描校准设定下可能仅构成总速度的一小部分，因此较大的误差可能存在于所计算的每单位压力对流速度中。当施加较大的压力或真空时，该误差可能会被极大地放大。因此，可以在第二压力数值处取得测量，并且从而可以独立地计算每单位压力的流动。这样可能导致电压扫描校准点处的较小偏差，但是对于施加一定范围的压力和真空给出了改进的稳定性。
量化对应于校准颗粒的电分量
在知道平均(vx)tot和平均(vx)c的情况下，现在可以利用在任何非零电压V下取得的测量对于校准颗粒计算平均(vx)e(等式F)。可以如下计算每单位电压的相对电速度vx V：
等式H：
其中vx V可以被用来计算任何电压V下的校准颗粒的理论(vx)e Cal。
计算样本颗粒的ζ电位
具有相同ζ电位的颗粒具有相同的表面电荷密度(假设Smoluchovski近似适用——其通常对应于生理缓冲液中的感兴趣颗粒的情况)，并且具有相同表面电荷密度的颗粒在所施加的电压下具有相同的电泳淌度并且与颗粒直径无关。
如下计算每一个样本(未知)颗粒的ζ电位：
从孔隙和流体阱中清除校准颗粒，并且在相同的孔隙拉伸下(对于灵活孔隙)在相同的电解液中分析样本颗粒。所施加的压力和电压可以不同于校准阶段。
对应于样本颗粒测量压力的对流速度(vx)c Sample是vx P与净压力(Pin+Pap)Sample的乘积(等式G)。
样本颗粒i的电速度(vi x)e Sample是所测量的(vi x)tot Sample减去所计算的(vi x)c Sample(等式F)。
在样本VSample设定下计算校准颗粒的理论电速度(vx)e Cal(等式H)，并且如下比较所述两个速度：
等式I：
由于其他三项是已知的，因此可以计算ξnet Sample。现在可以利用等式A来计算每一个样本颗粒的ζ电位：
等式J：
ξp Sample＝ξnet Sample+ξm
可以从样本和校准的电速度的比值计算每一个样本颗粒i的ζ电位(等式I)。通过平均在各个位置x处计算的对应的ζ电位数值给出每一个样本颗粒i的ζ电位。
等式K：
最大化来自数据的信息内容
所述方法的最简单实施例分析每一项阻滞上的预先定义的点(在前面的实例中是阻滞峰值量值dR max的40％到10％)。
在实际情况中，数据流既不是纯粹的也不是连续的。取决于包括纳米孔隙尺寸和形状、所施加的压力、电子装置的采样频率以及阻滞的信噪比在内的若干因素，每一项所分析的阻滞的特定节段将包含比其他节段更多的信息。
参照图1中的阻滞形状，从每一项阻滞中提取出的信息的准确性主要取决于以下各项的准确性：
1、识别阻滞最大值dR max(或者对应于替换的孔隙几何结构的显著数据特征——参见图2)
2、识别dR max的时间(t100或另一项显著数据特征——图2)
3、识别t40、t30、t20、t10(或者阻滞上的其他显著特征——图2)
非常快地行进的颗粒将在数据采样点之间移动较长距离。因此阻滞的峰值有可能将会落在采样点之间并且将不会被正确地识别，从而导致dR max和t100全部二者的数值中的误差。t100中的误差例如将在所计算的t90中生成较大百分比的误差，但是在t10中则将生成小得多的百分比的误差——因此阻滞的后端可以给出比峰值附近的区域质量更好的信息。
行进缓慢的颗粒将不会在数据采样点之间移动较长距离，因此所识别出的阻滞峰值dR max和时间t100可能相对准确。在这种情况下，由于阻滞峰值附近的更高(9倍)信噪比，在t90处可以获得比t10处更好的信息。当噪声占所测量的信号的高百分比时，所计算的到达指定阻滞高度所花费的时间(例如t10)变得较不准确。
可以通过若干方式改进信息质量，其中包括而不限于以下各项：
1、调节所施加的压力和电压，以便优化对应于每一个样本的阻滞轮廓。这可以通过向用户给出反馈以作出系统调节来实现，或者通过完全自动化的方式实现。经过优化的系统将以具有峰值区域附近的一定数目的样本点的阻滞为目标，但是即使是带电最少的颗粒也必须仍然在与校准颗粒相同的方向上行经孔隙。
2、即使当系统设定已被优化时，样本内的尺寸和表面电荷仍然会有变化，因此对提取自更快的并且更小的阻滞的信息进行优化仍然是至关重要的：
a、使用来自校准颗粒测量的阻滞的已知轮廓并且从阻滞的进一步向下的点进行外插，可以更加准确地计算峰值dR max和时间t100
b、在阻滞的后端使用类似的外插将减少噪声对所测量的电阻的影响。
3、通过计算整个阻滞上的定时误差和噪声误差，识别出每一项阻滞的将给出最优信息质量的节段。
4、例如通过以下步骤来实施信噪比改进：
a、修改系统电子装置以允许对于给定的孔隙尺寸施加更大的电压。
b、实施允许从噪声基底内提取出信号信息的算法。这样的算法在本领域内是众所周知的。
将所述方法应用于替换的几何结构
所述方法的原理可以被应用于具有任何几何结构的孔隙，这是通过识别出阻滞轮廓中的一项或更多项显著特征从而允许计算不同颗粒的相对速度。图2中的实例示出了具有不同轮廓的孔隙。
对于图2中的孔隙形状，存在可以被用来计算相对时间Tn的四项显著特征。举例来说，可以使用两个最大值之间的时间差：
等式M：
Tn＝Tc-Tb
实例1
该例示出了使用校准颗粒来建立vx P和vx e。对于校准颗粒的测量是在三个不同的所施加的电压下进行的：0.4V、0.5V和0.6V。其结果在图3和图4中示出。测量细节为如下：
纳米孔隙——Izon NP200
-羧化聚苯乙烯校准颗粒CPC200
-电解液——Izon三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris Buffer)0.1M KCl
-所施加的电压(V)：0.4V、0.5V和0.6V
-所施加的压力(Pap)：0mm H2O
-固有压力(Pin)：4.7mm H2O
-颗粒计数——在V＝0.4V下是369，在V＝0.5V下是619，在V＝0.6V下是596
在V＝0V下没有电力，因此(vx)tot＝(vx)c：
·(vx)c40＝2806s-1以及vx P 40＝(2806/4.7)＝597s-1
·(vx)c30＝1672s-1以及vx P 30＝(1672/4.7)＝356s-1
·(vx)c20＝1131s-1以及vx P 20＝(1131/4.7)＝241s-1
·(vx)c10＝626s-1以及vx P 10＝(626/4.7)＝84s-1
可以在任何所施加的电压下计算对应于校准颗粒的(vx)c，例如下面在所有三个电压下计算(vx)c40：
实例2
该例示范了在多个压力下测量样本。该例说明了以下事实，也就是可以在对于分析结果没有任何实质影响的情况下改变系统压力，正如可以在图5中看到的那样。测量细节如下：
-校准(和样本)颗粒——羧化聚苯乙烯“CPC200”
-纳米孔隙——Izon NP200
-电解液——Izon三羟甲基氨基甲烷缓冲液0.1M KCl
-所施加的电压(V)：0.8V
-所施加的压力(Pap)：0mm H2O到8mm H2O，步长为2mm(“P0”到“P8”)
-固有压力(Pin)：4.7mm H2O
-利用零施加压力对系统进行了校准
从图5可以看到，所测量的平均ζ电位不会随着所施加的压力发生显著改变。这一结果是针对在零施加压力下测量的校准颗粒使用vx P而获得的。随着所施加的压力增大，脉冲高度被略微截断，从而导致减小的平均直径数值。
实例3
该例示范了在多个偏置电压下测量样本。该例说明了以下事实，也就是可以在对于分析结果没有任何实质影响的情况下改变所施加的偏置，正如可以在图6中看到的那样。测量细节如下：
-校准(和样本)颗粒——羧化聚苯乙烯“CPC200”
-纳米孔隙——Izon“NP200”
-电解液——Izon三羟甲基氨基甲烷缓冲液0.1M KCl
-所施加的压力(Pap)：0mm H2O
-固有压力(Pin)：4.7mm H2O
-所施加的电压(V)：0.8V用于校准
-利用零施加压力对系统进行了校准
从图6可以看到，所测量的平均ζ电位不会随着所施加的电压发生显著改变。这一结果是针对在0.8V和零施加压力下测量的校准颗粒使用vx e而获得的。
实例4
该例示范了测量不同直径的带电和不带电颗粒。测量细节如下：
-校准颗粒——羧化聚苯乙烯，平均直径118nm
-纳米孔隙——Izon“NP100”
-电解液——PBS 0.25M
-所施加的压力(Pap)：0mm H2O校准
-固有压力(Pin)：4.7mm H2O
-所施加的电压(V)：0.66V——校准和样本
从图7可以看到，普通NIST可追踪聚苯乙烯颗粒(CPN100和CPN150)与羧化聚苯乙烯CPC70、Bangs 6569和CPC100颗粒可以被清楚地区分。
实例5
该例示范了在故意的表面修改之后测量颗粒ζ电位，以便示范对于特定表面目标的检测。该例示出了蛋白质(CD63)到被修改来结合CD63的脂质体的结合。图8示出了CD63的结合之前和之后的脂质体。在蛋白质结合之后观察到ζ电位朝向更大正值的偏移，这是符合预期的，因为蛋白质在实验条件中略微带正电。在图8中可以看到，蛋白质结合之前的脂质体形成与具有表面结合蛋白质的脂质体不同的一组。这说明了可以使用分析来检测样本中的特定目标。图8还示出了具有已知的负电荷的对照颗粒集合，其验证了所述结果。
实例6
该例示范了运行其中将校准颗粒(其具有已知的ζ电位)添加到样本流体的分析。图9示出了对于卵磷脂脂质体的测量，其中添加了校准颗粒以作为样本集合内的样本加标运行。所述两个尺寸类似的颗粒集合(脂质体和校准颗粒)可以基于其表面电荷被清楚地区分，并且可以把对应于校准颗粒的ζ电位结果(其在该电解液中具有已知的-20mV的平均ζ电位)作为基准来衡量数据的准确性。
总论
正如在本说明书中所阐述的那样，根据本发明的实施例，测量、确定、计算或者通过其他方式导出以及处理、绘制曲线图、存储或者通过其他方式使用一定数目的数值(比如压力、时间、电压、电流等等)。应当理解的是，在适当的情况下(不管是否具体提到)，在提到这样的“数值”时可以包括提到从中导出的数值。
虽然通过前面所阐述的优选实施例描述了本发明，但是应当理解的是，这些实施例仅仅是说明性的，并且权利要求书不限于这些实施例。根据本公开内容，本领域技术人员将能够作出被设想到落在所附权利要求书的范围内的修改和替换方案。在本说明书中所公开或说明的每一项特征可以被合并在本发明中，不管是被单独合并还是按照与这里所公开或说明的任何其他特征的任何适当组合被合并。
Claims (15)
1.一种确定至少一个测试颗粒的电荷的方法，特征在于，其包括：
在连接两个腔室的孔径上施加电流或电压的其中之一，从而使得所述腔室至少部分地填充有电解液，并且使得所述至少一个测试颗粒悬浮在至少其中一个腔室的电解液中；
测量表明孔径上的电流或电压当中的另一项的数值；
确定第一和第二时间点之间的时间间隔，第二时间点对应于所测量的电流或电压达到在第一时间点测量的电流或电压的特定比例时的时间点；以及
通过以下步骤确定所述至少一个测试颗粒的电荷：
确定表明具有已知电荷的至少一个校准颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到所述至少一个校准颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；
确定表明所述至少一个测试颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到所述至少一个测试颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；以及
利用表明测试颗粒和校准颗粒的电速度分量的所确定的数值来校准所述至少一个测试颗粒的电荷与所确定的时间间隔之间的量化关系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，确定表明所述至少一个校准颗粒的总速度的电速度分量的数值包括确定表明所述至少一个校准颗粒的总速度的数值以及表明所述至少一个校准颗粒的对流速度分量的数值，以及从表明总速度的数值中减去表明对流速度分量的数值。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，表明所述至少一个校准颗粒的电速度分量的数值和表明总速度的对流速度分量的数值是独立于彼此确定的。
4.根据权利要求2所述的方法，其还包括确定对应于所述至少一个校准颗粒的另一个时间间隔，其中所述另一个时间间隔是第三和第四时间点之间的时间间隔，第四时间点对应于所述至少一个校准颗粒的所测量的电流或电压达到在第三时间点测量的电流或电压的特定比例时的时间点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，确定表明所述至少一个校准颗粒的总速度的电速度分量的数值包括在多个所施加的电压下确定所述另一个时间间隔，以及，可选地，
还包括基于以下各项确定表明所述至少一个校准颗粒的电速度分量的数值：
不同的所施加的电压；以及
不同的所施加的电压下的不同的另一个时间间隔或者从中导出的数值。
6.根据权利要求5所述的方法，其还包括确定被拟合到所述另一个时间间隔的倒数与所施加的电压的关系曲线图的曲线的斜率，所述斜率表明对应于所述至少一个校准颗粒的每单位电压的电速度分量。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，确定表明所述至少一个校准颗粒的对流速度分量的数值包括在多个所施加的电压下测量所述另一个时间间隔；以及，可选地，
基于以下各项使用外插：
不同的所施加的电压；以及
不同的所施加的电压下的另一个时间间隔或者从中导出的数值；以及，可选地，
绘制所述另一个时间间隔的倒数与所施加的电压的关系的曲线图，并且把由所述曲线图定义的一条线外插到电压等于零的一点。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，确定表明所述至少一个校准颗粒的对流速度分量的数值包括在多个所施加的压力数值下测量所述另一个时间间隔，其中所施加的压力是外部施加到所述两个腔室当中的至少一个的压力，以便改变或者建立所述孔径上的压力差。
9.根据权利要求8所述的方法，其还包括：
基于不同的所施加的压力数值对于所述至少一个校准颗粒确定表明每单位压力的对流速度的数值；以及
基于表明每单位压力的对流速度的数值、所施加的压力以及固有压头确定表明所述至少一个校准颗粒的对流速度分量的数值，其中所述固有压头对于孔径上压力差有贡献，该压力差源于两个腔室中的电解液之间的高度差异；以及，可选地，
还包括：
绘制所述另一个时间间隔的倒数与所施加的压力的关系曲线图；
确定所述曲线图的斜率，所述斜率表明每单位压力的对流速度；以及
把所述表明对流速度分量的数值确定为每单位压力的对流速度与所施加的压力和固有压头的总和的乘积。
10.根据权利要求2所述的方法，其还包括通过以下步骤确定所述至少一个测试颗粒的电荷：
利用表明所述至少一个校准颗粒的总速度的数值和对应于所述至少一个测试颗粒的所确定的时间间隔来确定表明所述至少一个测试颗粒的总速度的数值；
把表明所述至少一个测试颗粒的对流速度分量的数值确定为每单位压力的对流速度与所施加的压力和固有压头的总和的乘积；
通过从表明所述至少一个测试颗粒的总速度的数值中减去表明所述至少一个测试颗粒的对流速度分量的数值，确定表明所述至少一个测试颗粒的电速度分量的数值；
利用表明所述至少一个校准颗粒的电速度分量的数值、表明所述至少一个测试颗粒的电速度分量的数值、所述孔径的ζ电位以及所述至少一个校准颗粒的ζ电位确定所述至少一个测试颗粒的ζ电位，其中所述至少一个校准颗粒的ζ电位是利用所述至少一个校准颗粒的已知电荷确定的；以及
利用所述至少一个测试颗粒的所确定的ζ电位来确定所述至少一个测试颗粒的电荷；以及，可选地，
还包括通过平均对于多个特定比例确定的多个ζ电位数值来确定所述至少一个测试颗粒的电荷。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述特定比例是基于相对于数据采样率的所述至少一个测试颗粒的平均总速度而设定的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中：
当所述至少一个测试颗粒的平均总速度大于预定阈值时，所述特定比例被设定到第一数值；并且
当所述至少一个测试颗粒的平均总速度小于预定阈值时，所述特定比例被设定到第二数值；
其中，第一数值小于第二数值。
13.根据 权利要求1所述 的方法，其中，所述至少一个测试颗粒和至少一个校准颗粒悬浮在相同的电解液中并且在相同的实验中被分析；或者，
其中，所述至少一个测试颗粒是生物颗粒，所述方法还包括在所述至少一个测试颗粒的测量之前和之后确定所述孔径的ζ电位。
14.一种用于确定至少一个测试颗粒的电荷的设备，特征在于，其包括：
第一腔室和第二腔室，其中第一和第二腔室通过孔径相连；
用于在孔径上施加电流或电压的组件；
当所述腔室至少部分地填充有电解液时并且当所述至少一个测试颗粒悬浮在至少其中一个腔室的电解液中时用于测量孔径上的电流和电压当中的另一项的组件；
用于确定第一和第二时间点之间的时间间隔的处理器，第二时间点对应于所测量的电流或电压达到在第一时间点测量的电流或电压的特定比例时的时间点；
所述处理器还被设置成确定表明具有已知电荷的至少一个校准颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到所述至少一个校准颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；
所述处理器还被设置成确定表明所述至少一个测试颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到所述至少一个测试颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；并且
所述处理器还被设置成确定所述至少一个测试颗粒的电荷，这是通过利用表明测试颗粒和校准颗粒的电速度分量的所确定的数值来校准所述至少一个测试颗粒的电荷与所确定的时间间隔之间的量化关系而实现的。
15.一种与设备一起使用的用于确定至少一个测试颗粒的电荷的计算机程序，特征在于，所述设备包括：
第一腔室和第二腔室，其中第一和第二腔室通过孔径相连；
用于在孔径上施加电流或电压的组件；
当所述腔室至少部分地填充有电解液时并且当所述至少一个测试颗粒悬浮在至少其中一个腔室的电解液中时用于测量孔径上的电流和电压当中的另一项的组件；
所述计算机程序包括用于使得处理器实施以下步骤的指令：
确定第一和第二时间点之间的时间间隔，第二时间点对应于所测量的电流或电压达到在第一时间点测量的电流或电压的特定比例时的时间点；以及
通过以下步骤确定所述至少一个测试颗粒的电荷：
确定表明具有已知电荷的至少一个校准颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到所述至少一个校准颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；
确定表明所述至少一个测试颗粒的总速度的电速度分量的数值，其中考虑到所述至少一个测试颗粒的总速度包括非零对流速度分量和电速度分量；以及
利用表明测试颗粒和校准颗粒的电速度分量的所确定的数值来校准所述至少一个测试颗粒的电荷与所确定的时间间隔之间的量化关系。
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