CN105705088A - 增强型疾病检测仪器及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包括增强疾病细胞和正常细胞微观性质的增强型疾病检测仪和方法，因此提高了检测灵敏度和特异性。

Description

增强型疾病检测仪器及方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的申请号为61/787,787的美国专利申请的优先权,该专利在此全部引用作为参考。

发明背景

当今医疗条件下，对于生物样本的低水平表达的疾病(无论是由于微弱的检测信号或是低浓度的疾病成分如癌症筛查中的肿瘤循环细胞(CTC))如癌症的诊断是一个很大的挑战。许多低死亡率的疾病如癌症和心脏疾病表达水平低(疾病成分含量低)，这使得检测更加困难。例如，对于晚期癌症患者，血液流中CTC的含量水平为十亿分之一，这使得检测极其困难。结果导致许多疾病，如癌症，不易早期诊断。

对于许多高发病率、高死亡率的重大疾病，包括癌症，早期准确准确诊断是非常困难的。目前的疾病诊断技术通常依赖于宏观数据和信息，如体温，血压，身体扫描图像。现在用于检测癌症等重大疾病的常用仪器大多是基于图像技术的设备，包括X-射线、CT扫描和核磁共振(NMR)成像技术。这些仪器在一定程度上对于疾病诊断是有帮助的，但是他们大多不能在发病早期(如癌症)提供准确的，完全安全的，并符合成本效益的诊断。此外，许多现有的诊断技术及相关设备是侵入性的，有时不容易获得，尤其是在偏远地区或农村地区。

即使最近涌现出了基于基因检测的新技术，它也通常依赖于单一的诊断技术不能对重大疾病进行全面的、可靠的、准确的、可信的、经济的检测。近年来，人们在将纳米技术应用于多种生物领域方面做了诸多努力，大量的工作集中在疾病检测领域中基因图谱及其微小变化。例如，Pantel等人讨论了利用微机电系统传感器(MEMS)在体外检测血液和骨髓内的癌细胞的方法(详见《自然评论》2008，8，329KlausPantel等人)；Kubena等人在美国专利6,922,118提到利用MEMS检测生物药剂；Weissman等人在美国专利6,330,885中涉及的利用MEMS传感器检测生物物质的增生。

然而，迄今为止，大部分上述的技术限于对个例的传感，使用相对结构简单、大尺寸且功能有限、缺乏灵敏度与特异性的系统。此外，一些使用纳米颗粒和生物方法的现有技术要求复杂的样品准备程序(如使用化学或生物标志物)，编译数据困难，过分依赖于诊断方法的视觉和色彩的变化(主观且分辨率有限)。这使它们不适合疾病的早期诊断，如癌症等严重疾病，尤其不适合在医院的常规筛查和定期的身体检查中使用。另一些技术则无法同时实现高敏感性与高特异性。

这些缺点需要全新的解决方法来克服，并带来更高的精度、灵敏度、特异性、效率、非侵入性、实用性、简单性，加速早期疾病检测，降低成本。

现有的检测技术及设备主要由以单一技术为基础的单一用途的设备决定，其疾病检测的覆盖范围与功能有限且效率低。这些技术往往是非常广泛的，体积庞大(如核磁共振、CT和X-射线设备)，主要包括三大类：(一)基于影像的中晚期癌症检测技术；(b)生物标志物技术，对特定的癌症类型具有一定的灵敏度(但对于给定的生物标志物，通常是对典型的一种或一个亚种的癌症具有灵敏度，且特异性水平相对较低)；(c)为基因技术为基础的检测技术，相对灵敏度较低，处理时间长。

由于影像技术仅能够在中晚期检测疾病，倚重于影像技术的方法和仪器不适合或不能够应用于早期疾病检测，尤其是癌症。

相比于影像技术，生物标志物可以在早期阶段检测某些特定的癌症。然而，这是一个复杂的检测技术和方法。由于特异性较低，很容易出现误报。此外，该技术应用于较小的检测范围和较少的癌症种类，因为通常一个给定的生物标志物，只对一类特定类型的肿瘤或亚型的肿瘤敏感。所以，该技术可能也不适用于常规的体检(如年度体检)中的癌症筛查。它也无法单独使用于癌症的检测，并可能需要额外的诊断工具来验证。

一些其他技术能够检测癌症的某些常规参数，但无法区分或识别(即，确定)具体的癌症类型。换句话说，即使这些技术可以提醒一个癌症疾病的存在，也无法确定癌症的类型，需要额外的使用其他检测技术来诊断。因此，这些技术无法独立的提供癌症的诊断方案。

现有的检测技术还存在许多问题，包括(a)仅能够检测中晚期癌症(特别是CT，X射线和核磁共振技术)，(B)检测成本高(PET-CT，CT，X射线和NMR)，(三)对大部分癌症和循环肿瘤细胞(CTCs)的检测灵敏度低，(D)某些检测手段特异性低(例如，基于生物标志物的技术)，(e)具有侵入性(如X射线和NMR)。特别是，没有任何有效的检测技术用于早期疾病筛查如癌症筛查，不仅限于检测早期癌症，而且还能够识别哪些类型的癌症。因为早期疾病筛查通常涉及处理低水平或很低水平的疾病表达，其中疾病成分具有低到非常低的浓度，因此需要较高的检测灵敏度和特异性，非常希望有一种新颖的，高效的，相对简单和低成本的分离方法，用于预处理被测样本以增强疾病成分，(例如，癌症检测，在检测之前，增加样品中CTC的浓度)，以增强的检测能力(如灵敏度)。

对于同时提供常规(早期癌症检测)和特定类型的癌症的检测是有需求的。上述的现有癌症检测技术的局限性显示了现有的方法与设备无法有效的同时检测生物样本的常规参数并确定癌症的特定种类。

为了克服上述问题，有时，有必要通过分离过程集中(提高)被测样本中的疾病成分的含量水平。然而，许多分离过程和技术复杂，价格昂贵，或分离效果不佳。到目前为止，还没有能够广泛应用于临床的分离方法，将十亿分之一的癌症疾病成分富集到容易用现有技术检测的水平。因此，迫切需要创新和开发一种可行的，简单的，高效的，低成本的分离方法用于样本富集方法，用于提高病人的样本中含量很低的疾病表达成分的浓度，以增强检测能力。

发明概述

一般而言，本发明提供了增强的敏感性和特异性的新颖的，相对简单的，有效的，廉价的方法来检测和识别疾病的方法(特别是在其早期阶段)。

特别的，本发明提供了生物样本疾病检测的方法，包括以下步骤：提供可能患病的组织或器官样本，该样本包含生物体的患病细胞和正常细胞。

可选的将样本放入某种溶剂中，增强潜在患病细胞与正常细胞微观性质的差异，

可选的分离样本中的潜在患病细胞与正常细胞，

可选的增加生物表达水平或富集潜在患病细胞实现分离；通过检测生物表达水平或潜在患病细胞浓度并将检测结果与未患病生物样本进行比较来确定患病概率。

在某些实施例中，所述的方法还包括向样本中加入添加剂，在处理样本前或处理样本过程中的任意步骤加入添加剂以增强疾病细胞和正常细胞微观性质的差异。

在某些实施例中，添加剂是在增强微观性质差异的过程中加入或是在分离疾病细胞和正常细胞(基于增强的微观性质的差异)的过程中加入。

合适的添加剂可以是，例如离子，氧化剂，还原剂，抑制剂，催化剂，酶，生物标志物，化学标志物，生物化学标志物，生物活性化合物，金属氧化物化合物，生物化学化合物，生物成分，有机成分，金属有机成分，生物化学成分，光学成分，荧光成分，蛋白质，病毒，染色剂，抗体或以上的组合。

合适的离子子包括但不限于Fe3+,Fe2+,Ag+,Cu2+,Cr3+,Na+,K+,Pt2+,Mg2+,H+,Ca2+,Hg2+,Al3+,NH4+,H3O+,Hg24+,Cl-,F-,Br-,O2-,CO32-,HCO3-,OH-,NO3-,PO43-,SO42-,CH3COO-,HCOO-,C2O42-,andCN-。

适合的氧化剂的实例包括但不限于氧，臭氧，过氧化氢，无机过氧化物，硝酸，硝酸盐化合物，铬化合物，高锰酸盐复合，硫酸，过硫酸，氟，氯，溴，碘，亚氯酸盐，氯酸盐，高氯酸盐，卤素化合物，次卤酸盐化合物，过硼酸钠，氧化亚氮，氧化银，四氧化锇，托伦斯试剂，2,2’-二吡啶二硫化物，尿素，硝酸银，硝酸铁，尿素氮，血尿素氮，高锰酸钾和它们的任意组合。

合适的卤素化合物包括但不限于，4-氯甲苯，二溴戊烷，溴乙烷，2-氯丙烷，氟代环己烷，或2-碘-2-甲基戊烷；次卤酸盐化合物包括次碘酸，次溴酸盐，次氯酸盐，和次氟酸。

适合的还原剂包括但不限于游离态氢，含Fe2+的化合物(如，硫酸亚铁)，钠汞，硼氢化钠，亚硫酸化合物，水合肼，含有锡离子的化合物，锌汞齐，氢化铝锂，林德拉催化剂，甲酸，草酸，抗坏血酸，亚磷酸盐，次磷酸盐，和亚磷酸或它们的组合。

适合的生物活性化合物包括但不限于葡萄糖，果糖，丙酮酸盐，半乳糖，氨基酸，乙酸，二羟乙酸，草酸，丙酸，乙酸或酶

适合的酶包括但不限于氧化还原酶(脱氢酶，荧光素酶，DMSO还原酶)，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，连接酶，RNA的酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，己糖激酶(例如，丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)，氨酰tRNA合成酶，核糖体，人造酶以及各自的辅助因子结合物。

该方法的另外一些实施例中，在样本处理前加入第一添加剂以增强疾病细胞和正常细胞微观性质的差异，第二添加剂于处理样本的任意步骤中加入。第一添加剂和第二添加剂可以是相同或不同的。

某些实施例中，疾病细胞和正常细胞的分离步骤包括使样本经过一个过多个过滤器。

在某些实施例中，一个或多个过滤器根据以下性质将疾病细胞和正常细胞分离。这些性质包括电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

微观性质的实例包括但不限于电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

例如，电学性质包括但不限于表面电荷，表面电位，静息电位，电流，电场分布，电偶极子，电四极子，三维电气或电荷云分布，染色体DNA端粒电性质，电容或阻抗；热学性质是指温度或振动频率；光学性质包括但不限于光吸收，光传输，光的反射，光电性质，亮度，或荧光发射；化学性质包括但不限于pH值，化学反应，生物化学反应，生物电化学反应，反应速度，反应能量，反应速率，氧气浓度，氧气消耗率，离子强度，催化行为，触发增强信号响应的化学添加剂，生物化学添加剂，生物添加剂，提高检测灵敏度的化学物质，生物化学物质及生物添加剂或键合强度；物理性质包括但不限于密度，形状，体积，或表面积；生物性质包括但不限于表面形状，表面积，表面电荷，表面生物学性质，表面化学性质，pH值，电解质，离子强度，电阻率，细胞浓度，生物标志物相关性质，或溶液的生物学，电学，物理学或化学性质；声学性质包括但不限于频率，声波的速度，频谱分布，声强，声学吸收，或声共振；机械性质包括但不限于内部压力，硬度，流速，粘度，剪切强度，拉伸强度，断裂应力，粘附性，机械共振频率，弹性，塑性，或可压缩性。

在某些实施例中，该方法还包括在处理样本前或处理样本任一步骤中向样本施加外部压力或能量以增强疾病细胞和正常细胞在微观性质上的差异，施加的外部压力或能量导致疾病细胞和正常细胞微观性质上的差异得到增强。

合适的外部压力或能量包括但不限于，物理学，化学、生物学、热学、光学、声学、电学、磁学、电磁学、电机械学、电化学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电化学机械学、电光学、电化学光学力或能量。

微观性质包括但不限于电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

在某些实施中电学性质包括表面电荷，表面电位，静息电位，电流，电场分布，电偶极子，电四极子，三维电气或电荷云分布，染色体DNA端粒电性质，电容或阻抗；热学性质包括温度或振动频率；光学性质包括但不限于光吸收，光传输，光的反射，光电性质，亮度，或荧光发射；化学性质包括pH值，化学反应，生物化学反应，生物电化学反应，反应速度，反应能量，反应速率，氧气浓度，氧气消耗率，离子强度，催化行为，触发增强信号响应的化学添加剂，生物化学添加剂，生物添加剂，提高检测灵敏度的化学物质，生物化学物质及生物添加剂或键合强度；物理性质包括密度，形状，体积，或表面积；生物性质包括但不限于表面形状，表面积，表面电荷，表面生物学性质，表面化学性质，pH值，电解质，离子强度，电阻率，细胞浓度，生物标志物相关性质，或溶液的生物学，电学，物理学或化学性质；声学性质包括频率，声波的速度，频谱分布，声强，声学吸收，或声共振；机械性质包括内部压力，硬度，流速，粘度，剪切强度，拉伸强度，断裂应力，粘附性，机械共振频率，弹性，塑性，或可压缩性。

在某些实施例中，本发明涉及的方法不仅能够通过区分正常生物物质和疾病生物物质来检测生物样本是否患病，而且还能获取疾病的类型信息从而区分不同的疾病类型。

能够通过本发明涉及的方法以增强的灵敏度和特性检测的疾病包括但不限于癌症和心脏病。例如，癌症包括膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，白血病，肺癌(包括支气管)，黑色素癌，非Hodgkin淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，或甲状腺癌。

在某些实施例中，不同疾病类型的差异性部分取决于检测单元的几何形状或生物样本；不同疾病类型的差异性部分取决于检测单元的几何形状，探测信号，探测信号的变化或生物样本；或者，不同疾病类型的差异性部分取决于检测单元的几何形状，探测信号，探测信号的变化和生物样本的变化。

在某些实施例中，不同疾病类型的差异性部分取决于细胞表面的性质，细胞膜的性质，氧含量，氧位置，氧键合强度，电荷密度，电荷分布，或生物样本电荷的动态性质。细胞表面或细胞的膜性质的例子包括但不限于生物样本的表面吸收和吸附能力，氧浓度，在细胞表面或膜的氧键合强度，离子浓度，离子浓度梯度，细胞膜静息电位，细胞表面电荷，细胞膜的渗透性和输运能力。

本发明涉及一类新型的、集成的微型器件，这类器件能够在微观水平执行增强疾病检测，能够在体内或体外，利用单个细胞上或单个生物分子(如DNA,RNA或蛋白质)，单个生物体(如单个病毒)，或其他足够小的单元或者基本生物成分进行检测。这类微器件可以通过使用先进的微型器件制造技术和新的工艺流程如集成电路制造技术来制造。本文所用的术语“疾病检测装置”可以与如下术语互换：疾病检测器件，集成了微型器件的检测仪或者其他含义相同或相近的术语。本发明中的微型器件包括多个微型单元以执行不同功能，选择性的检测待测或待分析生物样本的多个参数。检测仪的可选部件至少包括进行寻址，控制，驱动，接收，放大，操纵，处理，分析，判定(如，逻辑判定)，或存储来自每个探针的信息。这意味着该器件可以是，例如，包括了控制电路、寻址单元、放大电路、逻辑处理电路、模拟器件、记忆单元、特定应用的芯片、信号发生器、信号接收器或传感器的中央控制单元。

这些疾病检测微型器件能够检测早期疾病，具有更高的灵敏度特异性，速度快，简单，实用，方便(如简单的操作程序或更小的装置尺寸)，经济(如更低的成本)，无侵入性，显著降低的副作用。因此，本发明的微型器件个比常规疾病的检测设备或技术更加先进。

本发明所涉及的方法可以通过以下专利所述的微器件来实现，US61/672,231,US61/749,661,PCT/US2011/054979,PCT/US2012/022921,PCT/US2012/036551,PCT/US2012/049287,PCT/US2011/042637,PCT/US2011/024672,US61/608,363,这些专利的内容在此全部引用。

因此，本发明还提供了一种生物样本疾病检测仪。该检测仪包括待测样本输运系统，与生物样本发生反应的添加剂注入器件和生物样本的探测检测器件，所述的生物样本包括正常细胞和可能患病的细胞，正常细胞和可能患病的细胞分布在至少同一微观性质水平，与之作用的添加剂将差异性至少增强一个微观量级。合适的添加剂包括离子，氧化剂，还原剂，抑制剂，催化剂，酶，生物标志物，化学标志物，生物化学标志物，生物活性化合物，金属氧化物化合物，生物化学化合物，生物成分，有机成分，金属有机成分，生物化学成分，光学成分，荧光成分，蛋白质，病毒，染色剂，抗体或以上的组合。

用于本发明中微型器件制造的技术或工艺的例子包括但不限于机械学、化学、物理化学、化学机械学、电学、物理学、生物化学、生物物理学、生物物理机械学、电化学、生物电机械学、电机械学、电光学、生物电光学、生物热光学、电化学光学、生物电学机械学、微电机械学、电化学机械学、电生物化学机械学、纳米制造技术，集成电路和半导体制造技术与工艺。一些使用的制造技术可参见如R.Zaouk等人的《微细加工技术简介》(S.Minteer,ed.),2006,Humana出版社；《片上实验室之微细加工》,第一版.(Geschke,Klank&Telleman,eds.),JohnWiley&Sons,2004。微型器件的功能将至少包括用于疾病检测的传感、检测、测量、诊断、监测和分析。多个微型器件可以整合于一个检测仪，使检测仪更先进和复杂，能够进一步加强检测灵敏度，特异性，速度和功能，具有检测同一参数或一组不同参数的能力。

所述的“添加剂”包括离子，氧化剂，还原剂，抑制剂，催化剂，酶，生物标志物，化学标志物，生物化学标志物，生物活性化合物，金属氧化物化合物，生物化学化合物，生物成分，有机成分，金属有机成分，生物化学成分，光学成分，荧光成分，蛋白质，病毒，染色剂，抗体或以上的组合。

本文所使用的术语“或”，是指既包括“与”和“或”。换句话说它可以互换。

在某些实施例中生物样本是DNA，DNA粒端，RNA，染色体，细胞，细胞亚结构，蛋白，组织，病毒，血液，尿液，汗液，泪液，唾液，或器官组织。

在某些实施例中，液体溶液是水溶液或有机溶剂的溶液。

在某些实施例中，疾病是癌症。

在某些实施例中，癌症是膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，白血病，肺癌(包括支气管)，黑色素瘤，非Hodgkin巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，甲状腺癌。

在某些实施例中，添加剂以液体溶液，固体纳米颗粒或气体形式存在。

在某些实施例中，液体溶液可以是水溶液或有机溶液包括适合的生物活性化合物包括高锰酸钾，葡萄糖或葡萄糖化合物，磷酸氢盐，丙酮酸，丙酮酸钠，溴化丙酮酸，溴丙酮酸，乙酸，丙醛，甘油醛，甲基乙二醛，乳酸脱氢酶，丙氨酸，乳酸，氨基酸，蛋白质，钙，钾，硫，钠，镁，铜，锌，硒，钼，氟，氯，碘，锰，钴，铁，或酶。合适的酶的实例包括己糖激酶(脱氢酶，荧光素酶，DMSO还原酶)，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，连接酶，RNA的酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，己糖激酶(例如，丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)，氨酰tRNA合成酶，核糖体，人造酶以及各自的辅助因子结合物。

在某些实施例中，气体或液体溶液包括氧气，臭氧，一氧化碳，二氧化碳，钙，钠，钾，硫，钠，镁，铜，锌，硒，钼，氟，氯，碘，锰，钴，铁，或碳基的有机基团包括但不限于有机金属化合物，醛(酮羰基)，酮(羰基)，羧酸(羧基)，胺(氨基)，氨基酸(氨基和羧基)和酒精(羟基)。

在某些实施例中，本发明中涉及的方法还包括在测试前，将待测生物样本与添加剂混合以增强检测的灵敏度和/或特异性。

在某些实施例中，本发明涉及的方法还包括在测试过程中，将待测生物样本与添加剂混合以增强检测的灵敏度和/或特异性。这个过程中，可获得添加剂与生物样本相互作用的动态信息。

在某些实施例中，本发明涉及的方法还包括将待测生物样本与至少两种添加剂混合，可以混合在一起或者分开混合，可以在检测前，检测中，或检测前与检测中分别混合。

在某些实施例中，添加剂包括化学添加剂，生物化学添加剂，生物添加剂，固体颗粒，或具有大表面积的纳米颗粒。

在某些实施例中，将待测生物样本与添加剂混合，将产生生物样本与添加剂之间，或生物样本、溶液中其他成分与添加剂之间的一个或多个反应。反应包括氧化，还原，催化，化学，生物学，生物化学，生物物理学，生物力学，生物光学，生物电学，电光学，生物热学，生物电光学，生物电力学，发热反应，或连锁反应。

在某些情况下，反应是连锁反应或引起连锁反应，反应中的检测信号(特别是微弱的信号)可以被放大，从而提高检测的灵敏度和特异性，例如对疾病如一种或多种癌症，或用于区分不同类型的疾病。

在某些情况下，反应会增强对待测生物样本中氧含量水平检测的灵敏度。

本发明涉及的方法中，至少需要两种添加剂可同时或不同时(以相同或不同的时间间隔)加入待测生物样本中。

如第一个例子，添加剂可以如下顺序添加：先向含有生物样本的液体溶液中添加氧化剂；选择性的添加催化剂；选择性的添加生物化学添加剂；选择性的添加抑制剂；选择性的添加生物标志物；选择性的添加化学试剂；选择性的添加酶；选择性的添加还原剂。

如第二个例子，添加剂或添加剂按如下顺序添加：先向含有生物样本的液体溶液中添加催化剂；选择性的添加氧化剂，选择性的添加生物化学添加剂；选择性的添加抑制剂；选择性的添加生物标志物；选择性的添加化学试剂；选择性的添加酶；选择性的添加还原剂。

如第三个例子，添加剂或添加剂按如下顺序添加：先向含有生物样本的液体溶液中添加生物化学添加剂；选择性的添加催化剂；选择性的添加还原剂；选择性的添加抑制剂；选择性的添加生物标志物；选择性的添加化学试剂；选择性的添加酶；选择性的添加氧化剂。

第四个例子，按如下顺序加入添加剂或添加剂：首先向含有生物样本的溶液中添加还原剂；任选地加入催化剂、生化添加剂；任选地加入抑制剂、生物标志物；任选地加入一种化学物质；任选地加入一种酶；或任选地加入一种氧化剂。

第五个例子，按如下顺序加入添加剂或添加剂：向纳米粒子分散系中加入添加剂，该添加剂选自如下物质，包括氧化剂、还原剂、抑制剂、催化剂、酶、蛋白质、病毒、着色剂、生物标志物、化学标志物、有机化合物、有机金属化合物、抗体、生化标志物、化学物质、生物化学物质、生物物质、热学材料和光学材料，其包含荧光材料；使分散系充分混合；任选设定分散系的温度和作用时间；并将上述纳米粒子分散系加入含有生物样本的液体中。

第六个例子，按如下顺序加入添加剂或添加剂：向纳米粒子分散系中加入添加剂，该添加剂选自如下物质，包括氧化剂、还原剂、抑制剂、催化剂、酶、蛋白质、病毒、着色剂、生物标志物、化学标志物、有机化合物、有机金属化合物、抗体、生化标志物、化学物质、生物化学物质、生物物质、热学材料和光学材料，其包含荧光材料；使分散系充分混合；任选设定分散系的温度和作用时间；并将含有生物样本的液体加入到上述纳米粒子分散系中。

本发明涉及的某些实施例中，添加剂包括氧化剂、还原剂、抑制剂、催化剂、酶、蛋白质、病毒、着色剂、生物标志物、化学标志物、有机化合物，有机金属化合物、抗体、生化标志物、化学物质、生化物质、生物物质、热敏材料和光敏材料，其中包含荧光材料。该催化剂的实例包括酶、离子、生物成分、化学成分或它们的组合，从而加快反应的进行。

在某些实施例中，在将生物样本引入微器件检测之前，将添加剂预先加入到生物样本中。

在某些其它实施例中，在检测之前通过单独的入口将添加剂加入到微器件并与生物样本混合。

在某些实施例中，添加剂在检测的同时通过单独的入口加入到微器件并与生物样品混合。

在某些实施例中，生物样本与一种或多种添加剂混合后，利用微器件检测生物样本的电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

本发明涉及的方法不但能够通过区分正常样本和患病样本检测生物样本的疾病，还能根据得到的疾病类型信息区分疾病类型(如癌症)。对不同类型的疾病区分，部分地基于所述检测单元的几何形状，探测信号，探测信号的变化，生物样品，细胞表面上的特性，细胞膜性能，氧含量，氧位置，氧键合强度，电荷密度，电荷的位置，或生物样本的动态属性。在细胞表面或细胞的膜性质的例子包括生物样本的表面吸收和吸附能力，氧浓度，氧位置，在细胞表面或膜的氧键合强度，离子浓度，离子浓度梯度，膜静息电位，细胞表面电荷，膜的渗透性和输运能力。上面所述的属性可以是静态的或动态的。

在某些实施例中，添加剂包括氧化剂、酶、还原剂、酶抑制剂、生物标志物、生物化学物质、化学物质、生物物质、蛋白质、病毒、热敏材料、光敏材料、荧光材料，或催化剂，在检测之前的不同时间将所述的添加剂加入到生物样本中。

在某些实施例中，添加剂或添加剂至少包括一种具有生物活性的化合物(例如，一种具有生物结合能力的蛋白质)。

在某些实施例中，至少有两种添加剂或添加剂的混合物在检测之前加入被测生物样本中。

在某些实施例中，生物样本和添加剂的复合物在检测之前是被检测单元分离开的。

本发明涉及的方法，使用添加剂后的检测灵敏度和特异性要比不使用添加剂更高一些。

图表简述

图1示出了本发明用于检测疾病的一种仪器，以及该仪器的系统控制器的框图。

图2示出了本发明所述的仪器内部包含微毛细管的例子

图3示出了本发明所述的仪器包括毛细管的另一个例子，可选的带有探测和检测单元。

图4示出了本发明所述的用于检测疾病的另一种仪器的框图并展示了添加剂如何提高生物样本的微观性质。

图5示出了添加剂如何增强生物样本的微观特性检测的。

发明详述

一方面，本发明提供用于在微观水平检测生物样本某种特性的微器件，生物样本置于液体中或以液体的形式存在，微器件包含供生物样本注入的入口，可选的包括预处理单元，探测单元，检测单元，系统控制器，和供生物样本残余废物或废弃物排出的出口。

探测单元和检测单元的制造方法见本发明的发明者先前的专利，WO2011/103041和WO2011/005720，这些专利的内容在此全部引用。

图1示出了利用本发明所述的微器件检测液体或溶液微观特性的例子(例如，食品、饮料、油、化学品、药物、血液、尿液、汗液、唾液或其它生物液体)。图1(a)示出了一个至少包含样品入口、出口、预处理单元、探测器件、检测器件和系统控制器的微器件。图1(b)示出了系统控制器的框图。在该系统中，系统控制器通过放大器和转换器收集检测信号。然后由计算机进行处理和分析。经过分析的结果传输至记录器或显示设备上。探测信号需要操作者手动初始化。然后通过计算机，转换器处理，由信号发生器产生，然后施加于被测物体。

在某一实施例中，微器件包括用于富集疾病样本(例如循环肿瘤细胞CTC)的预处理单元，一个用于添加剂进入的入口，用于注入生物样本的单通道，用于注入生物样本的多通道，用于释放干扰信号的探测单元，用于发送响应信号的检测单元和用于生物样本流出的出口。生物样本富集单元包括一级或多级(包括过虑，电泳，生物标记，离心或光学处理)用于富集疾病病样品。检测单元至少包括一个高灵敏度的检测器集成于通道内部侧壁用于信号检测。

本发明所述的每个微器件还包括一个毛细管，该毛细管两端开口，包括具有内表面和外表面侧壁，其中所述两个开口中的一个是微器件的入口，另一个是微器件的出口。如图2(a)所示，0210是毛细管，至少包含一个入口(0212)和一个出口(0213)。图2(b)是在毛细管的透视图。图2(c)是该管的横截面图。横截面可以是圆形，椭圆形，正方形，长方形，三角形，或多边形形状。如图2(d)中，0220是带有核心0221的毛细管，通道定义在外侧壁和核心之间。图2(e)是在毛细管的透视图，图2(f)是垂直的(剖面)图。

该毛细管包括一个或多个针孔，每个针孔贯穿毛细管侧壁的内表面和外表面，安放探测单元或检测单元。如图3(a)中，0320是毛细管，至少带有一个入口(0322)和一个出口(0323)。图3(b)是在毛细管的透视图。如图3(c)中，0324是一个穿透毛细管侧壁0320的针孔。图3(d)是立体图。该针孔可通过机械，电学，磁学，电磁学，放射学，离子，热学，光学，声学，化学，电机械学，电化学，电化学机械学方法，或它们的组合方法来实现。

毛细管可选择做成透明的。用来制作毛细管较好的透明材料包括玻璃，SiO2和有机高分子材料。毛细管的内径范围，从10微米到10毫米。

如在图3(e)所示，探测单元(0325)和检测单元(0306)贯穿毛细管的侧壁。探测单元和检测单元是能够发送的探测信号，并在微观水平检测被测生物样本的电学，磁学，电磁学，热学，光学，声学，生物学，化学，电机械学，电化学，电化学机械学，生物化学，生物机械学，生物电机械学，电生化学，生物电化学机械学，机械或物理学性质。探测单元也能产生电学，磁学，电磁学，放射学，离子，热学，光学，声学，生物学，化学，电机械学，电化学，电化学机械学，生物化学，生物机械学，生物电机械学，电生化学，生物电化学机械学，机械或物理学信号。

图3(g)为检验管实施例，图3(H)是该实施例的透视图。当待测样品通过毛细管时，探测0325释放一个脉冲干扰信号激励样本，然后相关的参数，被0326探测和收集。该干扰脉冲信号包括电学，磁学，电磁学，热学，光学，声学，生物学，化学，电机械学，电化学，电化学机械学，生物化学，生物机械学，生物电机械学，电生化学，生物电化学机械学，机械或物理学信号或它们的组合。探测传感器收集电学，磁学，电磁学，放射学，电离学，热学，光学，声学，生物学，化学，电机械学，电化学，电化学机械学，生物化学，生物机械学，生物电机械学，电生化学，生物电化学机械学，机械或物理学信号，或它们的组合信号。

图3(i)和3(j)为另外一组实施例，其中毛细管包括多个探测单元和多个检测单元(如0325,03261,03262,03263；03251,03261,03252,03262)。

尽管在此特别列举了毛细管的实施例，包含多种形状通道的微器件也适用于本发明。此类微器件发明者已在先前的专利中进行了详细的描述。见专利WO2012/003348A2，WO2012/048040，US2010/0256518A1，WO2012/036697A1，WO2011/103041A1,和WO2011/005720，所有这些专利在此全部引用。

图4(a)示出了本发明所述的微器件至少包括一个样品入口，样品出口，添加剂入口，预处理单元，探测器件，检测器件和系统控制器。某一实施例中，添加剂的入口可以设置在流程的起始端。例如，它可以位于所述预处理单元的开头部分。在另一种设置，在一个机器中多个添加剂入口设置在不同的位置，包括置于预处理单元和检测单元的位置。

如图4(b)中，添加剂0422可以通过添加剂入口引入到检测单元。添加剂0422的目的是为了检测信号进而增强生物样本0421的检测灵敏度。在某个实施例中，添加剂0422具有比生物样本0421更高的检测信号。在另一个实施例中，如图4(c)所示，添加剂0422可与生物样本0421起反应以形成聚合物，这样能获得更强的检测信号。

图4(d)和4(e)展示了另一个实施例，其中所述添加剂0422可优先与一种或多种类型的生物样本反应或被一种或多种类型的生物样本吸收(在例0422为生物样本)，从而选择性地增强一种或多种类型的生物样本的信号。例如，基于所述生物样本或添加剂的一种或多种特性(如化学特性，表面特性如化学或物理特性)，添加剂能够比其它样品更容易和一种或多种生物样本反应或被一种或多种生物样本所吸收。因此选择性地增强了一种或多种类型生物样本的检测灵敏度。举个例子，特定的添加剂会更容易与癌细胞发生反应或吸附，结果使信号增强或区分度增强。

本发明的目的还在于解决现有检测技术的问题和达到癌症早期筛查的目的，同时还能够以较高的灵敏度和特异性识别具体类型的癌症如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌和直肠癌癌，子宫内膜癌，肾癌，白血病，肺癌(包括支气管)，黑色素癌，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，甲状腺癌。

能够达到上述目标的关键在于新颖的检测靶向添加剂，这种新颖的非显而易见的添加剂在成分、功能和性能上明显不同于传统生物标志物。与传统生物标志物只敏感于一种类型的检测目标或癌症(或癌症的子类，例如肺癌)不同，检测靶向添加剂技术能够进行通用的早期癌症筛查，而且能够确定是否有癌和具体哪种癌。在其组成方面，本发明中使用的添加剂不同于传统的生物标志物，因为它们包含了一组非显而易见的，新颖的以及更多样化的生化，化学，生物，生物物理成分。在功能方面，与传统的生物标志物特异性低(假阳性率高)缺乏检测多种类型癌症的能力相比(因此不适合一般性癌症筛查和早期癌症筛查)，本发明中使用的添加剂能够以高灵敏和高特异性检测癌症，同时能够检测多种类型的癌症信号。此外，本发明所述的微器件和检测方法，通过利用添加剂，可以将多种成分和多个反应途径结合起来，包括生物标志物，被测样品，生物化学品(葡萄糖，丙酮酸羧酸，溴丙酮酸，磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，丙酮酸激酶，丙酮酸羧化酶，PEP羧激酶，丙氨酸，三磷酸腺苷，乙酰辅酶，草酰乙酸盐，乳酸盐，乙醇，乙醛，和脂肪酸)，化学品(离子，催化剂，氧化剂，酸性酸，乙酸，柠檬酸，酒石酸，致癌物质和有机组分)，生物成分(蛋白质，酶，病毒，细胞，线粒体和功率单元)以及聚合物。由于添加剂包含新颖的多样的成分，故引入了多种反应机制用来检测癌症及其类型，这些反应机制包括但不限于化学反应(氧化反应，还原反应，放热反应和催化反应)，表面化学反应，表面生化反应，表面物理反应，表面物理化学反应，表面生物物理反应，表面吸附和表面吸收，生物化学反应和生物物理反应。在性能方面，本发明所述的添加剂，检测方法以及微器件优于传统生物标志物的方法，已经克服了的生物标志物的局限性，包括传统标志方法无法同时实现较高的检测敏感性和特异性，无法检测多种类型癌症(利用一种给定标志物)，因此无力用于一般用途的癌症筛查，误诊率高(当灵敏度高时)，而且程序复杂。

相对于传统的生物标志物(纯生物物质)，本发明所述的新颖的检测靶向添加剂的成分包括，化学成分，生物化学成分和生物成分，包括但不限于下列离子(例如，Fe3+,Fe2+,Ag+,Cu2+,Cr3+,Na+,K+,Pt2+,Mg2+,H+,Ca2+,Hg2+,Al3+,NH4+,H3O+,Hg24+,Cl-,F-,Br-,O2-,CO32-,HCO3-,OH-,NO3-,PO43-,SO42-,CH3COO-,HCOO-,C2O42-和CN-)，氧化剂(例如，O2,O3,H2O2，其它无机氧化物，F2,Cl2,HNO3，硝酸化合物，包括硝酸铁和硝酸银，H2SO4,H2SO5,H2SO8，其它的过硫酸，亚氯酸盐，氯酸盐，高氯酸盐，以及其他类似的卤素化合物，次氯酸盐，以及其他的次卤酸盐的化合物，次氯酸钠，六价铬化合物，高锰酸盐化合物，过硼酸钠，一氧化二氮，氧化银，四氧化锇，Tollen试剂，2,2'-二吡啶基二硫化物(DPS)，和漂白剂)，催化剂，氢氧化钠，氢氧化钾，CO2和CO。新颖的检测靶向添加剂的作用是检测生物样本是否患癌及患何种癌，能够以高灵敏度和特异性进行癌症早期检测(对非癌以及特定成分的癌症)。由于新的检测靶向添加剂不是纯粹生物成分，它避免了传统生物标志物遇到的大问题。相反，它可以同时用于通用癌症筛查中低水平信号的检测，也可以通过灵敏地区分不同类型的癌症来诊断患哪种癌(比较检测信号与已知癌症的特征信号)。

在某个实施例中，本发明公开的检测靶向添加剂可以增强癌症检测参数的检测灵敏度。在某个实施例中，本发明公开的检测靶向添加剂能可以和生物标志物联合使用。在某个实施例中，本发明公开的检测靶向添加剂至少可以与一种氧化剂联合使用进行癌症检测。在另一实施例中，检测靶向生物添加剂可以加入到被测样本中并混合，然后将混合物离心分离出吸附有检测靶向生物添加剂的生物样本，最后检测分离的样本。在一般的应用中，本发明公开的新的检测方法需要检测靶向生物添加剂，氧化剂，被测样本，生物标志物，化学成分，生物成分，生物化学成分。

本发明公开的检测靶向添加剂的作用之一是有选择地吸附于患癌样本(如癌细胞)。另一个作用是选择性地吸附附于非患癌样本。另一个作用是和样本或样本的特定组分发生反应(包括化学的，生物学的，电学的，物理的，热学的，机械学的，表面化学的，表面生物学的，表面物理学的，表面生物化学的，生物化学的，生物热学的，生物物理学的，生物电学和生物电化学的反应)。然而，这种检测靶向添加剂的另一个重要作用是通过与被测生物样本反应在微观水平检测生物样本的氧含量水平(例如细胞或蛋白质)。这样的反应可以是电学的，磁学的，电磁学的，热学的，光学的，声学的，生物学的，化学的，电机械学的，电化学的，电化学机械学的，生化学的，生物机械学的，生物电学机械学的，生物电化学的，生物电化学机械学的，物理学的或机械学的或催化学的。除了以上所述，在一般的意义上，检测靶向添加剂的作用在于它和生物样本反应探测被测生物样本提取信息(这类信息包括电学的，磁学的，电磁学的，热学的，光学的，声学的，生物学的，化学的，机电学的，电气化学的，电化学机械学的，生化学的，生物机械学的，生物电机械学的，生物电化学的，生物电化学机械学的，物理学或机械学的信息)以增强检测灵敏度和特异性(以区分正常和患病样本，以及不同类型的癌症)。

在某个实施例中，本发明公开的方法涉及的检测靶向添加剂吸附加癌细胞，由于癌症类型的不同，不同类型的癌细胞吸附检测靶向添加剂的程度不同，通过对检测靶向添加剂吸附癌细胞水平的观察和分类来区分癌症的类型及其子类，通过癌细胞的数量和浓度进一步确定癌症的发展程度即分期。

在另一个实施例中，检测靶向添加剂可以通过多种途径和生物样本发生反应，包括但不限于简单的化学反应，简单的生物反应，简单的生化反应，氧化反应，还原反应。还包括催化反应，复杂的生物反应和生化反应。在另一实施例中，检测靶向添加剂可以与检测系统中(例如检测仪或检测腔体内)的某种或某几种成分先发生反应(例如，生物标志物，离子，氧化剂，蛋白，或一种催化剂)，然后对生物样本做出区分和检测。

另一个重要的实施例，本发明公开的新颖的检测靶向添加剂能够和生物样本，如细胞，发生反应并探测生物样本的氧含量以获得宏观或微观信息。所获得的氧含量信息和生物样本是否患癌相关，因为癌细胞常常具有较低的平均氧含量，而正常细胞具有较高的氧含量。另一实施，离子和催化剂可以与生物样本中的氧发生反应，触发检测的响应(例如，放出气体，热量变化，电荷再分布，等等)。与催化反应中，少量催化剂即可使信号大大增强。在另一实施例中，特定的检测靶向添加剂可以在生物样本(如细胞)的特定位置发生反应并优先地吸附于特定位置，这种生物样本的一个或多个参数会产生差异信号(在正常样本和癌症样本之间)。的私人地点反应优先吸附(或吸收)，导致分化(与癌性实体和实体普通)的信号当一个或多个参数的测量基于这样的生物实体。例如，当铁离子被选择性吸附(或吸收)到一个生物样本(如细胞)，它将改变局部电场和电荷分布。它可能优先与生物样本的某些成分发生反应，并产生差异化的信号。换句话说，检测靶向添加剂可与癌细胞和正常细胞发生不同的反应(或不同的吸收与吸附)，这样便增强了检测灵敏度和特异性，产生差异化信号。

癌症检测的另一个例子中，新颖的检测靶向添加剂用于检测细胞中线粒体的呼吸作用及氧含量，包括生物样本的丙酮酸，因为丙酮酸是在生物化学的重要化合物，并且它是一个关键的代谢途径。当氧不足时，丙酮酸会发生厌氧分解同时葡萄糖通过非氧化分解产生能量，由此产生癌症。在健康的细胞中，氧是充足的，能量来自于丙酮酸的氧化分解。

利用本发明公开的方法涉及的检测靶向添加剂，可以更好地探测生物样本的微观特性及其标志特性，用以确定生物样品的类型(例如，细胞类型及癌症类型)。

众多实施例中，新型检测靶向添加剂添加于被测生物样本中在一定程序上选择性的和生物样本的至少一种特定成分发生反应(包括但不仅限于和生物样本特定成分的吸附，化学反应，生物反应或生化反应)。接着，向被测生物样本施加交变的力或场，其中包括但不限于声波，光波，热波，电流，电磁波。在交变力或场作用下的响应信号被记录下来。这样的记录数据与由检测靶向添加剂标记的生物成分(如癌细胞)有关。

氧含量的检测，检测硬件，检测过程，用于癌症检测的添加剂是本发明的一个重要的创新特征。由于在微观水平(DNA，RNA，蛋白质，分子和细胞水平)检测低水平的氧含量是比较困难的，本发明公开了一种新颖的解决办法，至少用到种检测增强剂和一个检测微器件直接或间接地检测氧含量水平。生物增强剂加入到被测生物样本中，检测生物样本的响应。该响应可以热信号(例如，来自放热反应)，物理信号，物理化学信号，生物化学信号(例如，泡沫的形成(来自于催化剂与生物样本反应)，光信号(例如，光发射，由于气泡形成光散射，由于氧气浓度的变化而产生的顔色变化)，由催化剂催化的在添加剂(例如，酶，催化剂)和电信号(电流电压，表面电荷，离子通过细胞膜的渗透性)之间产生的化学连锁反应。

在某个实施例中，氧化剂先被加入到被测样本中并与之发生反应。接下来加入第二添加剂，如酶或催化剂。加入的酶或催化剂能和氧化(样品氧含量升高)的生物样本发生反应。接下来利用微器件检测各种特性。

在另一个实施例中，生物成分，例如蛋白质首先加入，它们和被测一种或多种生物样本优化结合。接着加入第二添加剂，第二添加剂能够很容易基于某一种或几种易检特性而被追踪。利用微器件内部的检测探针检测上述含有第一添加剂，第二添加剂和被测样品的溶液。使用微器件的检测探针检测含有第一、第二添加剂和待检生物样品的溶液。可选地，所述的第一和第二添加剂可以选混合后，再加入含有生物样本的溶液中。可选地，利用多种分离办法可将第一第二添加剂标记的样品分离，然后检测。

这是利用酶和催化剂结合微器件的一种重要创新(任选的利用微器件的几何因子(例如，大小，形状和材料，包括涂层材料)，在利用酶或催化剂触发反应或连锁反应(化学，生物，生物的化学反应)之后检测被测样本一种或多种特性(其光学，热学，声学，化学，物理学，生化，生物物理学，机械学，电学，电磁学特性，尺寸，表面积，硬度，弹性的状态，粘度及流动速度)及状态，用于增强响应信号，不但能区分正常生物样本和患病样本，而且能获得疾病的类型信息(例如是哪种癌))。有时反应是一步的，有时是两步的或三步的。

在某个实施例中，由于酶对底物有高度选择性(例如，细胞表面)，正确类型的酶对特定类型的癌症的选择性可用于筛查该类癌症，结合本发明公开的微器件可以达到一定程度的灵敏度和特异性。在另一实施例中，多种酶对多种癌症的选择性可用于一般筛查。如果从上述受试者被怀疑有癌症，可以用多种酶进行逐个筛查以确定癌症的类型。微器件可以设计成多个腔室(每个室包括至少一个入口用于引入至少一种酶，一个探测单元和检测单元)，腔室连接一个或多个通道，用于被测生物样本流入腔室。作为说明，使用酶的检测方案见下面图表(微器件检测产生的信号，它涉及催化反应)：酶+底物(表面癌)＝>酶/底物

＝>酶+产物(可以用来检测微观信号)

本发明特别地具有检测疾病的能力，并且甚至可以分辨不同类型的疾病(例如不同类型的癌症)。不同癌细胞的例子包括癌，恶性肿瘤，白血病，淋巴瘤和神经胶质瘤。不同类型的癌细胞具有不同的特性包括但不限于物理学，化学，生物化学，生物物理学，力学，热学，光学，电学、磁学和电磁学特性。例如，即使在肿瘤类型的癌症里面，鳞状细胞在平坦的表面，而腺瘤状类型的肿瘤一般体积庞大(因此与鳞状型的肿瘤相比具有较低的表面积与体积的比值)。因此，一组易于吸收或吸附于癌细胞表面的增强子或者生物标识符可以与微器件一同用于获得鳞状类型肿瘤改进的测量特异性，而相同的增强子对腺瘤状类型的肿瘤却具有低的信号强度。

另一个不同点就在于不同类型的肿瘤的细胞表面和细胞膜的特性不同，特别是这些肿瘤具有不同的表面特性，含氧水平，细胞与细胞表面氧的结合，以及不同的渗透性和输运特性。因而，通过利用增强剂可探测生物样品例如细胞，蛋白质，DNA,RNA，和组织的含氧水平，结合点，渗透性，输运特性以及表面特性。

在一个实施例中，利用增强剂或者包含离子添加剂(例如Fe,Au,Ag,Cu,K,Ca,Na,和Cr)以及良好的表面吸附和吸收能力与生物样品混合来进行测试。带有增强剂和生物样本的溶液接着在本发明涉及的微器件中进行测试。

在另一个实施例中，包含至少一个氧化剂(例如H2O2)的增强剂首先与生物样品混合进行测试。混合溶液随后在微器件中进行测试。

在另一个实施例中，包含至少一个氧化剂(例如H2O2)的增强子首先与生物样品混合进行测试。包含至少一个催化剂的第二增强子随后被添加到以上溶液中。混合溶液随后在微器件中进行测试。

有时，用于本发明公开的方法中涉及的一种或多种添加剂(或其他组分，如离子，催化剂，氧化剂，蛋白质，化学化合物，生物化学化合物，或聚合物)可经历多种反应，与被检生物样本反应或接触前吸附或吸收。

本发明公开的方法涉及的微器件包括探测或检测的多个平台，每一个平台提供一个探测信号和检测微观水平的性质，这个探测信号与性质可以和另一个平台相同或者不同。

多平台检测器件收集数据，然后将整合并标准化的数据绘制成特性曲线来识别和分析待测样本，例如，针对不同类型癌症的分析。特别地，对于每一个平台，器件具有不同的几何形状。在一个实施例中，器件几何形状的不同在于通道的宽度和高度(即横截面)，在另一个实施例中，器件几何形状的不同在于它的长度。在其他的一些实施例中，形状的不同在于它的形貌(例如，它的横截面可以是圆形，方形，矩形，椭圆形和八边形)。几何形状因素，外加应用探针(例如光学束，热波，力，声波，电压，电流或者电磁波)和测得的来自于待测生物样品的响应提供了关于疾病类型的特征信息(疾病“指纹”)。在一个应用中，它提供了关于癌症类型的信息。这个与待测生物样本特性相关的几何因数在识别样本中的癌细胞类型扮演着重要的作用。在另一个实施例中，检测器件的几何因素，应用探针(例如光学束，热波，力，声波，电压，电流或者电磁波)，至少一个增强剂(包括但不限于氧化剂，催化剂，酶，还原剂，抑制剂，化合物，生物组分和生物组分)，和测得的来自待测生物样本的响应提供了关于疾病类型特征(指纹)的信息(例如癌症的类型)。在其他的实施例中，检测器件的几何因素，至少一个增强剂(包括但不限于氧化剂，催化剂，酶，还原剂，抑制剂，化合物，生物组分和生物组分)，和测得的来自待测生物样品的响应提供了关于疾病类型特征(指纹)的信息(例如癌症的类型)。在另一个实施例中，检测器件的几何因素和来自待测生物样品的响应提供了关于疾病类型特征(指纹)的信息(例如癌症的类型)。

图5(a)描述了一个带有四个不同探针平台的器件的实施例，并用a,b,c,和n来标示。这些不同的平台通过不同的通道几何形状来区分，在本案例中通道的几何形状是指生物样本所在流动的通道的宽度。在本实施例中，四个平台进行测试同时探测生物样本，每一个平台测量一个相同的特性。从四个平台收集到或者读取的相同特性可以用来描绘一种特性曲线，见图5(b)。通过与标准的控制组对比(例如非疾病或者健康细胞)，可以用来识别待测生物样品的疾病类型。在图5(b)，A和B是不同的生物样本产生不同的曲线。

图5(c)所示为带有多个平台的微器件的实施例，每一个平台因为探测单元的不同而不同。在不同平台里通道的宽度和高度是相同的。在本实施例中，两个不同的生物样本被探测和检测。测得的特性可以标准化来绘制特性曲线。图5(d)展示了两个不同的生物样本的曲线。

通过不同的探测和检测单元，多个被探测和检测的微观特性可以合成一个复杂的指数，如图5(d)所示，指数可以通过曲线所围的面积曲线的特点或者形状来表示。这比只利用一个单一的微观特性来决定疾病(例如癌症或者肿瘤)的存在或类型要更可靠。如图5(d)所示，与标准的可控样品相比癌症类型A和B具有不同的面积，而癌症类型A和B具有不同的形状和轮廓。这就提供了不同类型癌症之间较好的差异性和识别度。此方法允许肿瘤有多维度的表征，并且它比传统的检测方法，更灵敏和全面。相比传统的检测方法仅依靠一个参数或者一种途径进行癌症检测，本申请公开的的方法利用多个参数甚至包括不同的特性(生物学，生物化学，物理学，生物物理学，化学，机械学，热学，光学，电学，电光学特性等)提供有关检测的更可靠，更复杂，更全面，更精确和更灵敏的信息，并且提高检测特异性。

其他实施例

可以理解的是，尽管本发明已被进行了详细描述，接下来的描述旨在进一步说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由附加权利要求说明。其他的方面，优点和修改均在以下权利要求的范围内。本文中所有引用的出版物均被整体引用。

Claims (24)

1.利用生物样本检测疾病的方法，包括以下步骤：

提供可能患病的组织或器官样本，该样本包含生物体的患病细胞和正常细胞。

可选的将样本放入某种溶剂中，增强潜在患病细胞与正常细胞微观性质的差异，

可选的分离样本中的潜在患病细胞与正常细胞，

可选的增加生物表达水平或富集潜在患病细胞实现分离；通过检测生物表达水平或潜在患病细胞浓度并将检测结果与未患病生物样本进行比较来确定患病概率。

2.权利要求1所述的方法还包括向样本中加入添加剂，在处理样本前或处理样本过程中的任意步骤加入添加剂以增强疾病细胞和正常细胞微观性质的差异。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于添加剂是在增强微观性质差异的过程中加入或是在分离疾病细胞和正常细胞(基于增强的微观性质的差异)的过程中加入。

4.权利要求2或3所述的方法，其特征在于添加剂包括离子，氧化剂，还原剂，抑制剂，催化剂，酶，生物标志物，化学标志物，生物化学标志物，生物活性化合物，金属氧化物化合物，生物化学化合物，生物成分，有机成分，金属有机成分，生物化学成分，光学成分，荧光成分，蛋白质，病毒，染色剂，抗体或以上的组合。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述的离子包括Fe3+,Fe2+,Ag+,Cu2+,Cr3+,Na+,K+,Pt2+,Mg2+,H+,Ca2+,Hg2+,Al3+,NH4+,H3O+,Hg24+,Cl-,F-,Br-,O2-,CO32-,HCO3-,OH-,NO3-,PO43-,SO42-,CH3COO-,HCOO-,C2O42-和CN-，无机过氧化物，硝酸，硝酸盐化合物，铬化合物，高锰酸盐化合物，硫酸，过硫酸，氟，氯，溴，碘，亚氯酸盐，氯酸盐，高氯酸盐，一卤素化合物，次氯酸盐，次卤酸盐的化合物，过硼酸钠，一氧化二氮，氧化银，四氧化锇，银氨溶液，2,2'-二吡啶基二硫化物(DPS)，尿素，硝酸银，硝酸铁，尿素氮，尿素氮，高锰酸钾，或它们的组合；所述还原剂包括初生氢，含Fe2+的化合物，钠汞合金，硼氢化钠，亚硫酸盐化合物，肼，含有Sn2+的化合物，锌汞齐，氢化铝锂，林德乐催化剂，甲酸，草酸，抗坏血酸的化合物的化合物酸，亚磷酸，次磷酸盐，亚磷酸，或它们的组合；生物活性化合物包括葡萄糖，果糖，丙酮酸盐，半乳糖，氨基酸，乙酸，二羟乙酸，草酸，丙酸，乙酸或酶。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述的卤素化合物是4-氯甲苯，二溴戊烷，溴乙烷，2-氯丙烷，氟代环己烷或2-碘-2-甲基戊烷；次卤酸盐化合物包括次碘酸，次溴酸盐，次氯酸盐，和次氟酸；还原剂包括游离态氢，含铁阳离子的化合物(如，硫酸亚铁)；酶包括氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，连接酶，RNA-酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，己糖激酶，氨酰tRNA合成酶，核糖体，人造酶以及各自的辅助因子结合物。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于还原剂是脱氢酶，荧光素酶，或DMSO还原酶；与己糖激酶是丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。

8.权利要求2所述的方法，其特征在于在样本处理前加入第一添加剂以增强疾病细胞和正常细胞微观性质的差异，第二添加剂于处理待测样本的任意步骤中加入。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于第一添加剂和第二添加剂可以是相同或不同的。

10.权利要求1所述的方法，其特征在于疾病细胞和正常细胞的分离步骤包括使样本经过一个过多个过滤器。

11.权利要求10所述的方法，其特征在于一个或多个过滤器基于以下性质区分疾病细胞和正常细胞，这些性质包括电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

12.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的微观性质是电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

13.权利要求12所述的方法，其特征在于电学性质包括表面电荷，表面电位，静息电位，电流，电场分布，电偶极子，电四极子，三维电气或电荷云分布，染色体DNA端粒电性质，电容或阻抗；热学性质是指温度或振动频率；光学性质包括但不限于光吸收，光传输，光的反射，光电性质，亮度，或荧光发射；化学性质包括pH值，化学反应，生物化学反应，生物电化学反应，反应速度，反应能量，反应速率，氧气浓度，氧气消耗率，离子强度，催化行为，触发增强信号响应的化学添加剂，生物化学添加剂，生物添加剂，提高检测灵敏度的化学物质，生物化学物质及生物添加剂或键合强度；物理性质包括密度，形状，体积，或表面积；生物性质包括但不限于表面形状，表面积，表面电荷，表面生物学性质，表面化学性质，pH值，电解质，离子强度，电阻率，细胞浓度，生物标志物相关性质，或溶液的生物学，电学，物理学或化学性质；声学性质包括频率，声波的速度，频谱分布，声强，声学吸收，或声共振；机械性质包括但不限于内部压力，硬度，流速，粘度，剪切强度，拉伸强度，断裂应力，粘附性，机械共振频率，弹性，塑性，或可压缩性。

14.权利要求1所述的方法还包括在处理样本前或处理样本任一步骤中向样本施加外部压力或能量以增强疾病细胞和正常细胞在微观性质上的差异，施加的外部压力或能量导致疾病细胞和正常细胞微观性质上的差异得到增强。

15.权利要求14所述的方法，其特征在于所述的外部压力或能量包括但不限于，物理学，化学、生物学、热学、光学、声学、电学、磁学、电磁学、电机械学、电化学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电化学机械学、电光学、电化学光学力或能量。微观性质包括电学、磁学、电磁学、热学、光学、声学、生物学、化学、电机械学、电化学、电光学、电热学、电化学机械学、生物化学、生物机械学、生物光学、生物热学、生物物理学、生物电机械学、生物电化学、生物电光学、生物电热学、生物机械光学、生物机械学热学、生物热学光学、生物电化学光学、生物电学机械学光学、生物电热学光学、生物电学化学机械学、物理或机械性质，或它们的组合。

16.权利要求15所述的方法，其特征在于电学性质包括但不限于表面电荷，表面电位，静息电位，电流，电场分布，电偶极子，电四极子，三维电气或电荷云分布，染色体DNA端粒电性质，电容或阻抗；热学性质是指温度或振动频率；光学性质包括但不限于光吸收，光传输，光的反射，光电性质，亮度，或荧光发射；化学性质包括但不限于pH值，化学反应，生物化学反应，生物电化学反应，反应速度，反应能量，反应速率，氧气浓度，氧气消耗率，离子强度，催化行为，触发增强信号响应的化学添加剂，生物化学添加剂，生物添加剂，提高检测灵敏度的化学物质，生物化学物质及生物添加剂或键合强度；物理性质包括但不限于密度，形状，体积，或表面积；生物性质包括但不限于表面形状，表面积，表面电荷，表面生物学性质，表面化学性质，pH值，电解质，离子强度，电阻率，细胞浓度，生物标志物相关性质，或溶液的生物学，电学，物理学或化学性质；声学性质包括但不限于频率，声波的速度，频谱分布，声强，声学吸收，或声共振；机械性质包括但不限于内部压力，硬度，流速，粘度，剪切强度，拉伸强度，断裂应力，粘附性，机械共振频率，弹性，塑性，或可压缩性。

17.权利要求15所述的方法，其特征在于不仅能够通过区分正常生物物质和疾病生物物质来检测生物样本是否患病，而且还能获取疾病的类型信息从而区分不同的疾病类型。

18.1-17任一权利要求所述的方法中涉及的疾病指癌症或心脏病。

19.权利要求18所述的方法，其特征在于所述的癌症是膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，白血病，肺癌(包括支气管)，黑色素瘤，非Hodgkin巴瘤，胰腺癌，前列腺癌或甲状腺癌。

20.17-19任一权利要求所述的方法，其特征在于不同疾病类型的差异性部分取决于检测单元的几何形状探测信号，探测信号的变化和生物样本。

21.17-19任一权利要求所述的方法，其特征在于不同疾病类型的差异性部分取决于细胞表面的性质，细胞膜的性质，氧含量，氧位置，氧键合强度，电荷密度，电荷分布，或生物样本电荷的动态性质。

22.权利要求21所述的方法，其特征在于所述的细胞表面或细胞的膜性质包括生物样本的表面吸收和吸附能力，氧浓度，在细胞表面或膜的氧键合强度，离子浓度，离子浓度梯度，细胞膜静息电位，细胞表面电荷，细胞膜的渗透性和输运能力。

23.用生物样本进行疾病检测的检测仪包括待测样本输运系统，与生物样本发生反应的添加剂注入器件和生物样本的探测检测器件，所述的生物样本包括正常细胞和可能患病的细胞，正常细胞和可能患病的细胞分布在至少同一微观性质水平，与之作用的添加剂将差异性至少增强一个微观量级。

24.权利要求23所述的检测仪，其特征在于所述的添加剂包括离子，氧化剂，还原剂，抑制剂，催化剂，酶，生物标志物，化学标志物，生物化学标志物，生物活性化合物，金属氧化物化合物，生物化学化合物，生物成分，有机成分，金属有机成分，生物化学成分，光学成分，荧光成分，蛋白质，病毒，染色剂，抗体或以上的组合。