CN105694050A - 一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用 - Google Patents

一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用，所述载体系统由环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰而成，所述载体系统的化学结构如下：其中，环糊精为β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物，PAMAM为乙二胺核心，末端为胺基化的聚酰胺-胺（G0-G4），m=2-6；所述载体系统具有同时装载丹参酮ⅡA药物的功能，能够共同负载药物与基因；所述载体系统可应用于体外基因细胞转染及动脉血管再狭窄的治疗；本发明针对于血管内皮的损伤特点，提出了一种新型载体系统，可以同时负载丹参酮类药物及基因，可有效针对受损的内皮进行修复，抑制组织细胞增生，达到协同治疗的效果，在PTCA术后再狭窄的防治方面有很好的应用前景。

Description

一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用，具体是聚酰胺-胺功能化修饰环糊精阳离子聚合物的制备方法及其作为载体系统的应用。
背景技术
基因治疗是通过将外源性的基因导入体内的受体细胞，修复或替换有缺陷、受损基因的方法；通过它可以广泛治疗严重的后天获得及先天遗传疾病如：癌症、获得性免疫缺陷综合症、心血管疾病、传染病、及染色体相关的严重综合性免疫缺陷等；理论上，基因治疗是一种简单有效的医治手段，只需要将病变基因替换成建康基因或是引入先天缺失的基因以便产生所需的蛋白；事实上，为了使基因能够达到人体的靶向细胞并正确表达，其必须克服众多阻碍才能实现。
虽然病毒型载体具有低病原性、广泛取向性、转染效率高的特点，但其具有的高免疫原性、基因插入突变风险、基因导入的瞬时表达以及较低的基因装载能力等因素极大地限制了病毒型载体的应用；数据显示，由于具有严重的副作用产生，逆转录病毒载体用于重症综合性免疫缺陷（SCID）的治疗使用已经由28%下降到19.7%；相反，基于非病毒载体系统制备的新型传递系统的临床实验研究正在快速增长，聚酰胺-胺（PAMAM）生物材料是以乙二胺为核，通过迈克尔加成反应制备的，分子外层的伯氨基质子化形成-NH３ ＋基团，可以充当结合位点，而分子内叔胺基充当了“质子海绵”，提供了良好的缓冲能力，从而提高转染效率；虽然聚酰胺-胺表现出良好的基因传递能力，但随着分子量的增加，其毒性也在显著提高；正是基于上述原因，对于PAMAM的分子修饰成为了目前研究的热点，旨在通过键合功能性基团或带功能性基团的分子，以达到改善原有性能，拓宽使用范围的目的。
经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）是治疗心肌梗塞等心脏疾病的微创介入疗法，但该法在采用球囊治疗时不可避免的造成血管内皮产生机械性损伤，导致PTCA术后3-6月内仍有近50%的患者发生血管再狭窄，临床上用于防治术后血管再狭窄通常介入安置一枚或多枚血管支架，但顺应性差始终是难以解决的问题。
丹参酮ⅡA来自于唇形科植物丹参的根茎，其药理作用为改善冠状动脉循环，抑制血栓疾病发生，丹参素具有显著扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量，同时，丹参酮ⅡA具有血管内皮细胞损伤修复的功能；基于上述原因，需要设计和研发一种针对于血管内皮的损伤特点的新型输送载体系统，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用，具体的是，制备一种环糊精内核，外部功能化修饰聚酰胺-胺的阳离子聚合物载体系统，该阳离子聚合物主要用于基因药物载体及基因传递。
为实现上述目的，本发明公开了一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用，所述载体系统由环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰而成，所述载体系统的化学结构如下：
其中，环糊精为β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物，PAMAM为乙二胺核心，末端为胺基化的聚酰胺-胺（G0-G4），m=2-6。
作为本发明进一步的方案：所述载体系统的平均分子量为2199-43858。
作为本发明再进一步的方案：所述载体系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）定量称取环糊精置于500ml圆底烧瓶中，加入无水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A，定量称取N，N-羰基二咪唑，加无水DMSO溶液并形成澄明溶液B；
（2）在氮气保护条件下，将溶液A以5ml/h的速度滴加至溶液B中，滴加完毕后避光条件下室温搅拌16-24h，将搅拌后得到的反应溶液加入到乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，室温下以3000rpm条件离心10min，弃上清溶液得白色粘稠沉淀物，将白色粘稠沉淀物采用乙醚与四氢呋喃混合液洗涤2-3次后，减压干燥除去有机溶媒，用无水DMSO溶解形成溶液C；
（3）将整代PAMAM置于圆底烧瓶中，在圆底烧瓶中加入无水DMSO溶解形成溶液D，氮气保护下，将溶液C以5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光条件下室温搅拌16-24h；将搅拌后所得反应溶液加入到乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，室温下以3000rpm条件离心10min，弃去上清溶液得淡黄色粘稠沉淀物；
（4）将淡黄色粘稠沉淀物用双蒸水溶解，置于透析袋中并搅拌，每8h换水，透析3天，所得透析液在真空度小于等于13pa条件下进行冷冻干燥，得白色目标产物。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤1中环糊精与N，N-羰基二咪唑反应摩尔比为1:50-1:100，环糊精与PAMAM的摩尔比为1:42-1:120。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤2和步骤3中乙醚与乙酸乙酯的混合溶液按照乙醚与乙酸乙酯的体积比为1:1-1:3配置，反应溶液与乙醚与乙酸乙酯的混合溶液的体积比为1:10-1:50。
作为本发明再进一步的方案：所述白色目标产物与DNA形成的复合物体系平均粒径为50-250nm，PDI为0.1-0.25，zeta电位为12-46mv。
作为本发明再进一步的方案：所述环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰后形成的载体系统具有同时装载丹参酮ⅡA药物的功能，能够共同负载药物与基因。
作为本发明再进一步的方案：所述载体系统与丹参酮ⅡA的摩尔比为0.8:1-1.2:1。
作为本发明再进一步的方案：所述载体系统在体外基因细胞转染及动脉血管再狭窄的治疗方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明针对于血管内皮的损伤特点，制备了一种以环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰而成的新型输送载体系统，该系统可以同时负载丹参酮类药物及基因，可有效针对受损的内皮进行修复，抑制组织细胞增生，达到协同治疗的效果，在PTCA术后再狭窄的防治方面有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物红外光谱图。
图2本发明中聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物毒性试验结果示意图。
图3本发明中聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物体外转染结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，由环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰而成；所述载体系统的化学结构如下：
其中，环糊精为β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物，PAMAM为乙二胺核心，末端为胺基化的聚酰胺-胺（G0-G4），m=2-6；所述载体系统的平均分子量为2199-43858。
所述基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）定量称取环糊精置于500ml圆底烧瓶中，加入无水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A，定量称取N，N-羰基二咪唑，加无水DMSO溶液并形成澄明溶液B；
（2）在氮气保护条件下，将溶液A以5ml/h的速度滴加至溶液B中，滴加完毕后避光条件下室温搅拌16-24h，将搅拌后得到的反应溶液加入到乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，室温下以3000rpm条件离心10min，弃上清溶液得白色粘稠沉淀物，将白色粘稠沉淀物采用乙醚与四氢呋喃混合液洗涤2-3次后，减压干燥除去有机溶媒，用无水DMSO溶解形成溶液C；
（3）将整代PAMAM置于圆底烧瓶中，在圆底烧瓶中加入无水DMSO溶解形成溶液D，氮气保护下，将溶液C以5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光条件下室温搅拌16-24h；将搅拌后所得反应溶液加入到乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，室温下以3000rpm条件离心10min，弃去上清溶液得淡黄色粘稠沉淀物；
（4）将淡黄色粘稠沉淀物用双蒸水溶解，置于透析袋中并搅拌，每8h换水，透析3天，所得透析液在真空度小于等于13pa条件下进行冷冻干燥，得白色目标产物。
所述步骤1中环糊精与N，N-羰基二咪唑反应摩尔比为1:50-1:100，环糊精与PAMAM的摩尔比为1:42-1:120。
所述步骤2和步骤3中乙醚与乙酸乙酯的混合溶液按照乙醚与乙酸乙酯的体积比为1:1-1:3配置，反应溶液与乙醚与乙酸乙酯的混合溶液的体积比为1:10-1:50。
所述白色目标产物与DNA形成的复合物体系平均粒径为50-250nm，PDI为0.1-0.25，zeta电位为12-46mv。
所述环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰后形成的载体系统具有同时装载丹参酮ⅡA药物的功能，能够共同负载药物与基因，所述载体系统与丹参酮ⅡA的摩尔比为0.8:1-1.2:1；所述载体系统在体外基因细胞转染及动脉血管再狭窄的治疗方面的应用。
实施例1
称量β-CD0.114g，加入25ml无水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密称量N，N-羰基二咪唑0.811g置于500ml圆底烧瓶中，加入25ml无水DMSO溶解成溶液B，氮气保护并在快速磁力搅拌条件下，将溶液A以1ml/5min速度滴入到溶液B中，避光室温搅拌16h；将所得产物溶液加入到900ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，产生白色浑浊；将浑浊液在3000rpm条件下离心10min，弃去上清溶液并用上述乙醚与乙酸乙酯混合液洗涤2-3次，备用；将获得的固体使用25ml无水DMSO溶解的溶液C，再精密称取PAMAM-G11.02g溶解于150ml无水DMSO中得溶液D；在氮气保护下，将溶液C缓慢滴加至溶液D中，避光搅拌16h；将所得产物溶液加入到1200ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，于3000rpm条件下离心10min，将所得固体用双蒸水溶解，放置于截留分子量3500的透析袋中透析3天，将透析液冷冻干燥，得白色目标产物，收率24.7%。
实施例2
称量β-CD0.224g，加入25ml无水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密称量N，N-羰基二咪唑2.044g置于500ml圆底烧瓶中，加入25ml无水DMSO溶解成溶液B；氮气保护并在快速磁力搅拌条件下，将溶液A以1ml/5min速度滴入到溶液B中，避光室温搅拌16h；将所得产物溶液加入到1500ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，产生白色浑浊；将浑浊液在3000rpm条件下离心10min，弃去上清溶液并用上述乙醚与乙酸乙酯混合溶液洗涤2-3次，备用；将上一步骤获得的固体使用25ml无水DMSO溶解的溶液C，再精密称取PAMAM-G110.224g溶解于150ml无水DMSO中得溶液D；在氮气保护下，将溶液C缓慢滴加至溶液D中，避光搅拌16h；将所得产物溶液加入到1500ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，于3000rpm条件下离心10min，将所得固体用双蒸水溶解，放置于截留分子量3500的透析袋中透析3天，将透析液冷冻干燥，得白色目标产物，收率19.7%。
实施例3
称量γ-CD0.065g，加入10ml无水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密称量N，N-羰基二咪唑0.584g，置于500ml圆底烧瓶中，加入15ml无水DMSO溶解成溶液B；氮气保护并在快速磁力搅拌条件下，将溶液A以1ml/5min速度滴入到溶液B中，避光室温搅拌16h；将所得产物溶液加入到900ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，产生白色浑浊；将浑浊液在3000rpm条件下离心10min，弃去上清溶液并用上述乙醚与乙酸乙酯的混合溶液洗涤2-3次，备用；将上述获得的固体使用15ml无水DMSO溶解的溶液C，再精密称取PAMAM-G23.902g溶解于50ml无水DMSO中得溶液D；在氮气保护下，将溶液C缓慢滴加至溶液D中，避光搅拌16h；将所得产物溶液加入到600ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，于3000rpm条件下离心10min，将所得固体用双蒸水溶解，放置于截留分子量7000的透析袋中3天，将透析液冷冻干燥，得白色目标产物，收率28.1%。
实施实例4
称量γ-CD0.130g，加入10ml无水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密称量N，N-羰基二咪唑1.622g，置于500ml圆底烧瓶中，加入15ml无水DMSO溶解成溶液B；氮气保护并在快速磁力搅拌条件下，将溶液A以1ml/5min速度滴入到溶液B中，避光室温搅拌16h；将所得产物溶液加入到900ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，产生白色浑浊；将浑浊液在3000rpm离心10min，弃去上清溶液并用上述乙醚与乙酸乙酯的混合溶液洗涤2-3次，备用；将上述获得的固体使用15ml无水DMSO溶解的溶液C，再精密称取PAMAM-G27.803g溶解于75ml无水DMSO中得溶液D；在氮气保护下，将溶液C缓慢滴加至溶液D中，避光搅拌16h；将所得产物溶液加入到800ml乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，于3000rpm条件下离心10min，将所得固体用双蒸水溶解，放置于截留分子量7000的透析袋中3天，将透析液冷冻干燥，得白色目标产物，收率18.7%。
请参阅附图1-3，本发明基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的红外色谱、毒理实验及体外转染实验如下：
1．红外色谱：
将环糊精（CD），环糊精-PAMAM聚合物样品分别采用KBr压片制备，取大约10mg的固体样品，加入预先粉碎的质量为其40倍左右的溴化钾（KBr），在玛瑙研钵中研磨成细粉末混合物，过80目筛网，取适量用压片机减压压片，压成直径10mm薄片，装入红外光谱仪进行测量，波长范围为4000-400cm-1；如图1所示，结果表明合成产物的红外色谱图中包含了PAMAM的特征吸收峰,α-CD的3403cm-1的-OH吸收峰消失，同时1720cm-1处观察到了新产生的-OOC-振动峰，说明环糊精已经被活化并枝接PAMAM。
2．毒理实验：
采用MTT比色法评价聚合物的细胞毒性，将BEL-7402细胞（2×104个/孔）接种到96孔板中，每孔150μl含10%胎牛血清培养液，于37OC、5%CO2条件下培育24h，待细胞融合度达80%，吸出孔中培养基以并以不同浓度的聚合物溶液替代培养；培养4h后，以含10%胎牛血清的培养基替换聚合物溶液继续培养36-48h；所有样品每个浓度均做4个复孔，以PBS溶液作为阴性对照；然后每孔加入20μlMTT的PBS标准液（5mg/ml）继续在37OC继续培养4h，吸尽上清后，每孔加入200μlDMSO，置于摇床上振荡20min溶解结晶，用酶标仪测在492nm和620nm双波长测定每孔的吸收值，计算细胞的存活率；结果如图2所示，表明在较高浓度下，任能保持细胞的存活力。
3.体外转染实验：
选择实施例2产物，进行细胞转染实验，将BEL-7402以2×105/孔接种于24孔板，培养18-24h至细胞汇合度达到80%，备用；将CD-PAMAM用无菌水稀释后与pEGFP-C1等体积混合配制复合物溶液；N/P为：70、80、90，同时以PEL-25K（K/P）和Lipofectamine2000（w/w=2）作为阳性对照；转染时，首先吸去孔中细胞培养基，每孔加入550μlDMEM培养基，再加入150μl预先配制好的阳离子载体/pDNA（2μg）复合物溶液，小心混合避免局部复合物浓度过高；将24孔板在37OC，含5%CO2的恒温培养箱中培养4h，取出并小心吸出孔中培养液，并小心加入1ml完美培养基，再次置于37OC，含5%CO2的恒温培养箱中培养36-48h,在荧光显微镜下观察细胞转染情况并用流式细胞仪分析结果；结果如图3所示，表明聚合物体系与脂质体效果相当并高于PEI-25K。
将实施例1中的产物精密称量0.1g,加入10ml纯净水溶解，并加入500mg丹参酮ⅡA，避光室温持续搅拌过夜，过滤后置于截留分子量7000的透析袋中透析1天，将透析液冷冻干燥，得到载药目标产物。
另外，也可通过冷冻干燥的的方法制备载药阳离子体，精密称取实施例1中的产物精密称量0.3g，加入5ml叔丁醇溶解完全，并加入2mg丹参酮ⅡA,适当超声后过0.45μm滤膜，进行冷冻干燥，即得载药目标产物；将载药目标产物与VEGF165基因按照N:P=45:1的比例混合，37OC孵育10min,即得同时负载丹参酮ⅡA与基因的传递系统；通过检测，该系统粒径=87.6nm,zate电位=24.1mv,可用于冠状动脉术后再狭窄的治疗。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，其特征在于，所述载体系统由环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰而成。
2.根据权利要求1所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，其特征在于，所述载体系统的化学结构如下：
其中，环糊精为β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物，PAMAM为乙二胺核心，末端为胺基化的聚酰胺-胺（G0-G4），m=2-6。
3.根据权利要求1-2任一所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，其特征在于，所述载体系统的平均分子量为2199-43858。
4.根据权利要求1-2任一所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）定量称取环糊精置于500ml圆底烧瓶中，加入无水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A，定量称取N，N-羰基二咪唑，加无水DMSO溶液并形成澄明溶液B；
（2）在氮气保护条件下，将溶液A以5ml/h的速度滴加至溶液B中，滴加完毕后避光条件下室温搅拌16-24h，将搅拌后得到的反应溶液加入到乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，室温下以3000rpm条件离心10min，弃上清溶液得白色粘稠沉淀物，将白色粘稠沉淀物采用乙醚与四氢呋喃混合液洗涤2-3次后，减压干燥除去有机溶媒，用无水DMSO溶解形成溶液C；
（3）将整代PAMAM置于圆底烧瓶中，在圆底烧瓶中加入无水DMSO溶解形成溶液D，氮气保护下，将溶液C以5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光条件下室温搅拌16-24h；将搅拌后所得反应溶液加入到乙醚与乙酸乙酯的混合溶液中，室温下以3000rpm条件离心10min，弃去上清溶液得淡黄色粘稠沉淀物；
（4）将淡黄色粘稠沉淀物用双蒸水溶解，置于透析袋中并搅拌，每8h换水，透析3天，所得透析液在真空度小于等于13pa条件下进行冷冻干燥，得白色目标产物。
5.根据权利要求4所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的制备方法，其特征在于，所述步骤1中环糊精与N，N-羰基二咪唑反应摩尔比为1:50-1:100，环糊精与PAMAM的摩尔比为1:42-1:120。
6.根据权利要求4所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的制备方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中乙醚与乙酸乙酯的混合溶液按照乙醚与乙酸乙酯的体积比为1:1-1:3配置，反应溶液与乙醚与乙酸乙酯的混合溶液的体积比为1:10-1:50。
7.根据权利要求所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的制备方法，其特征在于，所述白色目标产物与DNA形成的复合物体系平均粒径为50-250nm，PDI为0.1-0.25，zeta电位为12-46mv。
8.根据权利要求1-2所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，其特征在于，所述环糊精经聚酰胺-胺功能化修饰后形成的载体系统具有同时装载丹参酮ⅡA药物的功能，能够共同负载药物与基因。
9.根据权利要求8所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，其特征在于，所述载体系统与丹参酮ⅡA的摩尔比为0.8:1-1.2:1。
10.根据权利要求1-9所述的基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的应用，其特征在于，所述载体系统在体外基因细胞转染及动脉血管再狭窄的治疗方面的应用。
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