CN105671144A - 适用于家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及快速检测方法。所述检测引物为Septin1-F3、Septin1-B3、Septin1-FIP和Septin1-BIP，其序列分别如SEQ？ID？NO：1～4所示。基于所述引物，本发明优化了检测步骤和系统，提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，操作简单、不需要复杂的仪器及复杂的扩增程序、检测耗时短、杂质对扩增的干扰较小，且反应结果易于判定，特异性强，为应用LAMP技术进行家蚕蚕卵微孢子虫的检测和确保蚕种健康无毒提供重要的基础和技术储备，能较好地满足科研院校、蚕种生产单位及蚕种质检中心的检毒需要，易于大范围推广应用。

Description

适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及其应用和家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法。
背景技术
家蚕微粒子病是病原性的家蚕微孢子虫(Nosemabombycis，N.b)经食下传染或胚卵(胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病，也是目前影响我国蚕丝业持续稳定发展的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的经济损失十分惨重。同时，野外昆虫微孢子虫可交叉感染家蚕，并能在蚕体间以及不同蚕期间传播，导致大批蚕种报废，严重制约蚕种贸易和蚕业可持续发展。我国将家蚕微粒子病列为进出口动物检疫二类疫病的检疫名录。
各地区蚕业主管部门和相关生产单位投入大量人力、物力和财力，采取传统显微镜镜检母蛾，淘汰带毒母蛾产下的蚕种的常规方法进行防治家蚕微粒子病，但效果不佳。
最初人们判别家蚕是否感染家蚕微粒子病主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行的，这种方法也有效地遏制了世界各地蚕区微粒子病的流行，拯救了世界的养蚕业。而对于家蚕蚕卵微孢子虫的检测主要是通过将产卵24h后的蚕卵浸酸处理，待蚕卵孵化收蚁后进行显微镜检测，这种方法不仅耗费了大量时间，而且显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，且很难将其他孢子类似物与家蚕微孢子虫孢子区别开来。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。目前用于家蚕微粒子病PCR检测的引物多是针对靶基因SSUrRNA的(TerryRS,SmithJE,BouchonD,etal.UltrastructuralcharacterizationandmoleculartaxonomyofNosemagranulosissp.n.,atransovariallytransmitted,feminizing(TTF)microsporidium.J.Eukaryot.Microbiol.1999,(46):492-499；HuangWei-Fone,TsaiShu-Jen,LoChu-Fang,etal.ThenovelorganizationandcompletesequenceoftheribosomalRNAgeneofNosemabombycis.FungalGeneticsandBiology,2004.41(5):473-481)。刘吉平等(刘吉平，曹阳，SmithJ.E.等.模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究.中国农业科学，2004，37(12)：1925－1931)研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带及假阳性结果出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原微孢子虫基因组DNA有效扩增。
本申请人根据长期的研究实验结果，针对家蚕微孢子虫转录组测序的结果，经测序验证发现了家蚕微孢子虫Septin1基因(登录号：KF421133.1)，并在申请号为201410279224.0的中国专利中公开了septin1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用，发现以Septin1基因为靶序列设计的PCR引物检测微孢子虫并无非特异性条带及假阳性结果。但是，使用该基因设计的PCR引物对于家蚕微孢子虫检测方法操作步骤较多，且花费时间较长。况且，微孢子虫寄生于蚕卵中，且蚕卵含量明显高于要检测的微孢子虫，在提取获得的DNA样品中，两者DNA同时存在，家蚕蚕卵DNA对检测造成严重的干扰，因此，要想直接以蚕卵DNA为模板进行微孢子虫的LAMP检测，对检测提出了更高的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中检测蚕卵中是否感染家蚕微孢子虫所存在的操作步骤多、花费时间长、干扰大等缺陷，设计出一组适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物，基于所述引物，可成功建立家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测方法。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一组适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物，所述引物为Septin1-F3、Septin1-B3、Septin1-FIP(F1c+F2)和Septin1-BIP(B1c+B2)，其序列分别如SEQIDNO：1～4所示。
SEQIDNO：1：
Septin1-F3：5'-AAGGTGAAAGGATTAATGACTT-3'
SEQIDNO：2
Septin1-B3：5'-TCATATAATTCACTTGCTGTGTA-3'
SEQIDNO：3：
Septin1-FIP(F1c+F2)：
5'-TCCCCATTTAAACTTCCTAACTCGATTCCATTTTTCGTTGTTTCATCT-3'
SEQIDNO：4：
Septin1-BIP(B1c+B2)：
5'-AAGTTGATAACACGGAACACTGTCAAAACACTTAAATGTGTACCAA-3'。
在本发明方法的关键技术之一是引物的设计，基于引物的科学设计，才能成功实现操作步骤少、花费时间短、干扰小、特异性强的LAMP检测，本申请人根据Septin1基因设计了若干组引物，经过复杂和困难的筛选工作，并对这些引物的有效性、特异性、反应时间等反复进行了分析、总结和模拟实验，综合考虑检测方法的各种影响因素，才确定所述适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物。
本发明同时提供一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：
S1.提取待测样品模板DNA；
S2.基于所述检测引物，配置反应体系；
S3.在步骤S2所配置的反应体系使用的反应管中加入20μL密封液，在管盖内侧加入1μL显色液；
S4.反应：将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置60min；然后95℃，放置2min灭活；
S5.结果判定：
采用染色法进行结果判定：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕蚕卵微孢子虫；
或者采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定：取2μL反应后的产物，与1μL6×loadingbuffer和8μLddH2O混合，于2％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不含有家蚕蚕卵微孢子虫；
或者采用实时荧光法进行结果判定：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值则为阴性。
其中，S2所述的反应体系是采用优化后的25μL反应体系，分别如下：
(1)采用染色法进行结果判定的25μL反应体系为：
(2)采用实时荧光法进行结果判定25μL反应体系为：
(3)采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定25μL反应体系为：
所述2×ReactionMix为反应缓冲液，组成为20mMTris-HCl，pH8.8；10mMKCl；2mMMgSO4；20mM(NH4)2SO4；0.1％TritonX-100；2.8mMdNTPs；1M甜菜碱；25mMMgCl2；
所述Septin1-F3/B3为5pmol/μL；所述Septin1-FIP/BIP为20～40pmol/μL；所述BstDNApolymerase为8U/μL。
阳性对照品为Septin1DNA-pMD重组质粒。
所述显色液为10000×SYBRGreenI；所述荧光指示剂为1×SYBRGreenI。
步骤S1所述提取待测样品模板DNA的方法具体包括以下步骤：
S01.取微孢子虫样品200μl，在12000rpm条件下离心5min，弃上清；加50～100μlddH2O重悬得孢子液；
S02.吸取S01步骤重悬的孢子液至预冷的研钵中，液氮充分研磨；
S03.将S02步骤研磨后孢子放入1.5ml离心管中，加入400μlAP1和4μlRnase，涡旋混匀；
S04.S03步骤混匀后的溶液于65℃，孵育10min；
S05.加130μlAP2，混合后冰浴5min；然后在14000rpm条件下离心5min；
S06.吸取S05离心处理所得上清于QIAshredderspincolumn中的收集管，在14000rpm条件下，离心2min；
S07.将离心管中上清液移至新管(勿搅动出现的残渣)，加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；
S08.将650μl混合液移至DneasyMinispincolumn中，4200rpm，离心1min；剩下的液体重复此步骤；
S09.将spincolum放入新收集管中，加入500ulbufferAW，4200rpm，离心1min；弃上清；
S010.再加入500μlAW，14000rpm，离心2min；
S011.移收集管至1.5ml或2ml离心管中；
S012.加入40μlbufferAE洗脱，室温放置5min；4200rpm，1min；
S013.重复上一步(即加入40ulbufferAE洗脱，室温放置5min，4200rpm条件下离心处理1min；
S014.-20℃冰箱保存备用。
本发明的有益效果是：
本发明扩展了家蚕微孢子虫Septin1基因(Accessionnumber：KF421133.1)序列的新的应用。本发明通过BLAST软件进行同源性分析，发现并无相似性序列特异性高，并引用特异性好的靶基因引物Septin1F/R；以该引物为参考，Septin1基因为靶基因设计多组LAMP引物，经过复杂和困难的筛选工作，并对这些引物的有效性、特异性、反应时间等反复进行了分析、总结和模拟实验，综合考虑检测方法的各种影响因素，才确定所述适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测的检测引物。在只有四条特异性引物完全识别靶基因的6个区域的情况下，才能进行扩增，从而保证了其对家蚕微孢子虫Septin1基因扩增的特异性和检测的全面性。
基于引物的特异性，本发明本进一步对反应体系进行优化，提供了一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，能够检测浓度为1.2×10-4ng/μl的微孢子虫DNA，检测的灵敏性与PCR相当，但操作步骤大大简化，整个反应可在40～90min内完成，大大缩短了检测时间，而且不需要价格昂贵的扩增仪器。
更进一步的是，本发明基于同一组检测引物的检测方法的结果判断可以有多重选择，且结果均易于观察判定。可在反应产物中加入显色液，通过直观的显色反应就可以肉眼鉴别检测；可通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带可以更加直观的观察反应结果，具有强有力的说服力，对于假阳性检测结果也可以轻易地排除掉；可通过实时荧光检测，可以通过扩增曲线直观的判断结果，且对于浓度高的样品结果的判定可以提前结束，减少了不必要的时间浪费。
综上所述，本发明所述的家蚕病原微孢子虫的LAMP快速检测方法，操作简单、不需要复杂的仪器及复杂的扩增程序、杂质对扩增的干扰较小且反应结果易于判定，特异性强，为应用LAMP技术进行家蚕蚕卵微孢子虫的检测和保证蚕种的质量提供重要基础和技术储备，能较好地满足科研院校、蚕种生产单位及蚕种质检中心的检毒需要，易于大范围推广应用。
附图说明
图1PCR引物及LAMP引物组在Septin1基因上的位置示意图。
图2四条LAMP引物设计的靶基因序列和位置示意图。
图3两条PCR引物检测健康蚕卵和添毒蚕卵的电泳图。
其中，M:DL2000DNAMarker；1：添毒家蚕蚕卵DNA；2：家蚕微孢子虫DNA；3：正常家蚕蚕卵DNA；4：ddH2O。
图4家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品(重组质粒Septin1DNA-pMD)结果(琼脂糖凝胶电泳法检测)。
其中，M:DL2000DNAMarker；1～7分别为稀释106-100copies/μl的重组质粒Septin1DNA-pMD；8：ddH2O。
图5家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品(重组质粒Septin1DNA-pMD)结果(显色法检测)。
其中，M:DL2000DNAMarker；1～7分别为稀释106-100copies/μl的重组质粒Septin1DNA-pMD；8：ddH2O。
图6家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品(重组质粒Septin1DNA-pMD)结果(实时荧光法检测)。
其中，M:DL2000DNAMarker；1～7分别为稀释106-100copies/μl的重组质粒Septin1DNA-pMD；8：ddH2O。
图7家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微孢子虫DNA的灵敏性结果(琼脂糖凝胶电泳法检测)。
其中M:DL2000DNAMarker；1-7分别为：:1.2×100ng/μl、1.2×10-1ng/μl、1.2×10-2ng/μl、1.2×10-3ng/μl、1.2×10-4ng/μl、1.2×10-5ng/μl、1.2×10-6ng/μl；8：ddH2O。
图8家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微孢子虫DNA的灵敏性结果(显色法检测)。
其中M:DL2000DNAMarker；1-7分别为：:1.2×100ng/μl、1.2×10-1ng/μl、1.2×10-2ng/μl、1.2×10-3ng/μl、1.2×10-4ng/μl、1.2×10-5ng/μl、1.2×10-6ng/μl；8：ddH2O。
图9家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微孢子虫DNA的灵敏性结果(实时荧光法检测)。
其中M:DL2000DNAMarker；1-7分别为：:1.2×100ng/μl、1.2×10-1ng/μl、1.2×10-2ng/μl、1.2×10-3ng/μl、1.2×10-4ng/μl、1.2×10-5ng/μl、1.2×10-6ng/μl；8：ddH2O。
图10家蚕蚕卵微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同的生产上蚕卵的检测结果(琼脂糖凝胶电泳法检测)。
其中，M:DL2000DNAMarker；1、2、6、7、8、9、11、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。
图11家蚕蚕卵微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同的生产上蚕卵的检测结果(显色法检测)。
其中，M:DL2000DNAMarker；1、2、6、7、8、9、11、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。
图12家蚕蚕卵微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同的生产上蚕卵的检测结果(实时荧光法检测)。
其中，M:DL2000DNAMarker；1、2、6、7、8、9、11、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。
图13用MEGA5.1软件构建家蚕微孢子虫Septins系统进化N-J树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述附图和实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1引物的设计和筛选
本发明以通过转录组测序方法并通过克隆测序方法验证的家蚕微孢子虫Septin1基因(Accessionnumber：KF421133.1)序列，通过BLAST软件进行同源性分析，发现并无相似性序列，因此以该基因为靶基因设计Septin1F/R引物。图1显示的是PCR引物及LAMP引物组在Septin1基因上的位置示意图。图2所示为四条LAMP引物设计的靶基因序列和位置示意图。
①引物组1四条引物序列为：
Septin1-F3：5’-AAGGTGAAAGGATTAATGACTT-3'；
Septin1-B3：5'-TCATATAATTCACTTGCTGTGTA-3'；
Septin1-FIP(F1c+F2)：
5'-TCCCCATTTAAACTTCCTAACTCGATTCCATTTTTCGTTGTTTCATCT-3'；
Septin1-BIP(B1c+B2)：
5'-AAGTTGATAACACGGAACACTGTCAAAACACTTAAATGTGTACCAA-3'；
②引物组2四条引物序列为：
2F3：5'-TCAAAAATAAGGAGAGATCCTAC-3'；
2B3：5'-TCACTAAGCTGATTTCGTACT-3'；
2FIP：
5'-CTGTTTCTTTCAGACCATTCACAGTAGATACAAGAGTCCATTGTCT-3'；
2BIP：
5'-TCTCTTGTAAATATTGTGCCTGTCACTTTCAGAATTGTTCTCTCGA-3'；
③引物组3四条引物序列为：
1F3：5'-GAAGAATCAAAAATAAGGAGAGATC-3'；
1B3：5'-TCACTAAGCTGATTTCGTACT-3'；
1FIP：
5'-AGACCATTCACAGTTGAAGGTATGCTACTTTTGAAGATACAAGAGTCC-3'
1BIP：
5'-TCTCTTGTAAATATTGTGCCTGTCACTTTCAGAATTGTTCTCTCGA-3'。
使用上述PCR引物检测健康蚕卵和感染了家蚕微孢子虫的蚕卵，结果显示该引物对于家蚕蚕卵微孢子虫的检测具有特异性，因此基于该PCR引物扩增片段位置，以Septin1基因为LAMP引物设计的靶基因，使用在线软件PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，设计多组LAMP引物，经过复杂和困难的筛选工作，并对这些引物的有效性、特异性、反应时间等反复进行了分析、总结和模拟实验，综合考虑检测方法的各种影响因素，确定一组即四条特异性引物作为LAMP检测用引物。
实施例2家蚕蚕卵及家蚕蚕卵微孢子虫的模板DNA的制备
取健康家蚕蚕卵或添食家蚕微孢子虫的家蚕所产蚕卵样品10～50粒，12000rpm下离心5min，弃上清；然后加50～100μlddH2O重悬；吸取重悬的孢子液至预冷的研钵中，液氮充分研磨(3次以上)；将研磨后孢子放入1.5ml离心管中，加入400μlAP1(参见Qiagen公司出品的试剂盒DNeasyPlantMiniKit说明，以下其他试剂同)和4μlRnase，涡旋混匀)；混匀后的溶液，65℃，孵育10min(期间上下颠倒试管2～3次)；加130μlAP2，混合后冰浴5min；然后14000rpm下离心5min；吸取上清于QIAshredderspincolumn中的收集管，14000rpm离心2min；将离心管中上清液移至新管(勿搅动出现的残渣)，加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；将650μl混合液移至DneasyMinispincolumn中，4200rpm，离心1min；剩下的液体重复此步骤；将spincolum放入新收集管中。加入500ulbufferAW(参见Qiagen公司出品的试剂盒DNeasyPlantMiniKit说明)，4200rpm，离心1min；弃上清；再加入500μlAW，14000rpm，离心2min；(保证收集管不接触到底部上清)；移收集管至1.5ml或2ml离心管中；加入40μlbufferAE(参见Qiagen公司出品的试剂盒DNeasyPlantMiniKit说明)洗脱，室温放置5min；4200rpm，1min；重复上一步；-20℃冰箱保存备用。
实施例3制备阳性对照品：
用上游引物Septin1F和下游引物Septin1R为反应引物，以家蚕微孢子虫DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD-19T(购自Takara公司)载体获得Septin1DNA-pMD质粒并作为检测的阳性模板。
Septin1F和下游引物Septin1R的序列为：
Septin1F：5'-TCATCATTCTTTAATACACTC-3'；
Septin1R：5'-CTTCTCATATAATTCACTTGC-3'；
用引物组Septin1-F3和Septin1-B3作为外部引物，Septin1-FIP和Septin1-BIP作为内部引物，反应缓冲液2×ReactionMix(20mMTris-HCl，pH8.8；10mMKCl；2mMMgSO4；20mM(NH4)2SO4；0.1％TritonX-100；2.8mMdNTPs；1M甜菜碱；25mMMgCl2)；Septin1F3/B3(20～40pmol/μL)；Septin1FIP/BIP(5pmol/μL)；阳性对照品；BstDNApolymerase(8U/μL)；密封液；显色液(10000×SYBRGreenI)；荧光指示剂(1×SYBRGreenI)；灭菌ddH2O；即为家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法的所有检测试剂。
实施例3应用试验
本实施例提供家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法的应用试验，操作步骤如下：
(1)制备待测样品核酸(QIAGENDNeasyplantminikit)：
取健康家蚕蚕卵或添食家蚕微孢子虫的家蚕所产蚕卵样品10～50粒，12000rpm，离心5min，弃上清；然后加50～100μlddH2O重悬；吸取重悬的孢子液至预冷的研钵中，液氮充分研磨(3次以上)；将研磨后孢子放入1.5ml离心管中，加入400μlAP1和4μlRnase，涡旋混匀)；混匀后的溶液，65℃，孵育10min(期间上下颠倒试管2～3次)；加130μlAP2(参见Qiagen公司出品的试剂盒DNeasyPlantMiniKit说明)，混合后冰浴5min；然后14000rpm离心5min；吸取上清于QIAshredderspincolumn中的收集管，14000rpm离心2min；将离心管中上清液移至新管(勿搅动出现的残渣)，加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；将650μl混合液移至DneasyMinispincolumn中，4200rpm离心1min；剩下的液体重复此步骤；将spincolum放入新收集管中。加入500ulbufferAW，4200rpm，离心1min；弃上清；再加入500μlAW，14000rpm离心2min(保证收集管不接触到底部上清)；移收集管至1.5ml或2ml离心管中；加入40μlbufferAE洗脱，室温放置5min；4200rpm，1min；重复上一步；-20℃冰箱保存备用。
(2)配置反应体系：
①染色法判定结果
在PCR管中配置，采用优化后的25μL反应体系，如下表所述：
建议：对于N个样品，应配制(N+3)倍体积的反应液(包括阴性对照、阳性对照各一个，以及分装耗费误差)，保证各反应管分装均匀。
②实时荧光法判定结果
在PCR管中配置，采用优化后的25μL反应体系，如下表所述：
③琼脂糖凝胶电泳法判定结果
在PCR管中配置，采用优化后的25μL反应体系，如下表所述：
(3)加样：分装后，分别依次向反应管加入2μL的ddH2O(空白对照)、各模板DNA、阳性对照品；然后加入甘油20μL密封；(对于染色法判定结果，要在反应管管盖内侧加入1μL显色液，将管盖盖紧(注意避免显色液掉入反应液中)。
(4)反应：对于染色法和琼脂糖凝胶电泳法判定结果的检测，将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置60min，然后95℃，放置2min灭活。对于实时荧光法判定结果的检测，将反应管放入Deaou-308C恒温荧光检测仪或其他荧光检测仪中，63℃恒温放置90min观察结果。
(5)结果判定：
①染色法：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕蚕卵微孢子虫。
②琼脂糖凝胶电泳法：取2μL反应后的产物，与1μL6×loadingbuffer和7μLddH2O混合，于2％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；若无大小不等的梯形条带出现，说明待测样品不含有家蚕蚕卵微孢子虫。
③实时荧光法：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，若扩增曲线扩增值未超过设定的阈值则为阴性。
图3所示为两条PCR引物检测健康蚕卵和添毒蚕卵的电泳图。其中，M:DL2000DNAMarker；1：添毒家蚕蚕卵DNA；2：家蚕微孢子虫DNA；3：正常家蚕蚕卵DNA；4：ddH2O。由附图3可见，结果显示纯化的家蚕微孢子虫基因组DNA和感染家蚕微孢子虫蚕卵DNA出现特异性扩增即septin1F/R扩增出大小为699bp的特异条带，而家蚕蚕卵DNA与ddH2O均无特异性扩增结果
图4至图6所示为家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品(重组质粒Septin1DNA-pMD)，图4为琼脂糖凝胶电泳法检测结果，图5为显色法检测结果，图5中1-4号显示为绿色，5-8号显示为橙色；图6为实时荧光法检测结果。其中，M:DL2000DNAMarker；1～7分别为稀释106-100copies/μl的重组质粒Septin1DNA-pMD；8：ddH2O。由附图4至6可见，sep11引物组在该扩增体系下分别可以检测到的最低重组质粒Septin1DNA-pMD浓度为103copies。
图7至9所示为家蚕蚕卵微孢子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微孢子虫DNA的灵敏性结果。图7为琼脂糖凝胶电泳法检测结果，图8为显色法检测结果，图8中1-5号显示为绿色，6-8号显示为橙色；图9为实时荧光法检测结果。其中M:DL2000DNAMarker；1-7分别为：:1.2×100ng/μl、1.2×10-1ng/μl、1.2×10-2ng/μl、1.2×10-3ng/μl、1.2×10-4ng/μl、1.2×10-5ng/μl、1.2×10-6ng/μl；8：ddH2O。由附图7至附图9可见，sep11引物组在该扩增体系下分别可以检测到的最低N.bDNA浓度为1.2×10-4ng/μL
图10至图12所示为家蚕蚕卵微孢子虫LAMP可视化快速检测方法检测不同的生产上蚕卵的检测结果。图10为琼脂糖凝胶电泳法检测结果，图11为显色法检测结果，图11中，1、2、6、7、8、9、11、13、14号显示为绿色。图12为实时荧光法检测结果。其中，M:DL2000DNAMarker；1、2、6、7、8、9、11、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。由附图10至附图12可见，sep11引物组在该扩增体系下可以检测到阳性样品及1、2、6、7、8、9、11、13号生产样品，即该方法检测结果正确效果好。
图13所示为用MEGA5.1软件构建家蚕微孢子虫Septins系统进化N-J树，结果显示Septin1基因在家蚕微孢子虫中特异性高。
SEQUENCELISTING
<110>华南农业大学
<120>适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及快速检测方法
<130>
<160>12
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>引物Septin1-F3
<400>1
aaggtgaaaggattaatgactt22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>引物Septin1-B3
<400>2
tcatataattcacttgctgtgta23
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>引物Septin1-FIP(F1c+F2)
<400>3
tccccatttaaacttcctaactcgattccatttttcgttgtttcatct48
<210>4
<211>46
<212>DNA
<213>引物Septin1-BIP(B1c+B2)
<400>4
aagttgataacacggaacactgtcaaaacacttaaatgtgtaccaa46
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>引物2F3
<400>5
tcaaaaataaggagagatcctac23
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>引物2B3
<400>6
tcactaagctgatttcgtact21
<210>7
<211>46
<212>DNA
<213>引物2FIP
<400>7
ctgtttctttcagaccattcacagtagatacaagagtccattgtct46
<210>8
<211>46
<212>DNA
<213>引物2BIP
<400>8
tctcttgtaaatattgtgcctgtcactttcagaattgttctctcga46
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>引物1F3
<400>9
gaagaatcaaaaataaggagagatc25
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>引物1B3
<400>10
tcactaagctgatttcgtact21
<210>11
<211>48
<212>DNA
<213>引物1FIP
<400>11
agaccattcacagttgaaggtatgctacttttgaagatacaagagtcc48
<210>12
<211>46
<212>DNA
<213>引物1BIP
<400>12
tctcttgtaaatattgtgcctgtcactttcagaattgttctctcga46

Claims (6)

1.一种适用于家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物，其特征在于，所述引物为Septin1-F3、Septin1-B3、Septin1-FIP和Septin1-BIP，其序列分别如SEQIDNO：1～4所示。
2.一种家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测样品模板DNA；
S2.基于权利要求1所述的检测引物，配置反应体系；
S3.在步骤S2所配置的反应体系使用的反应管中加入20μL密封液，在管盖内侧加入1μL显色液；
S4.反应：将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置60min；然后95℃，放置2min灭活；
S5.结果判定：
采用染色法进行结果判定：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕蚕卵微孢子虫；
或者采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定：取2μL反应后的产物，与1μL6×loadingbuffer和8μLddH2O混合，于2％琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条带，说明待测样品含有家蚕蚕卵微孢子虫；若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不含有家蚕蚕卵微孢子虫；
或者采用实时荧光法进行结果判定：若有“S”型扩增曲线且扩增值超过设定的阈值为阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阈值则为阴性。
3.根据权利要求2所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，S2所述的反应体系是采用优化后的25μL反应体系，分别如下：
采用染色法进行结果判定的25μL反应体系为：
采用实时荧光法进行结果判定25μL反应体系为：
采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定25μL反应体系为：
4.根据权利要求3所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，所述2×ReactionMix为反应缓冲液，组成为20mMTris-HCl，pH8.8；10mMKCl；2mMMgSO4；20mM(NH4)2SO4；0.1％TritonX-100；2.8mMdNTPs；1M甜菜碱；25mMMgCl2；
所述Septin1-F3/B3为5pmol/μL；所述Septin1-FIP/BIP为20～40pmol/μL；所述BstDNApolymerase为8U/μL。
阳性对照品为Septin1DNA-pMD重组质粒。
5.根据权利要求3所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，所述显色液为10000×SYBRGreenI；所述荧光指示剂为1×SYBRGreenI。
6.根据权利要求2所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，S1步骤所述提取待测样品模板DNA的方法包括以下步骤：
S01.取微孢子虫样品200μl，离心，弃上清；加50～100μlddH2O重悬得孢子液；
S02.吸取S01步骤重悬的孢子液至预冷的研钵中，液氮充分研磨；
S03.将S02步骤研磨后孢子放入1.5ml离心管中，加入400μlAP1和4μlRnase，涡旋混匀；
S04.S03步骤混匀后的溶液于65℃，孵育10min；
S05.加130μlAP2，混合后冰浴5min；然后在14000rpm条件下离心5min；
S06.吸取S05离心处理所得上清于QIAshredderspincolumn中的收集管，在14000rpm条件下，离心2min；
S07.将离心管中上清液移至新管，加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；
S08.将650μl混合液移至DneasyMinispincolumn中，4200rpm下离心1min；剩下的液体重复此步骤；
S09.将spincolum放入新收集管中，加入500ulbufferAW，4200rpm下离心1min；弃上清；
S010.再加入500μlAW，14000rpm下离心离心2min；
S011.移收集管至1.5ml或2ml离心管中；
S012.加入40μlbufferAE洗脱，室温放置5min；4200rpm下离心1min；
S013.加入40ulbufferAE洗脱，室温放置5min，4200rpm下离心处理1min；
S014.-20℃冰箱保存备用。
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