CN105671054A - 水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用 - Google Patents

水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用 Download PDF

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    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]

Abstract

本发明提供水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用，将OsWRKY104基因在野生型水稻中过表达，转化植株在长日照、短日照条件下均晚花，表明OsWRKY104基因对开花的时间起着重要的调节作用。本发明首次利用过表达水稻开花调节基因OsWRKY104调节植物光周期和开花时间。基因OsWRKY10有着重要的应用价值，过表达OsWRKY104可以明显抑制水稻开花，使开花时间延迟，生育期延长。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题及引种问题。

Description

水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用。
背景技术
植物的开花时间(作物中或被称作抽穗期)是指植物从营养生长到生殖生长的转变时间，它受到外部环境和内部发育因子的调控，且决定着植物分布及地区适应性。过去的十几年里，研究人员已在调控植物开花的分子机理方面取得了一定的进展，在模式植物拟南芥和水稻中，许多调控开花的基因已被鉴定并且其分子机理被详细描述。在拟南芥中，光敏色素和隐花色素能够感应光信号，并通过生物钟在长日照条件下促进开花。生物钟相关基因GI(GIGANTEA)在生物钟和CO(CONSTANS)之间起着关键的连接作用，并能够正向调控CO基因的表达，GI-CO-FT途径是长日照条件下调控拟南芥开花的核心机制。
水稻作为短日照模式植物，已有多个调控其开花的网络途径被报道。与拟南芥只有一个成花素基因FT(FLOWERINGLOCUST)不同，水稻进化了两个成花素基因，Hd3a(Headingdate3a)及其同源基因RFT1(RICEFLOWERINGLOCUST)，而在它们的上游，至少存在Ehd1(Earlyheadingdate1)和Hd1(Headingdate1)两条影响开花的分子途径。Hd1介导的途径与拟南芥中的CO同源，而Ehd1是水稻中所特有的。目前，已报道了大量的水稻基因通过以上两个途径调控水稻开花。最新研究表明，Hd3a与14-3-3蛋白形成复合体后转入细胞核内，与转录因子FD1结合形成三聚体FAC(florigenactivationcomplex)，诱导OsMADS15的转录，从而导致水稻开花。
发明内容
本发明的目的是提供水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用，其中基因OsWRKY104编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
前述的应用，所述调节植物开花时间具体为推迟植物开花时间。
本发明所述植物包括但不限于水稻。
前述的应用，通过在水稻中过表达基因OsWRKY104的CDS序列，从而推迟转基因水稻的开花时间及生育期。具体方法如下：
提取水稻(如野生型日本晴‘kitaake’)总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增获得如SEQIDNo.2所示的基因OsWRKY104的CDS序列，并将所述CDS序列构建到植物双元表达载体的Ubiquitin启动子的下游，转化水稻，筛选转基因水稻植株。
优选地，所述植物双元表达载体的出发载体为pCAMBIA1390。
PCR扩增所用引物为：
正向引物F5'-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGAAAATTCTCGAATCTTTTGGTC-3'(SEQIDNo.4)
反向引物R5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAGTCCCCATATGCATATTGGACTG-3'(SEQIDNo.5)
更优选地，本发明构建的表达载体的全序列如SEQIDNo.3所示。
携带有目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition)。
本发明中转化水稻的具体方法如下：采用农杆菌介导的方法，将构建的表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
优选地，利用潮霉素筛选转基因水稻植株。
将OsWRKY104基因在水稻野生型中过表达，转化植株在长日照、短日照条件下均晚花，表明OsWRKY104基因对开花的时间起着重要的调节作用。
本发明首次利用过表达水稻开花调节基因OsWRKY104调节植物光周期和开花时间。基因OsWRKY10有着重要的应用价值，过表达OsWRKY104可以明显抑制水稻开花，使开花时间延迟，生育期延长。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题及引种问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中表达载体pCAMBIA1390-WRKY104的结构示意图。
图2为本发明实施例3中过表达基因OsWRKY104水稻材料推迟水稻开花的表型(A)及WesternBlot检测转基因阳性水稻株系结果(B)。
图3为本发明实施例4中过表达基因OsWRKY104水稻材料的的开花时间比较。
图2和图3中，WT为野生型水稻，WRKY104-OX-1和WRKY104-OX-2为转基因株系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1水稻开花调节基因OsWRKY104的克隆及植物表达载体的构建
在水稻基因数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中找到OsWRKY104基因，根据其序列设计PCR扩增引物(SEQIDNo.4和5)，提取野生型日本晴‘kitaake’总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR获得基因OsWRKY104的CDS序列(SEQIDNo.2)。按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。将PCR产物纯化后克隆到带有Ubiquitin启动子的过表达载体pCAMBIA1390上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列，获得表达载体ubi:OsWRKY104(图1，pCAMBIA1390-WRKY104，SEQIDNo.3)。
实施例2转基因水稻植株的获得
取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将ubi:OsWRKY104转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和OD值为0.7的农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。共获得8个转基因植株。炼苗7d后转移至大田生长。
本实施例中涉及的培养基配方如下：
其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4-D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。
共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4-D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS(乙酰丁香酮)100～200μg/mL。
筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4-D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司)。
分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/LNAA+2.0mg/LKinetin(激动素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8后加入植物凝胶4g/L。
生根培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+MS无机+30g/L蔗糖+1g/L水解酪蛋白+植物凝胶4g/L。
实施例3转基因阳性株系的鉴定
为检测水稻开花调节基因OsWRKY104的CDS序列已在水稻中过表达，利用Flag抗体(购自Abmart公司，M20008L)对其在蛋白质水平上进行鉴定。
提取转基因水稻植株WRKY104-OX-1和WRKY104-OX-2的总蛋白，经过SDS-PAGE蛋白电泳后，进行免疫荧光反应，经WesternBlot鉴定结果表明转基因植株中存在目的蛋白，而野生型未杂出条带(图2)。
实施例4转基因水稻表型分析
与野生型水稻‘kitaake’相比，无论在长日照、短日照条件下，转基因株系WRKY104-OX-1和WRKY104-OX-2的开花时间明显推迟(图3)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用，其中基因OsWRKY104编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，调节植物开花时间具体为推迟植物开花时间。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过在水稻中过表达基因OsWRKY104的CDS序列，从而推迟转基因水稻的开花时间及生育期。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，提取水稻总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增获得如SEQIDNo.2所示的基因OsWRKY104的CDS序列，并将所述CDS序列构建到植物双元表达载体的Ubiquitin启动子的下游，转化水稻，筛选转基因水稻植株。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物双元表达载体的出发载体为pCAMBIA1390。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR扩增所用引物为：
正向引物F5'-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGAAAATTCTCGAATCTTTTGGTC-3'
反向引物R5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAGTCCCCATATGCATATTGGACTG-3'。
8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述转化水稻具体为：采用农杆菌介导的方法，将构建的表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，构建的表达载体的全序列如SEQIDNo.3所示。
10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，利用潮霉素筛选转基因水稻植株。
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