CN105658280B - 用于治疗胰岛素抵抗的包含hip/pap蛋白质或其一种衍生物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物，其用于治疗或预防非胰岛素依赖性受试者中的胰岛素抵抗的用途。

Description

用于治疗胰岛素抵抗的包含HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物 的组合物
现有技术
本发明涉及HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物用于减轻胰岛素抵抗或预防其发生的用途。本发明尤其旨在用于非胰岛素依赖性患者。
胰岛素抵抗定义为胰岛素对胰岛素敏感组织(骨骼肌、白脂肪组织、肝)的代谢效应下降。实际上，胰岛素抵抗(IR)本身通过胰岛素抑制肝葡萄糖产生(通过抑制糖原异生(neoglucogenesis)或糖原分解)的能力缺乏，通过肌肉组织摄取并因而利用葡萄糖的能力下降和通过导致游离脂肪酸血浆浓度升高的白脂肪组织脂解增加来表现。
胰岛素敏感性(或相反的胰岛素抵抗)与胰岛素分泌是两个因变量，其协同地相互作用以维持血糖内稳态。任何血糖变化导致胰岛素血症的变化，反之亦然。因此，任何胰岛素抗性的提高都通过胰岛素分泌的伴随性增加而得到补偿(然后观察到补偿性高胰岛素血症)，从而维持正常血糖(正常血糖量)或限制朝向高血糖的发展(即，避免正常血糖耐量朝向中度空腹血糖或葡萄糖不耐性的病理性升级)。从特定阈值开始，IR的发展导致因胰腺β胰岛素分泌功能衰竭而引起的逃逸现象(phenomenon of escape)，其潜在机制仍然是错综复杂的(线粒体功能的功能性和结构性丧失和/或β-胰腺细胞的凋亡，特别是与糖毒性相关的)。然后出现血糖的明显提高 (空腹血糖≥1.26g/l，即7mM)，因而采用术语糖尿病。当静脉血样的血糖超过该7mM的空腹阈值两倍时，据认为II型糖尿病确立。这反映出IR没有被胰岛素分泌补偿，证明存在“相对的”胰岛素缺乏。在这个阶段，通过保健和饮食措施或者药物治疗来启动胰岛素疗法作为IR治疗的补充可能是必要的。在晚期阶段，因为葡萄糖依赖性胰岛素分泌变得过低(或者甚至几乎为零)，所以建立多注射胰岛素疗法成为必要(参见Silvio E等，Diabetes Care 35:1364–1379，2012； Management of Hyperglycemia inType 2Diabetes:A Patient-Centered Approach.Position Statement of the AmericanDiabetes Association (ADA)and the European Association for the Study ofDiabetes (EASD))。
使用放射免疫法或ELISA法针对血浆或血清测定在空腹条件下人体中的胰岛素。正常(空腹)基础值在3.2至16.3mIU/l范围内，然后在75g口服葡萄糖负荷后20分钟时就上升至高达40mIU/l，并在葡萄糖摄食后2小时回到基础值。该测量与血糖的测量相结合使得可能估计胰岛素促进组织葡萄糖摄取并因此维持正常糖体内平衡的能力。
胰岛素敏感性(以及与之相关联的胰腺β分泌功能)可以使用最近改进为HOMA2(内稳态模型评估)的HOMA计算器软件(版本2.2.2，牛津大学糖尿病试验单位，可以自以下地址下载： http://www.dtu.ox.ac.uk/homacalculator/download.php)来进行估计。该HOMA2模型(Levy JC等，Diabetes Care，1998；21:2191-2192，也参见Wallace TM，Levy JC，Matthews DR.Diabetes Care，2004； 27(6):1487-95)是结构化计算机模型，其计算器是基于葡萄糖/胰岛素调控回路，并使得可能从葡萄糖和胰岛素(或C肽)的空腹血浆浓度的测量来测定个体的胰腺β功能(％β，即HOMA B)和胰岛素敏感性(％S)，因为对于％β和％S的每种组合，只存在一种对应的葡萄糖和胰岛素/C肽的组合。该计算器的验证已经通过将所用的等式与由使用为研究保留的侵入性方法(高胰岛素-正血糖钳夹或高血糖钳夹方法)的胰岛素敏感性和胰岛素分泌直接测量获得的值比较来进行。该计算器使得可能借助空腹血样来估计胰岛素敏感性和胰岛素分泌二者。
已经表明(Kahn SE等，Diabetes 1993)，在具有正常糖耐量和不同程度的肥胖或胰岛素抵抗的受试者中，β分泌功能随胰岛素敏感性而定量地改变。实际上在胰岛素敏感性(S)和β功能(β)之间存在双曲线相关性。y轴的值(β)乘以x轴的值(S)的乘积是常量，其对应于受试者的糖耐量。
因此，有可能通过根据下式计算HOMA-IR指数(Matthews等， 1985)来估计胰岛素抵抗：[(胰岛素血空腹(μU/ml)x血糖空腹(mM))/22.5]。在健康的、非胰岛素抵抗受试者中，空腹HOMA-IR指数一般接近于 1。
最后，有可能进行胰岛素耐量试验(ITT)，其在于监测在(腹腔、静脉内或皮下)注射相对于体重计算的一剂速效胰岛素(一般为0.75IU/kg体重)后的血糖。该技术尤其在动物中进行。在人体中，为了免除与低血糖相关的困难和风险，已经提出几种调整措施，从而形成改良的胰岛素耐量试验或短静脉内测试(short intravenous test)。该解释仅涉及在测试的前十五分钟期间血糖的降低速率，确定[(基础血糖G0-15分钟时的血糖G15)/G0]比率。该比率在健康的、非胰岛素抵抗患者中通常小于0.5。
血清C肽浓度是胰岛素分泌的标志，且反映胰腺β细胞产生胰岛素的能力。人体中，正常空腹值在0.27至1.43nmol/l(或0.8至 4.2ng/ml)的范围内。在患有牵涉到胰腺细胞的I型糖尿病或II型糖尿病的受试者中，C肽水平下降。在患有与内源性高胰岛素血症相关的胰岛素抵抗的患者中，该水平与正常水平相比是升高的。
胰岛素抵抗存在着许多可能的病因，且它们起因于几种可能组合的异常：腹部过重或脏性肥胖、长期久坐性格或身体活动不足、影响胰岛素受体后信号级联蛋白功能的遗传性或获得性异常、反调节激素的过量、卵巢功能障碍、各种药剂(例如，皮质激素疗法(corticotherapies)、性类固醇滥用)、妊娠、高分解代谢状况、营养不良、相对于大小来说低的出生体重和/或胎儿营养不良。已经特别地表明，肥胖是IR的主要因素，且后者在体重指数(BMI)上升时提高。特别是，当BMI超过40kg/m2时，IR几乎是确定的(Mericq 等)。此外，已经表明过量脂肪体重的分布也在IR的建立中起作用。实际上，腹性(或躯干性或脏性)肥胖被公认为是在全身尺度上IR 的病理生理学的基础。这解释了当脂肪体重的过量在于腹部时，BMI 比40kg/m2低得多或者甚至处于超重值的受试者具有胰岛素抵抗的可能性。有过心血管事件(心肌梗死、缺血性中风、下肢动脉病变) 的患者属于这个类别，所述事件导致发现在此之前未知的胰岛素抵抗状态。实际上，这些患有胰岛素抵抗的群体具有发生与常规风险因素(高LDL-胆固醇、吸烟、动脉高血压、2型糖尿病)无关的心血管事件的高风险。在这个群体中心血管事件的发生必然导致胰岛素抵抗的诊断以便对其进行治疗性处理。大多数其中存在胰岛素抵抗的情况普遍具有体脂质量储存分布的变化。脂肪组织实际上在以脂肪酸形式存储源自食物的过量能量中起到重要作用。在肥胖症中其质量的增加减少葡萄糖摄取并提高脂解。在易患IR的受试者中，观察到腹内脂肪组织的发展。所述组织自身在胰岛素抑制脂解的效果方面比皮下脂肪组织更不敏感。因此，内脏脂肪组织具有提高的脂解能力。过量地且以差调控的方式释放的脂肪酸通过腹膜循环、且然后通过门静脉和然后通过肝脏回收。这些脂肪酸流在胰岛素抵抗受试者中很大程度上参与非酒精肝脂肪变性的病理生理学。脂肪变性肝将所储存的脂质以甘油三酯(VLDL-甘油三酯颗粒)的形式部分地输出到血流中。这些甘油三酯然后可以被内皮脂蛋白脂肪酶 (LPL)水解，由此使得骨骼肌和胰岛摄取这些脂肪酸成为可能。因此出现多组织的异位脂质沉积，其本身参与降低胰岛素的作用和/或减少胰岛素分泌。
IR因此与各种病理性状况如血脂异常和/或动脉高血压相关联。与IR相关联的表型因此被认为在动脉粥样化心血管疾病的发展中是重要作用因素。
现在胰岛素抵抗本身代表治疗靶点。因此，在心血管事件发生风险的情况中，虽然推荐的是控制常规心血管因素(动脉高血压、致动脉粥样化血脂异常、吸烟、2型糖尿病)，但也越来越多地建议对胰岛素抵抗直接进行干预。
此外，目前认为IR引起的慢性胰岛素过多症可能促进细胞有丝分裂，从而解释了在胰岛素抵抗群体中发生癌症的极大风险。
因此，看来十分重要的是开发使得可以特异性地靶向于胰岛素抵抗而非胰岛素减少症和/或功能性胰腺β缺陷的治疗方法来治疗患者，特别是II型糖尿病上游，且更特别地是非胰岛素依赖性患者。
已知的口服抗糖尿病药，如降血糖磺胺类或磺脲类和格列奈类 (glinides)，通过刺激胰岛素分泌而专门地作用于内分泌胰腺的β细胞，但它们对于胰岛素敏感性没有直接效果。
目前已知使得可能特异性地减轻胰岛素抵抗(而不影响胰岛素分泌)的化合物，如噻唑烷二酮类或格列酮类，或者在较小程度上，二甲双胍，其分别作用于脂肪和肝胰岛素抵抗。然而它们的使用是困难的，因为在某些患者(消化不耐(digestive intolerance)、妊娠、肾或心脏或肝衰竭，等等)中使用它们时存在相当程度的副作用或困难。
因此需要用于治疗、减轻或预防非胰岛素依赖性或非胰岛素减少的患者中的胰岛素抵抗的新型化合物，这尤其是因为格列酮类在法国不再销售，使得胰岛素增敏型降血糖药物的种类减少至只有二甲双胍。
申请人已经证实HIP/PAP蛋白质出人意料地使得可能特异性地减轻胰岛素抵抗。因此，HIP/PAP蛋白质可以有利地用于治疗、限制或预防IR及相关的症状和病症，特别是在非胰岛素依赖性患者中。
HIP/PAP蛋白质因其对肝细胞的抗细胞凋亡和促有丝分裂活性而为人所知(US13/032,521，WO2004/112824，Simon等，FASEB J. 2003年8月；17(11):1441-50)。
还已经证明源自Reg IIIa家族(HIP/PAP)的15-氨基酸的肽， HIP(HumanproIslet Peptide)肽，对胰岛具有再生活性并因此刺激胰岛素产生(US2010/0093605)。基于这些结果，已经提出使用所述肽和Reg IIIa家族蛋白质的衍生物来严格地治疗胰岛素依赖性患者(患有I型糖尿病的或者患有失代偿性II型糖尿病的患者)。
就申请人所了解，没有现有技术的文献描述HIP/PAP蛋白质对胰岛素抵抗的效果，以使其用于非胰岛素依赖性受试者中。
发明内容
本发明因此涉及HIP/PAP蛋白质，或其一种衍生物，及其在非胰岛素依赖性受试者中治疗或预防胰岛素抵抗的用途，且特别是限制和/或减轻胰岛素抵抗或者预防其在处于风险中的群体中出现。本发明的主题因此特别是HIP/PAP蛋白质，或其一种衍生物，用于在非胰岛素依赖性受试者中治疗或预防外周组织的胰岛素抵抗的用途。
根据各种实施方式，本发明的目标受试者基于HOMA2模型估计具有大于或等于60％的胰腺β功能(％β，即：HOMA B)和/或小于6的HOMA-IR。
特别是，HIP/PAP蛋白，或其一种衍生物，可以旨在用于具有小于125mg/dl，特别是小于120mg/dl，且更特别的是小于110mg/dl 的空腹血糖的受试者。
在某些实施方式中，受试者在口服葡萄糖耐量试验后2h时具有小于200mg/dl，特别是小于180mg/dl，且更特别地是小于140mg/dl 的血糖。
在某些实施方式中，受试者具有正常的糖耐量和/或具有正常的空腹血糖。
本发明也获得用于增加肌肉发育、刺激瘦体重增长和预防或限制肌肉分解代谢和蛋白质营养不良，用于预防或治疗血脂异常和特别是高胆固醇血症，以及用于预防或治疗动脉粥样硬化(特别是冠状动脉或脑动脉疾病)和下肢动脉病变的应用。
因此，本发明也将有利地旨在用于患有选自脏器过重、肥胖症、代谢综合征、多囊卵巢综合征、饮食失调、丙型肝炎、肝脂肪变性和肌肉减少症中的至少一种病症的受试者，且更特别地用于患有选自脏器过重、肥胖症、雄激素过多症、饮食失调、肌肉减少症、分解代谢过度和营养不良中的至少一种病症的受试者。
根据本发明的HIP/PAP蛋白质，或其一种衍生物，也旨在用于治疗与老化相关的胰岛素抵抗。在本发明的某些实施方式中，非胰岛素依赖性受试者因此是老年受试者。
在某些实施方式中，HIP/PAP蛋白质的衍生物特征在于它们包含具有与由选自序列SEQ ID No 1至4的氨基酸序列组成的多肽至少90％的序列同一性的氨基酸序列。所述衍生物序列与序列SEQ ID No.4相差至少一个氨基酸。
最后，本发明涉及包含有效量的根据本发明所限定的HIP/PAP 蛋白或其一种衍生物的组合物，作为与至少一种生理学上可接受的赋形剂的混合物，其用于在非胰岛素依赖性受试者中治疗或预防胰岛素抵抗。
根据本发明的组合物可以包含与用于调控血糖内稳态的另一活性剂组合的有效量的HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物。
本发明的各种实施方式可以任选地彼此组合地采用。
发明详述
申请人已经证实，在胰岛素耐量试验(或ITT)过程中腹膜内施用速效胰岛素后，对非胰岛素依赖性但患有糖内稳态失调的受试者施用HIP/PAP蛋白质导致HOMA-IR指数非常明显地降低以及外源胰岛素降血糖效果的提高，由此导致血糖的更大下降。该效应表明，施用HIP/PAP蛋白质导致胰岛素抵抗的特异性减轻。这些效果没有伴随胰岛素分泌的增加，无论是在基础水平还是在OGTT测试过程中。这些结果因此说明了HIP/PAP蛋白质对胰岛素抵抗降低(或者对胰岛素敏感性提高)的特异性效果，但对胰岛素分泌没有影响。
本发明的受试者分类和治疗性应用：
本发明涉及HIP/PAP蛋白质，或其一种衍生物，其用于在非胰岛素依赖性受试者中治疗或减轻胰岛素抵抗和外周组织的抗性，或者预防、限制或预防它们的发生(以及相反地用于提高胰岛素敏感性，或者限制或预防胰岛素敏感性的降低)。
有利地，HIP/PAP蛋白质也将用于刺激或增加靶组织的葡萄糖组织同化作用。
根据本发明，受试者由哺乳动物组成，特别是人类、家养和农场动物以及动物园动物和参与运动的动物(animals involved in sport)，如狗、猫、马、小牛(calves)、奶牛、肉牛(steers)、猪、兔等。更特别地是，本发明旨在用于人类。作为对应用的各种参数的限定，本申请中给出的值是参照在健康良好人类中发现的平均值而提供。
术语“非胰岛素依赖性受试者”旨在指其血糖内稳态的维持不需要施用胰岛素的受试者。更特别地，非胰岛素依赖性患者没有进行使用胰岛素分泌剂家族的口服抗糖尿病药的任何治疗。举例来说，胰岛素分泌剂包括特别是降血糖磺胺类或磺脲类和格列奈类。在这类患者中，实际上保持胰腺β分泌功能(不存在内源性胰岛素减少)，以使得不施用外源胰岛素疗法。
本发明包含几种如下限定的实施方式，其可彼此结合采用。
特别是，本发明针对基于HOMA2模型估计具有大于或等于 60％，特别是大于或等于70％，大于或等于75％，或者大于或等于 80％的胰腺β功能(％β，即HOMA B)的受试者。该值不可大于100％。这种受试者还具有小于6，更特别地是小于或等于5，特别是小于或等于4.5的HOMA-IR。根据本发明，该HOMA-IR指数还大于或等于0.8，和特别是大于或等于0.9。例如，HIP/PAP蛋白质可施用于具有在0.8至5，或者0.9至4.5，更特别地是0.9至3范围内的HOMA-IR指数的受试者。
本发明因此可应用于具有小于126mg/dl的可变空腹血糖的个体。特别是，本发明并非旨在用于糖尿病。
本发明的受试者因此可具有正常的血糖(具有正常空腹血糖的受试者)，即小于110mg/dl空腹血糖，优选小于或等于100mg/dl，特别是在80至100mg/dl的范围内，或者小于或等于95mg/dl，以及特别是在80至95mg/dl空腹血糖的范围内。根据另一方面，本发明的受试者可具有小于125mg/dl空腹血糖的中度空腹高血糖，特别是小于或等于120mg/dl，特别是在110至125mg/dl范围内，更特别地是110至120mg/dl空腹血糖的范围内。
在某些实施方式中，本发明的具有中度空腹高血糖的受试者也可以是葡萄糖不耐受的，并因此在75g口服葡萄糖负荷的第2小时具有小于200mg/dl、和特别是在140和200mg/dl之间的血糖。对于在75g口服葡萄糖负荷的第2小时小于140mg/dl的值，一般认为糖耐量是正常的。
根据本发明的用于其用途的HIP/PAP蛋白质也特别地旨在用于如所定义的处于发生胰岛素抵抗的风险中的受试者，即患有，例如，至少一种如下有利于胰岛素抵抗发生的病理性状况：过重，特别是脏器过重或脏性肥胖(特别是脏性肥胖)，体脂质量分布异常如获得性或先天性的、部分或总体脂肪萎缩，获得性或先天性的、部分或总体脂肪增生，作为遗传性IR综合征(如Dunningan综合征、
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综合征、Barraquer-Simons综合征、Launsois-Bensaude综合征或近端对称性脂肪过多症、Rabson-Mendenhall综合征)的部分的体脂质量分布异常，雄激素过多症，饮食失调，肌肉质量和强度降低(换句话说是肌肉减少症)，长期久坐性格或身体活动不足，影响胰岛素受体后信号级联的蛋白质功能的遗传性或获得性异常，反调控激素的过量，卵巢功能障碍，各种药剂(例如，皮质激素疗法或内源性皮质醇分泌的破坏、性类固醇滥用、抗逆转录病毒药物)，揭示胰岛素抵抗的心血管事件，分解代谢过度状况，相对于大小来说低的出生体重和/或胎儿营养不良。
腹部脏器过重是指男性(android)类型的分布，其中过量脂肪位于腹部器官的水平、位于腹壁上和有时位于上背部。过重(或超重) 和肥胖通常通过考虑受试者重量和身高的体重指数(BMI)来定义，以将受试者的肥胖进行分类。以kg/m2表示，BMI对应于体重除以身高的平方。根据WHO标准，对于成年人类，18.5和25kg/m2之间的BMI相当于“正常”肥胖，即，与发病率负担增长(对于健康的不利影响)无关的肥胖。过重特征为在25和30kg/m2之间的BMI，而肥胖特征为超过30kg/m2的BMI。
根据本发明的一个优选实施方式，HIP/PAP蛋白质将用于在非胰岛素缺乏和/或葡萄糖不耐受和/或正常血糖受试者中预防、特别是减轻或限制胰岛素抵抗发展。这种受试者可以具有上文报告的至少一种风险因素。
申请人还已证实HIP/PAP蛋白质对血脂异常具有明显效果，且使得可以特别地在正常受试者或其体重超过正常(过重或肥胖)的受试者中降低血清胆固醇和/或甘油三酯浓度。HIP/PAP蛋白质因此将有利地用于表现出血脂异常并且特别地高胆固醇血症(血清胆固醇水平大于或等于2g/l)和/或高甘油三酯血症(血清甘油三酯水平大于或等于2.3mmol/l)的受试者。HIP/PAP蛋白质也根据本发明用于经历心血管事件的患者或者患有动脉粥样硬化、冠状动脉疾病和/ 或下肢动脉病变的患者。
根据某些实施方式，根据本发明的HIP/PAP蛋白质因此用于治疗或减轻高血脂，且特别是高胆固醇血症，或者用于预防或限制其发生。更特别地，根据本发明的HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物的使用使得可能降低血清LDL-胆固醇水平或者限制、减少或防止其提高。本发明的HIP/PAP蛋白质也适合于治疗和预防相关的病理性状况，如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病和下肢动脉病变。
最后，申请人已经证实HIP/PAP蛋白质在正常受试者中，如在超重和/或食用高脂肪饮食的受试者中一样，导致脂肪体重/瘦体重比率的下降。更特别地，使用HIP/PAP蛋白质的治疗在超重和/或食用高脂肪饮食的个体中导致与朝向瘦体重增加的趋势相关的脂肪体重的明显下降。在正常受试者中，施用HIP/PAP导致与朝向脂肪体重下降的趋势相关的瘦体重的明显增加。该效应与体重减轻不相关。这些结果证实，如在超重受试者中一样，通过正常受试者中降低脂肪体重/瘦体重比率，HIP/PAP影响能量代谢并改变身体组成。最后，已经表明HIP/PAP蛋白质特别地增加骨骼肌的葡萄糖同化作用，特别是在食用高脂肪饮食和/或超重的受试者中。
本发明的组合物也特别地可用于治疗或预防外周组织的胰岛素抵抗。术语“外周组织”特别地旨在表示肝、脂肪组织和骨骼肌组织。这些组织的胰岛素敏感性提高尤其导致它们同化葡萄糖的能力的改善。
提高肌肉中的葡萄糖同化作用促进肌肉发育。此外，已知脂肪体重/瘦体重比率的降低有利地影响能量代谢的病理性状况如代谢综合征、葡萄糖不耐受性、多囊卵巢综合征、雄激素过多症或糖尿病的发展。
本发明因此也涉及HIP/PAP蛋白质用于降低脂肪体重/瘦体重比率的用途；它应用于特别是老年受试者和/或患有能量代谢失调的受试者和/或营养不良的和/或患有肌肉减少症的受试者和/或分解代谢过度的受试者和/或有重大手术史(如肥胖手术和/或肠旁路术和/或手术后胰腺外分泌的减少和/或肠切除术和/或手术后人工营养支持进食的需要)的受试者。术语“老年受试者”旨在表示特别是年龄超过60岁的受试者，特别是年龄超过70岁的受试者，和更特别地是年龄在75岁及以上的受试者。在这些受试者中，HIP/PAP蛋白质也可用于增加合成代谢和肌肉发育、预防或治疗营养不良(特别是蛋白质营养不良)、刺激瘦体重增加和预防和/或限制肌肉分解代谢或肌肉减少症，特别是在老年受试者中。有利地，根据本发明的HIP/PAP 蛋白质或其一种衍生物将用于治疗、减轻或限制与老年受试者的老化或者与蛋白质营养不良相关的肌肉萎缩或肌肉减少症。
HIP/PAP蛋白质也有利地用于治疗或预防营养不良或分解代谢过度。例如，HIP/PAP蛋白质可以与受试者BMI无关地(即在具有正常体重或者表现出过重或肥胖的受试者中)施用于营养不良的受试者或者处于分解代谢过度状态中或具有这样的风险的患者。实际上，营养不良也影响超重或肥胖受试者。
本发明因此由于其用于治疗与老化相关的胰岛素抵抗的用途而受到关注。根据本发明的HIP/PAP蛋白质因此有利地用于特别是老年受试者，和/或用于增加肌肉发育，和/或刺激瘦体重增长和/或预防和/或限制肌肉分解代谢和营养不良，特别是蛋白质营养不良。
HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物也可以以组合物的形式使用，所述组合物包含有效量的所述蛋白质或其一种衍生物和至少一种生理学上可接受的赋形剂。
根据本发明的某些实施方式，HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物可以与至少一种用于治疗胰岛素抵抗或相关失调的其他治疗化合物联合施用。
本发明也涉及在非胰岛素依赖性受试者中治疗胰岛素抵抗的方法，其包括施用HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物。
最后，本发明涉及HIP/PAP蛋白或其一种衍生物用于生产在非胰岛素依赖性受试者中治疗胰岛素抵抗的药物的用途。
根据本发明的HIP/PAP蛋白质及衍生物：
根据本发明的HIP/PAP蛋白质由序列SEQ ID No.4的蛋白质组成。
根据本发明的HIP/PAP蛋白质衍生物包含含有氨基酸序列SEQ ID No.1或由其组成的蛋白质。氨基酸序列SEQ ID No.1对应于序列SEQ ID No.4的HIP/PAP蛋白质，其中所述蛋白质的N端26个氨基酸的信号肽已被删除。
根据本发明的另一个实施方式，HIP/PAP蛋白质的衍生物包含氨基酸序列SEQ IDNo.2或由氨基酸序列SEQ ID No.2组成。氨基酸序列SEQ ID No.2对应于HIP/PAP蛋白质的短形式，且其与氨基酸序列SEQ ID No.1相比删除了N端位置的11个氨基酸的前肽。
在一个替代实施方式中，HIP/PAP蛋白质的衍生物包含序列SEQ ID No.3或由其组成。序列SEQ ID No.3对应于甲硫氨酸添加到N 端位置的序列SEQ ID No.1。序列SEQ IDNo.3的HIP/PAP衍生物更特别地在实施例中举例说明，且也称为rcHIP/PAP或ALF5755。该衍生物可以特别地在大肠杆菌细胞中重组产生。可以切除12个氨基酸的N端前肽(11个氨基酸的前肽加上附加的甲硫氨酸)，以获得HIP/PAP蛋白质的短形式(SEQ ID No.2)。
根据本发明，HIP/PAP蛋白质或其衍生物的短或长形式可以无差别地(indifferently)使用。
术语“HIP/PAP蛋白质的衍生物”也旨在表示序列SEQ ID No.4 的HIP/PAP蛋白质的生物活性衍生形式、或者信号肽已从其删除的形式、或分别序列SEQ ID No.1或2的短形式。术语“生物活性的”旨在表示HIP/PAP蛋白质的衍生物具有与HIP/PAP蛋白质或者序列SEQ ID No.1或2形式相同的生物活性。
举例来说，当其以有效量施用时(参见实验部分所阐明的方案)， HIP/PAP蛋白质的生物活性衍生物具有以下活性中的至少一种：
-如实施例所阐明的，在ob/ob小鼠或已接受高脂肪饮食的小鼠中，在OGTT测试过程中HOMA-IR指数的降低。
-相对于对照动物，在葡萄糖耐量试验过程中血糖的降低。
-脂肪体重的降低和/或瘦体重的增加。
-葡萄糖肌肉吸收的增加。
本发明还涉及根据本发明的HIP/PAP蛋白质衍生物，其对应于具有与选自由氨基酸序列SEQ ID No.1至4形成的组的蛋白质至少 90％的同一性的蛋白质。
应理解，与参比蛋白具有至少90％同一性的蛋白质将具有与所述参比蛋白的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
为了出于本发明的需要确定两个氨基酸序列的百分同一性，对序列进行比对以便允许最佳对比。可以将空位引入到待比对序列中的一个或另一个中以使得能够进行最佳比对，并且可以对于对比忽略非同源序列。可以如D.Voet和J.G.Voet,Biochimie(第2版，DeBoeck&Larcier，2005，第7.4节，第B段)的书中所述，获得所比较的两个氨基酸序列的百分同一性。以如下参数使用CLUSTAL W 软件(1.82版)进行比对：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2) ALIGNMENT＝"完全"；(3)OUTPUT FORMAT＝"aln w/numbers"； (4)OUTPUT ORDER＝"比对的"；(5)COLOR ALIGNMENT＝"无"； (6)KTUP(字长)＝"默认"；(7)WINDOW LENGTH＝"默认"；(8) SCORE TYPE＝"百分比"；(9)TOPDIAG＝"默认"；(10)PAIRGAP＝ "默认"；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE＝"无"；(12) MATRIX＝"默认"；(13)GAP OPEN＝"默认"；(14)END GAPS＝"默认"；(15)GAP EXTENSION＝"默认"；(16)GAP DISTANCES＝"默认"；(17)TREE TYPE＝"进化分枝图"以及(18)TREE GRAPH DISTANCES＝"隐藏"。
HIP/PAP蛋白质的生物活性衍生物包括包含与HIP/PAP蛋白质或与氨基酸序列SEQID No.1至4之一充分同源的氨基酸序列的肽，其包含与对应的参比序列相同数目的氨基酸并具有相同的生物活性。
HIP/PAP蛋白质的生物活性衍生物也包括包含与HIP/PAP蛋白质或与氨基酸序列SEQ ID No.1至4之一充分同源的氨基酸序列的肽，其包含比对应的参比序列更多数目的氨基酸并具有相同的生物活性。
除哺乳动物中存在的HIP/PAP蛋白质的生物活性部分的天然等位基因变体以外，本领域技术人员将理解，另外的变化可以通过突变引入序列SEQ ID No.1至4中，其不改变所述变体的生物活性。特别是，可以将非必需氨基酸的置换引入对应于HIP/PAP蛋白质或对应于序列SEQ ID No.1至3的衍生物的序列中。“非必需”氨基酸是当其相对于参比序列，且特别是相对于(序列SEQ ID No.4的) 野生型HIP/PAP蛋白质改变时，不改变生物活性的氨基酸。相反，“必需”氨基酸由在发生变化时改变蛋白质或衍生肽的生物活性的氨基酸组成。
在某些实施方式中，HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物可以通过非共价键与非HIP/PAP部分进行结合或组合。例如，HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物可以与脂质体颗粒结合。取决于脂质体的类型或生产方法，HIP/PAP蛋白质或其衍生物可以结合到脂质体表面或者被包封在所述脂质体内。
HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物也可以通过共价键与非 HIP/PAP部分进行结合。这类非HIP/PAP部分可选自蛋白质或非蛋白质化合物，例如聚乙二醇，从而形成聚乙二醇化的HIP/PAP衍生物。
根据本发明的HIP/PAP蛋白质衍生物也包括仅在施用于患者时成为生物活性的衍生物。
最后，HIP/PAP蛋白质衍生物也包括嵌合蛋白或融合蛋白。这类蛋白质与非HIP/PAP多肽融合。后者可与N或C端部分融合。典型地，HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物可在它们的C端部分的水平与GST序列融合，以利于重组蛋白质的纯化。
在本发明的某些实施方式中，HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物在细菌或包括昆虫和哺乳动物细胞的动物细胞中依照本领域技术人员已知的技术重组产生。
在其他实施方式中，如上所述的HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物可以通过已知的纯化技术从细胞或组织中分离。
HIP/PAP蛋白质及其衍生物也可通过化学合成产生。
在本文的其余部分中，术语“HIP/PAP蛋白质”将涵盖如上所述的 HIP/PAP蛋白质自身及其衍生物。
根据本发明的组合物：
本发明还涉及包含前述HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物的组合物，其用于在非胰岛素依赖性患者中治疗、减轻、限制或预防胰岛素抵抗的发生。
这种组合物也可用于在患有能量代谢失调的患者中提高瘦体重/ 脂肪体重比率。
根据各种实施方式，本发明对于治疗前文定义的受试者特别有利。
这种组合物包含有效量的HIP/PAP蛋白质和至少一种生理学上可接受的赋形剂，特别是药学上可接受的赋形剂。术语“生理学上可接受的赋形剂”旨在表示对于其以所使用的剂量和浓度施用的受试者无毒的赋形剂。药学上可接受的赋形剂相当于本领域技术人员在药物制备的情况下常规使用的赋形剂。赋形剂根据期望的药物形式和施用方式选自本领域技术人员已知的常见赋形剂(参见 Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A ed.，1980)。
举例来说，按照治疗适应症和HIP/PAP蛋白质或其衍生物，根据本发明的组合物可包含：
a)HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物；
b)缓冲剂，其能够将pH维持在最大稳定范围内，优选1至9，更特别是4至8，和甚至更特别是6至7.5；
c)洗涤剂或表面活性剂，其使蛋白质或多肽稳定化以对抗由搅拌引起的聚集；
d)等渗剂，
e)防腐剂，其选自例如苯酚类、苄醇类、benzothelium卤化物类和氯化物类；
f)水。
如果所用的洗涤剂或表面活性剂是非离子型的，其可选自聚山梨醇酯类、PLURONIC TM、聚乙二醇(PEG)或泊洛沙姆类。
等渗剂使得可以维持组合物的等渗性，并且通常包括单独或组合使用的多元醇类如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。或者，氯化钠和/或任何其他无机盐可用作等渗剂。
取决于期望的pH，缓冲剂可以是例如乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐缓冲剂或任何其他无机缓冲剂。
苯酚、苄醇、benzothelium卤化物和氯化物类型的防腐剂是已知的抗微生物剂。典型的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苯酚、丁基或苄基醇类、烷基尼泊金类如甲基或丙基尼泊金、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间-甲酚。
另外的赋形剂也可包括抗氧化剂如抗坏血酸和甲硫氨酸，螯合剂如EDTA，糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇，等等。
HIP/PAP蛋白质或其衍生物可以是药学上可接受的盐的形式。这旨在表示从药学上可接受的无毒性酸或药学上可接受的无毒性碱制备的盐，包括有机和无机的盐和酸。举例来说，可以提及碱金属盐(钠和钾盐)、碱土金属盐(钙和镁盐)、铵盐、有机碱的盐(吡啶或三乙胺盐)、无机酸的盐(盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐)和有机酸的盐(乙酸盐、草酸盐、对-甲苯磺酸盐)。
HIP/PAP蛋白质的施用方式：
根据一个优选实施方式，HIP/PAP蛋白质以有效量施用，即获得本发明的预期效果所需要的量。这样的HIP/PAP蛋白质的量通常根据所针对的病理性状况和所要治疗的受试者经验性地确定。有效量也取决于所设想的施用方式、所施用的化合物(HIP/PAP蛋白质或衍生物)及其制剂。确定用于获得最大疗效的有效量所需要的调整符合于临床医师常规的技能。
从实施例中例示的结果开始，HIP/PAP蛋白质的有效量在0.1μg/ 日/kg体重和约100mg/日/kg体重之间。虽然在某些实施方式中， HIP/PAP蛋白质的有效量可以达到10mg/kg以上，但是根据本发明的HIP/PAP蛋白质的有效量一般小于5mg/kg体重，其包括小于4.5mg/kg、4mg/kg、3.5mg/kg、3mg/kg、2.5mg/kg或2000μg/kg的量。更特别地，根据本发明的HIP/PAP蛋白质的有效量包括相对于体重的以下量：至少1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、 7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、 30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、 100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、 400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、 900μg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg或更高。
根据特定实施方式，HIP/PAP蛋白质按照在10和5000μg/kg之间，优选在100和2000μg/kg之间的剂量施用。
在小鼠中，实验方式确定的典型有效剂量在10和2000μg/kg体重之间，更特别地在150和1500μg/kg体重之间。物种间剂量适应性调整可以根据从现有技术已知的方法进行，例如Mordenti等， Pharmaceut.Res.8，第1351页，(1991)的论文中所述的。传统上，在正常体重的成年小鼠中，有效剂量在1和100μg/日之间。传统上，在人类中，HIP/PAP蛋白质的有效剂量在体重约70kg的患者中开始于约3mg，即约40μg/kg体重。
在用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、外部、局部、气管内、鼻内、经皮或直肠施用的本发明药物组合物中，活性成分 (HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物)可以以作为与动物和人类的(例如上文所述的和/或常规的)药物赋形剂的混合物的单位施用形式施用来预防或治疗胰岛素抵抗。
优选施用方式是经肠的(特别是口服)和静脉内途径。举例来说，本发明的组合物可以连续地或通过推注而静脉内施用，或者每日口服施用。
有利地，根据本发明的组合产品口服施用。用于口服施用的适合形式是，例如，片剂、胶囊、锭剂、散剂、颗粒剂、冻干剂、口服溶解物和糖浆剂。片剂、散剂、颗粒剂、冻干剂、口服溶解物和糖浆剂构成目前优选的适合于口服施用的药物或化妆品形式。片剂或胶囊可以具有不同性质，速释、控释或迟释，且任选地是泡腾或口分散形式。胶囊制剂是通过将活性成分(i)或(ii)与稀释剂混合，并将获得的混合物倾倒至软或硬胶囊中获得。
用于口服施用的形式，如胶囊或片剂，是本发明的有利实施方式。更特别地，HIP/PAP蛋白质的单位施用形式，例如胶囊、片剂、小袋或用于口服混悬剂的安瓿，典型地包含在0.1至200mg和更特别地是50至100mg范围的量的HIP/PAP蛋白质或其任意一种衍生物。
糖浆剂或酏剂形式的制剂可以例如含有HIP/PAP连同合适的甜味剂、抗菌剂、防腐剂、调味剂或染料。
水可分散的散剂、冻干剂或颗粒剂可作为与分散剂或润湿剂或助悬剂，以及类似地与增味剂或甜味剂的混合物包含HIP/PAP。
根据本发明，适于口服摄入形式的HIP/PAP蛋白质也可能旨在用作食物补充剂。这样的制剂特别适合于在表现出分解代谢过度状态或患有肌肉减少症的处于风险中的受试者和/或营养不良患者中预防胰岛素抵抗的情况中的用途。这样的制剂也适合致力于提高个体的瘦体重/脂肪体重比率而使用HIP/PAP。
HIP/PAP蛋白质可在体内施用前灭菌。灭菌可在冻干或重构 (reconstitution)之前或之后通过无菌滤膜上的过滤实现。全身施用的HIP/PAP蛋白质可以有利地在溶液中冻干或储存。冻干形式的 HIP/PAP蛋白质一般与使得能够在使用时用适合的稀释剂重构的赋形剂组合配制。
HIP/PAP蛋白质可以以一次摄入或者以分次的方式(例如每日2 至3次)每日施用直至获得期望的疗效。它也可以长期施用，从而预防或限制胰岛素抵抗的发生，例如在处于风险中的受试者中，其具有有利于胰岛素抵抗发生的生理性或病理性状况。
HIP/PAP蛋白质也可以以疗程的形式施用，例如15日至3个月范围的疗程，任选地以确定的剂量和时间间隔重复1至6次。这些施用方式特别地指示用于在表现出分解代谢过度状态或患有肌肉减少症的处于风险中的受试者和/或营养不良患者中预防胰岛素抵抗的情况中。
根据本发明的HIP/PAP蛋白质也可在多疗法的情形下与用于治疗胰岛素抵抗或相关病症如血脂异常或动脉粥样硬化的其他化合物组合。
根据本发明的HIP/PAP蛋白质也可与保健和饮食措施如低热量和/或低脂肪饮食以及身体活动的增加组合施用。
根据本发明的用途：
本发明也涉及如前所述的HIP/PAP蛋白质或其一种衍生物在如前文所述的各种实施方式中所限定的非胰岛素依赖性受试者中治疗、减轻、限制或预防胰岛素抵抗发生的用途。
根据本发明的特定实施方式，HIP/PAP蛋白质用于如前所述的受试者中。
在本发明的某些实施方式中，HIP/PAP蛋白质的衍生物特征在于其包含与由选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
附图说明
图1：ALF5755处理(■)与安慰剂(●)相比，对胰岛素抵抗的作用。图1A：在处理2周后，ob/ob小鼠中血糖耐量试验(ITT) 过程中血糖(mg/dl)的变化。图1B-C：在处理4周后HFD小鼠中， OGTT过程中胰岛素血(ng/ml)的变化(B)以及HOMA-IR指数的变化(C)。图1D：用ALF5755(白色条)或安慰剂(黑色条)处理4周的小鼠中的葡萄糖肌肉摄取。
图2A：ALF5755处理与安慰剂相比，对瘦体重(图2B和2D) 和脂肪体重(图2A和2C)的作用，小鼠接受HFD饮食(2A、2C) 和对照饮食(2B、2D)。图2E-F：接受HFD饮食(2E)或对照饮食(2F)的小鼠的[脂肪体重/瘦体重]比率。
图3：ALF5755处理(白色条)与安慰剂(黑色条)相比，对接受HFD饮食(3A)或对照饮食(3B)的小鼠的血清脂质分布的作用。图3C：接受HFD饮食的小鼠的血清肝评估(serumhepatic assessment)。
实施例
材料和方法：
动物模型
使用2种不同的胰岛素抵抗和糖尿病模型，ob/ob模型和高脂肪饮食(HFD)模型。
ob/ob模型是由瘦素基因中的无义突变导致的II型糖尿病的遗传模型，该无义突变导致这些动物中不存在瘦素。这种小鼠表现出胰岛素抵抗综合征以及高胰岛素血、肥胖、高血糖和高血脂(Pelleymounter MA，Cullen MJ，Baker MB，Hecht R，Winters D， Boone T等，Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice，Science 1995；269：540-3)。如通常所描述的，ob/ob 小鼠表现出高血糖(248+/-14mg/dl)以及重度(major)高胰岛素血 (9.5+/-0.9ng/ml)。
HFD模型是由饮食的脂质富集导致的II型糖尿病模型。在常规饮食(对照饮食＝CTD)中，热量摄入为3200kcal/kg(21.4％蛋白质、 5.1％脂质、47.1％碳水化合物)。对于HFD饮食，热量摄入为4655 kcal/kg(17％蛋白质、27.5％脂质、37.5％碳水化合物)。从第4周开始，HFD动物的体重逐渐增长而变得明显不同于接受对照饮食的动物的体重。在10周的HFD后，动物的平均体重比食用对照饮食的动物高约30％。HFD小鼠表现出胰岛素抵抗综合征以及高胰岛素血、肥胖、高血糖和高血脂(Migrenne S,Lacombe A,Lefèvre AL,Pruniaux MP,Guillot E,Galzin AM,Magnan C，Adiponectin is required to mediaterimonabant-induced improvement of insulin sensitivity but not body weightloss in diet-induced obese mice，Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol.2009296(4):929-35.)。
10周的HFD饮食导致与对照饮食相比，基础血糖的明显升高 (220.6±3.7mg/dl；单侧t检验，P＝0.0001，****)和基础胰岛素血的明显升高(0.51±0.06ng/ml；单侧t检验，P＝0.0069，**)。
接受正常对照饮食的小鼠表现出基础血糖(190.4±6.9mg/dl)和基础胰岛素血(0.29±0.04ng/ml)，且在OGTT测试过程中的血糖和胰岛素血正常且不受在第10和14周之间施用的ALF-5755影响。对于全部实验，小鼠在动物房中通过观察包括12h照明(7am-7pm)的日夜循环而适应。
处理
Ob/Ob模型：
29只动物分为三组：10只动物接受安慰剂(生理盐水)，9只动物接受递送9μg/日的ALF5755的泵，以及10只动物接受43μg/ 日的ALF5755，持续4周。通过从在动物背部皮下植入的Alzet泵 (Alzet#2004)扩散并以0.25μl/小时的流速皮下递送恒定体积来进行递送。治疗在血液循环中发生，并使得可以获得对于安慰剂组为零、对于接受9μg/日ALF5755的组为102.7±28.6ng/ml以及对于接受43μg/日ALF5755的组为229.5±44.9ng/ml的ALF5755平均血清浓度(血液中间水平(blood hip level))。对于ALF57559μg/日组的3只动物和43μg/日组的3只动物，不进行ALF5755的递送且在处理结束时血液中间水平为零。这些动物被从分析中排除。两只动物在实验过程中死亡，一只小鼠来自对照组和一只小鼠来自ALF575543μg/日组。每组保留的数量因此为：安慰剂，n＝9；ALF5755 9μg/日，n＝6；ALF575543μg/日，n＝6。
HFD模型
使用安慰剂(生理盐水，对于CTD组n＝5，对于HFD组n＝9) 或43μg/日ALF5755(对于CTD组n＝5，对于HFD组n＝9)对食用 HFD和对照饮食的动物处理4周。通过从在动物背部皮下植入的 Alzet泵(Alzet#2004)扩散并以0.25μl/小时的流速皮下递送恒定体积来进行递送。治疗发生在血液循环中，且使得可以获得对于安慰剂组为零和对于接受43μg/日ALF5755的2个组在第17天为309 ng/ml的ALF5755平均血清浓度(血液中间水平)。在第27天(通过泵递送的最后一日)，血液中间水平对于CTD组的动物为369.3 ng/ml，和对于HFD组为334.8ng/ml，因此确认ALF5755在整个治疗中的正确递送。
针对组织敏感性的HFD模型(碳14标记的葡萄糖)
根据与前述相同的处理，使用安慰剂(生理盐水，对于CTD组 n＝4，对于HFD组n＝6)或43μg/日ALF5755(对于CTD组n＝4，对于HFD组n＝6)对食用HFD和对照饮食的动物处理4周。ALF5755 的平均血清浓度(血液中间水平)对于安慰剂组为零，对于CTD组动物为673ng/ml和对于HFD组动物为784ng/ml，因此确认ALF5755 在整个治疗中的正确递送。
所研究的变量
体重
HDF实验的动物在模型建立过程中且然后也在4周处理过程中每周称重，以验证与饮食关联的体重增加和评估ALF5755对该变量的任何影响。
ob/ob动物对它们来说在4周处理过程中大约每周称重一次。
HFD实验的食物摄入
通过每周3次称重提供的食物和剩余的食物来测量食物摄入量。然后将其与每日摄入量(以g/日表示)关联。
HFD实验的热量摄入
根据饮食，热量摄入从以克表示的摄入食物量以及每克食物颗粒的能量值直接计算。
基础血糖
在各项测量前使动物禁食18小时。使用用于测量血液中的血糖的阅读仪和反应性试纸条(reactive strip)(
Figure BDA0000865757630000231
mio阅读仪和
Figure BDA0000865757630000232
传感试纸条，A.Menarini diagnostics)来测量基础血糖。一滴血液足以进行该测量；其通过从尾末端采取血样获得。在植入泵前、在处理约2周后且然后在治疗结束时获取基础血糖。
基础胰岛素血
在测量基础血糖后，使用以钠3.75IU/毛细管肝素化的血细胞压积毛细管(Hirschmann
Figure BDA0000865757630000241
)采取最大75μl血样，以分析基础胰岛素血。根据生产商的使用建议，为了通过ELISA(Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit,Crystal Chem Inc，#90080)分析胰岛素的目的，血液管在14000rpm下离心3分钟，然后除去悬浮液并在-20℃下储存。
口服葡萄糖耐量试验：OGTT
在禁食18小时后称重动物，且然后测量基础血糖和基础胰岛素血。然后以2g/kg小鼠的比例通过胃内强饲施用30％葡萄糖溶液 (CDM Lavoisier，1L可注射瓶)。
以与基础血糖相同的方式，在限定时间段内(葡萄糖强饲后5 和90或120分钟之间)测量血糖。
还在15和30分钟时收集75μl血液，以使用与用于分析基础胰岛素血相同的程序分析胰岛素血。
在施用葡萄糖前的T0时、15分钟后和30分钟后，从血糖和胰岛素血值计算HOMA-IR指数。根据下式计算HOMA-IR指数：
如果血糖以摩尔浓度单位(mmol/l)表示，[(胰岛素血(mU/l)x血糖)/22.5]，或者
如果血糖以质量单位(mg/dl)表示，[(胰岛素血(mU/l)x血糖)/405]。
皮下胰岛素耐量试验：ITT
使ob/ob小鼠禁食18h的时间。
从100IU/ml的储备液(Novorapid Flexpen 100IU/ml， NovoNordisk A/S)在生理盐水中稀释到0.15IU/ml的胰岛素溶液以 0.75IU/kg小鼠的比例皮下注射。
以与前述相同的方式，在限定时间段内(胰岛素注射后5和120 分钟之间)测量血糖。
对葡萄糖的组织敏感性
为了了解ALF5755对各种组织的胰岛素敏感性的影响，腹膜内注射8μCi的2-脱氧葡萄糖14C(2DG 14C)。这是未被代谢(其仅经历葡糖激酶的磷酸化的步骤)的葡萄糖类似物，由此使其能够在组织中积累。在t0时、然后每10分钟采取25μl血液，持续最少60 分钟，以评价血液中2DG的减少。通过致死性注射戊巴比妥处死小鼠，然后除去组织以计数摄取的2DG14C的放射性。
组织在氢氧化钠中在60℃下消化16h，然后中和溶液。出于了解一方面非磷酸化的2DG的量和另一方面2DG总量的目的，样品进行几个定量步骤。通过这两个变量相减(总2DG-非磷酸化2DG)计算实际渗入该组织中的2DG的量。
与组织重量相关的该值然后除以血液中14C放射性比活度随时间的积分(以cpm/mg葡萄糖表示)，以考虑在血液中循环的量。
该方法使得可能证实胰岛素对器官中的葡萄糖转运的特定效应，并反映该组织的胰岛素敏感性。
用于测定脂肪体重/瘦体重的MRI：
MRI扫描包括称重小鼠，然后将其装入管中，并用推杆保持其被紧密地遏制。将管插入使用含有供应商规定的体积的小鼠专用对照管预校准的EchoMRI扫描仪中。在3分钟内，对身体的脂肪体重、瘦体重、生物流体和总游离水进行定量。
肝评估(ALAT、ASAT、肌酐、总胆红素)：
藉助使用Olympus AU 400自动化装置的光度比色测试进行血清肝评估。
脂质评估(胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯、中性脂质)：
通过HPLC色谱法进行血清和肝脂质评估。
结果：
HIP/PAP蛋白质对于糖内稳态的影响：
施用HIP/PAP明显降低HFD小鼠(处理的第25日降低约15％；处理的小鼠中188.9±10.8相对于安慰剂小鼠中222.4±8.5，P<0.001， **；双因素方差分析(ANOVA)，处理效应：F(16.1)＝12.76，P＝0.0025， **)和ob/ob小鼠(相对于安慰剂小鼠)(处理的第25日降低约28％；处理的小鼠中228.2±14.7相对于安慰剂小鼠中316.3±32.2，P<0.05， *)的基础血糖(禁食18小时后)。
类似地，使用HIP/PAP蛋白质的处理也使得可以在OGTT测试过程中减轻高血糖，对于ob/ob模型早在2周时是明显的(双因素方差分析，处理效应：F(133.1)＝13.09，P＝0.0018，**)，并在4周时保持(双因素方差分析，处理效应：F(133.1)＝5.78，P＝0.027，*)。对于接受HFD饮食并使用HIP/PAP处理的小鼠，观察到趋向于改善的趋势，其导致高血糖曲线回到与在接受对照饮食的小鼠中观察到的水平相当的水平。
使用HIP/PAP蛋白质的处理还使得可以在ITT测试过程中减轻高血糖，对于ob/ob模型在2周时是明显的(双因素方差分析，处理效应：F(133.1)＝4.71，P＝0.043，*，参见图1A)，趋势在4周时维持，反映出胰岛素敏感性显著且特异性的改善。实际上，ITT测试包括通过注射外源性胰岛素来降低血糖。对于相同剂量的胰岛素，作为响应的血糖下降越大，胰岛素敏感性越高(且相反地，胰岛素抵抗越低)。如图1A所说明的，胰岛素注射在已接受安慰剂处理的ob/ob 小鼠中几乎不产生血糖下降(至少在前30分钟期间)。这种效果反映出重度胰岛素抵抗。相反，在经ALF5755处理的ob/ob小鼠中，胰岛素注射导致血糖相当程度的降低，因此反映出胰岛素抵抗相当程度的减轻(即：胰岛素敏感性改善)。
在处理1个月后HIP/PAP蛋白质对于胰岛素血和HOMA-IR指数的影响：
在ALF-5755处理的HFD小鼠中，在OGTT测试过程中观察到高胰岛素血与接受安慰剂处理的小鼠相比降低(在15分钟时高胰岛素血峰降低：处理的小鼠中3.75倍于基础水平相对于安慰剂小鼠中的7.61倍，P<0.0001，***，且在30分钟时：处理的小鼠中2.31倍于基础水平相对于安慰剂小鼠中的3.7倍，P<0.05，*)。在HFD模型中，这些变化伴随着HOMA-IR指数的正常化(normalization)：双因素方差分析，处理效应：F(32.1)＝16.77，P＝0.0003，***，参见图1B-C。
在ob/ob小鼠中，也在OGTT测试过程中观察到高胰岛素血的改善：双因素方差分析，处理效应：F(34.1)＝5.84，P＝0.027，*。这些变化伴随着朝向HOMA-IR指数正常化的趋势：指数的降低在15和 30分钟时不是统计学显著的。
所有这些数据证实通过ALF5755的处理，在OGTT测试过程中基础血糖和血糖偏移的正常化是由胰岛素抵抗的减轻而非胰岛素促分泌效应导致。
HIP/PAP蛋白质对于组织胰岛素抵抗的影响：
通过碳14-标记2DG的摄取，在HFD模型中测量ALF-5755处理后各种胰岛素敏感性组织(肝、肌肉和脂肪组织)的葡萄糖摄取的调节。图1D说明AFL5755的处理导致肌肉葡萄糖摄取的增加(胫骨肌；21.7μM±6.3对比于51.9μM±12.8；双侧曼-惠特尼(Mann Whitney)，P＝0.04，*)。在肝或脂肪组织中未观察到增加。
HIP/PAP蛋白质对于脂肪体重和瘦体重百分比的影响：
14周的HFD饮食诱导脂肪体重百分比显著的上升(图2A和C： 32％相对于安慰剂组的对照饮食中的15％)。使用AFL-5755的处理明显减少了接受HFD的动物中观察到的脂肪体重的增加(图2A： 32.1％±1.7％相对于26.7％±2.0％；单侧曼-惠特尼检验：P＝0.039，*)。对于接受对照方案的小鼠观察到相当的趋势。类似地，在食用HFD 的动物组中观察到与对照饮食相比的瘦体重下降(图2B和D：49.8％相对于安慰剂组的对照饮食中的61.2％)。使用ALF-5755的处理明显提高了接受CTD的动物中观察到的瘦体重百分比(图2D：61.2％±0.4％相对于63.5％±0.6％；单侧曼-惠特尼检验，P＝0.008，**)。对于接受HFD饮食的小鼠观察到相当的趋势。对脂肪体重/瘦体重比率的分析表明，AFL-5755的处理相对于接受安慰剂处理的小鼠导致在接受HFD饮食的小鼠中该比率至少20％(21％)的明显降低(曼- 惠特尼单侧检验，P＝0.047)，以及在接受对照饮食的小鼠中趋向于至少10％(10.1％)的下降的趋势。
HIP/PAP蛋白质对于血清和肝脂质分布的影响：
在HFD动物组中(参见图3A)，观察到AFL-5755导致胆固醇水平(913.0μM±28.2相对于647.1μM±32.9；双侧曼-惠特尼， P<0.0001，****)、胆固醇酯水平(1760.6μM±65.8相对于1390.3 μM±96.7；双侧曼-惠特尼，P＝0.011，*)和总中性脂质水平(2834.9 μM±95.9相对于2168.6μM±118.5；双侧曼-惠特尼，P＝0.0005，***) 的统计学显著的下降，以及趋向于甘油三酯水平下降(161.3μM±15.0 相对于131.2μM±24.1)的趋势。
在对照饮食中(图3B)使用ALF-5755处理观察到胆固醇(526.6 μM±35.9相对于376.9μM±43.9；双侧曼-惠特尼，P＝0.032，*)和甘油三酯(323.2μM±72.6相对于143.0μM±31.5；双侧曼-惠特尼， P＝0.016，*)的相当的和统计学显著的效果。
在ob/ob模型中(图3C)，ALF-5755降低胆固醇(763.0μM±58.5 相对于532.5μM±29.0；双侧曼-惠特尼，P＝0.002，**)，并观察到趋向于甘油三酯水平下降的趋势(651.7μM±168.6相对于271.8 μM±44.6)。
在经ALF-5755处理的HFD小鼠中也观察到趋向于ASAT下降以及ALAT的统计学显著下降(132.7μM±19.3相对于77.2μM±12.7；双侧曼-惠特尼，P＝0.032，*，参见图3C)的趋势。此外，在对照饮食和ob/ob小鼠模型中观察到相当的趋势。
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Claims (7)

1.HIP/PAP蛋白质在制备用于治疗或预防保持胰腺β分泌功能的非胰岛素依赖性受试者中的胰岛素抵抗的药物中的用途，
其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列选自序列SEQ ID No 1至4的氨基酸序列；所述受试者具有小于125mg/dl的空腹血糖，且具有正常的空腹血糖。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述受试者还具有大于或等于60％的HOMA-B值和/或小于6的HOMA-IR指数。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述受试者在口服葡萄糖耐量试验后2h时具有小于140mg/dl，且具有正常的糖耐量。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述受试者具有至少一种选自如下的病症：脏器过重、肥胖、雄激素过多症、饮食失调、肌肉减少症、分解代谢过度、营养不良。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述受试者具有血脂异常或动脉硬化。
6.包含有效量的如权利要求1所限定的HIP/PAP蛋白的组合物在制备用于治疗或预防非胰岛素依赖性受试者中的胰岛素抵抗的药物中的用途，其特征在于，所述组合物作为所述HIP/PAP蛋白与至少一种生理学上可接受的赋形剂的混合物，所述受试者具有小于125mg/dl的空腹血糖，且具有正常的空腹血糖。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述受试者具有小于110mg/dl的空腹血糖。
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