CN105647926A - 马铃薯stu-miR8045及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种马铃薯stu-miR8045及其应用。RLM-5′RACE测检结果表明stu-miR8045调控泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）的表达，可用于研究该泛素结合酶基因的功能，即通过缺失表达或过表达该泛素结合酶基因时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR8045的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。

Description

马铃薯stu-miR8045及其应用
技术领域
本发明专利涉及一种microRNA（miRNA）及其应用，具体地说是马铃薯stu-miR8045及其应用。
背景技术
miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，长约20 nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA基因最初转录产生具有茎环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，通常在转录后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。
干旱胁迫是最主要的非生物胁迫之一，其对农作物的生长发育和产量造成极其严重的影响。据统计，地球上总土地面积的36%属于缺水的干旱或半干早区域，我国干旱和半干早区域大约占国土地面积的1/2。即使在半湿润和湿润的农业主产区，也通常会受到季节性和周期性的旱灾侵袭。干旱胁迫对农作物产量、质量的影响相当于其余自然灾害之和，其危害性在各种自然逆境胁迫中占首位，仅次于病虫害对作物造成的损失。解决干旱问题的途径，除了节水灌溉来提高水分的利用效率之外，就是培育节水抗旱的新品种以提高作物自身抵御干旱的能力。要达到这一目的，必须了解作物响应干旱胁迫的分子机制。因此，对作物抗旱机理的研究以探索提高作物抗旱能力是各国科学家关注的研究热点问题。尤其是近年来对拟南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鉴定、克隆出大量耐旱相关的基因，已研究清楚了一些耐盐相关的基因的调控模式。将抗旱、耐盐基因通过基因工程的手段整合到目标植物基因组中或有目的的抑制或诱导一些干旱相关基因的表达来获得转基因植株，开辟了培育高度抗旱性作物新品种的新途径。随着对植物抗旱机理的了解以及转基因技术的日趋成熟，利用转基因技术来获得抗旱的育种材料或遗传改良的新品种，已成为抗旱品种培育最具发展潜力的方向。
植物在干旱等多种逆境胁迫下DNA会受到损伤，同时细胞内也会积累大量的无功能的蛋白质，DNA的损伤和无功能蛋白的积累会对植物细胞的正常生命活动产生严重的影响，因此及时修复损伤的DNA和清理“垃圾”蛋白是植物适应逆境的重要方式。已有研究发现泛素途径是生物体内最重要的DNA修复和蛋白质降解途径，细胞内80%-90%的蛋白通过泛素途径所降解。因此干旱等非生物胁迫下加强DNA的修复和无功能蛋白质的清除会对提高生物的逆境适应能力起到重要作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供马铃薯stu-miR8045的前体序列、stu-miR8045抑制靶基因表达以研究靶基因功能的应用、stu-miR8045抑制靶基因表达提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品种的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
马铃薯stu-miR8045的前体序列如下（本发明中所列核苷酸序列均为5′→3′）：gaacuaucaucaucuauguauuaaaacauaccucaacuauuaguuaggaaaagagaacugauaguugagguguguuuuaauucauauauagauggugauaguucaaguaga （序列表SEQ ID NO：1）。
马铃薯stu-miR8045的前体序列的二级结构式为：自5’端1bp-20bp和31bp-50bp碱基配对，自5’端20bp-31bp形成环状结构的茎环结构。
编码上述马铃薯stu-miR8045的前体序列的DNA序列为：gaactatcatcatctatgtattaaaacatacctcaactattagttaggaaaagagaactgatagttgaggtgtgttttaattcatatatagatggtgatagttcaagtaga （序列表SEQ ID NO：2）。
上述马铃薯stu-miR8045的成熟序列如下：acugauaguugagguguguuu （序列表SEQID NO：3）。stu-miR8045的成熟序列是前体序列自5′端57bp-77bp的一段RNA序列。
上述马铃薯stu-miR8045的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR8045抑制靶基因Pto-responsive gene 1 protein （PGSC0003DMT400040461）和泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）的表达，所述Pto-responsive gene 1 protein（PGSC0003DMT400040461）基因序列如序列表SEQ ID NO：4所示。所述泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）基因序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
上述马铃薯stu-miR8045的前体序列在培育抗旱转基因植物中的应用。
优选地，所述转基因植物为马铃薯（Solanum tuberosum）。
优选地，在马铃薯中过表达SEQ ID NO：1所述miRNA，或者抑制SEQ ID NO：1所述miRNA的表达，培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯。
采用上述技术方案所产生的技术效果在于：本发明提供了一种马铃薯stu-miR8045及其应用。RLM-5′RACE测检结果表明stu-miR8045调控Pto-responsive gene 1protein （PGSC0003DMT400040461）和泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）的表达，可用于研究该Pto-responsive gene 1 protein和泛素结合酶基因的功能，即通过缺失表达或过表达该Pto-responsive gene 1 protein和泛素结合酶时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR8045的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。
附图说明
图1是本发明马铃薯stu-miR8045的二级结构图。
图2是本发明马铃薯靶基因降解电泳图。
图3是本发明马铃薯靶基因降解组测序图。
图4是本发明马铃薯stu-miR8045的荧光定量PCR图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对具体实施方式进行详细说明。本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，以下实施例仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。并且，本发明所使用的各种原料以及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得；所有定量试验均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例一：stu-miR8045和靶基因序列的确认
马铃薯stu-miR8045的前体序列如下（本发明中所列核苷酸序列均为5′→3′）：gaacuaucaucaucuauguauuaaaacauaccucaacuauuaguuaggaaaagagaacugauaguugagguguguuuuaauucauauauagauggugauaguucaaguaga （序列表SEQ ID NO：1）。
马铃薯stu-miR8045的前体序列的二级结构式为：自5’端1bp-20bp和31bp-50bp碱基配对，自5’端20bp-31bp形成环状结构的茎环结构。
编码上述马铃薯stu-miR8045的前体序列的DNA序列为：gaactatcatcatctatgtattaaaacatacctcaactattagttaggaaaagagaactgatagttgaggtgtgttttaattcatatatagatggtgatagttcaagtaga （序列表SEQ ID NO：2）。
上述马铃薯stu-miR8045的成熟序列如下：acugauaguugagguguguuu （序列表SEQID NO：3）。stu-miR8045的成熟序列是前体序列自5′端57bp-77bp的一段RNA序列。
上述马铃薯stu-miR8045的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR8045抑制靶基因Pto-responsive gene 1 protein （PGSC0003DMT400040461）和泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）的表达，所述Pto-responsive gene 1 protein（PGSC0003DMT400040461）基因序列如序列表SEQ ID NO：4所示。所述泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）基因序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
实施例二：stu-miR8045的制备
1、马铃薯材料处理
选取大小均匀完整的马铃薯栽培品种“紫花白”和“大西洋”的薯块，然后将整薯盆栽种植于标准温室进行培养；每个品种平行种植六盆，当植株长到20 厘米左右时，每个品种随机的选取3盆进行干旱处理，剩余的3盆按时浇水使其正常生长。当处理一月后。分别采集马铃薯干旱处理和对照植株新鲜的叶片，并立即在液态氮中速冻，被储存在−80℃冰箱。
2、样品总RNA提取与检测
（1）将采样的马铃薯叶片在液氮中快速研磨成粉末，在液氮尚未挥发之前将大约100mg的粉末立即转入预冷的DEPC处理过的1.5ml离心管中，快速加入1ml的Trizol溶液，涡旋震荡充分混匀后室温放置 5～10min，使核酸与核蛋白完全分离。
（2）4℃，12000 r•min-1离心10 min，小心的将上清液转移到另一个DEPC处理过的1.5 ml离心管中。
（3）加入200 μl的氯仿，涡旋振荡混匀，室温放置5min。
（4）4℃，12000 r • min-1离心10 min后，小心的将上层水相转移至另一个DEPC处理过的1.5ml离心管中，切记勿吸取中间有机相。
（5）分离后加入相同体积的异丙醇，充分混匀再于室温放置15 min。
（6）4℃，12000 r • min-1离心10 min，废弃上清，可得到RNA沉淀；
（7）按2 ml 75% 乙醇/ml Trizol的比例加入75%乙醇（DEPC水稀释），温柔的振荡离心管，洗涤沉淀（重复一次）。
（8）4℃，12000 r • min-1离心5 min，弃掉上清，切不可倒出沉淀。
（9）室温放置5~10 min自然干燥，注：RNA样品不要太过于干燥，否则很难再完全溶解。
（10）用40 μl无RNase的ddH2O溶解RNA沉淀，55~60 ℃水浴处理5~10 min。将溶解好的RNA分装于1.5 mL无Rnase的离心管中，置于-80℃超低温冰箱保存。
（11）RNA样品的检测：琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）；Qubit对RNA浓度进行精确定量 ；Agilent 2100精确检测RNA的完整性。
3、miRNA文库的构建及测序
提取的RNA经检测合格后，分别使用small RNA Sample Pre Kit构建smRNA文库，利用smRNA的3′及5′端的特殊结构（5′端完整的磷酸基团，3′端有羟基），使用RNA连接酶在纯化后的smRNA 3′端加上接头，添加反转录引物，防止多余3′接头与5′接头连接，减少接头自连产物；再加5′接头，添加反转录酶将上述smRNA反转录成 cDNA。随后用PCR扩增，然后扩增产物用PAGE胶电泳分离目标片段，切胶回收得到的为cDNA文库。以此 cDNA文库为模板在Illumina测序仪中进行PCR 扩增测序。miRNA分离、文库构建和高通量测序应用IlluminaHiSeq 2500测序仪完成。
4、测序数据分析和miRNA筛选
将测序获得50 nt左右的序列经去除低质量的reads、去除5′接头污染的reads、去除没有3′接头序列的reads以及含有polyA的reads，获得clean reads数据。将clean reads与genbank和Rfam数据库以及参考基因组进行比对，获得不同sRNA的注释信息。然后进行序列长度分布统计以及样品之间公共序列统计分析，miRNA主要集中在20-24 nt的范围。除注释的所有miRNA片段，选取剩下的未注释miRNA片段进行已知miRNA的鉴定和新miRNA的预测分析。
miRNA转录起始位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向互补序列上，其前体具有标志性的发夹结构，成熟体的形成是由Dicer酶的剪切实现的。针对miRNA的生物特征，对于比对到参考基因组上的序列，利用miRDeep2软件进行已知及新的miRNA鉴定。由于不同物种在各个长度中miRNA所占百分比也有差异，故我们以长度为条件进行分类统计。
前体miRNA(pre-miRNAs)在Exportin-5帮助下转运到细胞核外，由细胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs，酶切位点的特异性使得miRNA成熟体序列首位碱基对于碱基U具有很强的偏向性，另外其他的位点也有一些统计，如：2~4号位一般缺少U，第10号位偏向于A(第10号位一般是miRNA对其靶基因发生剪切作用时的剪切位点)。
对于miRNA其前体序列能够形成发夹结构是其最具标志性特征之一。通过截取一定长度sRNA能够比对在基因组上的序列，利用miRDeep2软件对一定长度的序列其二级结构、分析Dicer酶切位点和计算自由能，如果能够满足miRNA的要求，则为马铃薯中候选的新miRNA。具体应符标准为：(1) 截取的一定长度的序列能够折叠成一个发夹结构的二级结构；(2) miRNA的成熟序列应在发夹结构的一条臂上；(3) miRNAs成熟序列与另一个臂上的miRNA*序列的错配应小于6个碱基；(4) miRNAs成熟序列和miRNA*序列不能形成环状结构或发生断裂；(5) 二级结构有较低的MFEs值和较高的MFEIs值，且A+U的含量应高与C+G的含量。
通过RNA合成技术，例如MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorptionionization-time-offlight)合成，并通过HPLC对产物RNA进行纯度分析，即能得到所述stu-miR8045产品。
实施例三：stu-miR8045的应用
1、miRNA靶基因预测
利用stu-miR8045和马铃薯基因mRNA序列信息文件，通过TargetFinder软件进行靶基因预测。miRNA靶基因预测规则为：
(1) sRNA与靶基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配) ；
(2) 在miRNA/靶基因复合体中，不得有超过2处发生相邻位点的错配 ；
(3) 在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5′端起第2~12个位点不得有相邻位点都发生错配；
(4) miRNA/靶基因复合体的第10~11个位点不得发生错配 ；
(5) 在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5′端起第1~12个位点不得有超过2.5个错配；
(6) miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75% 。
2、采用RLM-5′RACE验证stu-miR8045的靶基因
（1）5′端接头的连接
RLM-5′RACE反应使用Invitrogen公司的GeneRaeer试剂盒进行。首先用T4 RNA连接酶将一段RNA接头序列(GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUG
AAA)直接连接在100ng的总RNA 5′末端，在冰上配制反应液，充分混匀，短暂离心，然后37℃孵化1小时，用于反转录合成cDNA。接头反应体系为：总RNA 2μL，5′RACE Adapter 1 μL，10×RNA Ligase buffer 1 μL，T4 RNA Ligase(2.5U/μL) 2 μL，Nuclease-free Wate 4μL。
（2）反转录合成cDNA第一链
取已连接5′端接头的反应液2μL进行反转录，反转录反应体系为：Ligated RNA 2 μL，dNTP Mix 4 μL，Random Decamers 2 μL，10X RT Buffer 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-free Water To 20 μL。
充分混匀，短暂离心，然后42℃孵化1小时，获得的反转录产物用于巢式 PCR扩增反应。
（3）巢式PCR反应扩增
以上一步反转录的产物作为模版，利用靶基因特异的外部引物和接头的外部引物进行5′RACE巢式PCR的第一步反应，基因外部引物和接头的外部引物为：ACGAGCCATAGCAAGTGCTCC和CTCATCCATGTGGAGAGTTGTTGA （Pto-responsive gene 1protein （PGSC0003DMT400040461））；
CAGACAACTCAACCAGGAGAATGC和AGAGAAGTCAGTCTGCTGTCCAGC（泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858））。
反应液在冰上配制，反应体系为：RT reaction (from the previous step) 1 μL，10X PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 4 μL，5′ RACE gene-specific outer primer (10 μM) 2 μL，5′ RACE Outer Primer 2 μL，Nuclease-free Water To 50 μL，thermostableDNA polymerase (0.25 μL of 5U/μL) 1.25U
反应程序为：
预变性： 94 ℃ 3min；
扩增： 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec（35次循环）；
延伸： 72℃ 7 min。
利用巢式PCR第一步反应的产物作为模板，以靶基因特异的内部引物和接头的内部引物进行巢式PCR的第二步反应，基因内部引物和接头的内部引物为
ACGAGCCATAGCAAGTGCTCC和CTCATCCATGTGGAGAGTTGTTGA （Pto-responsive gene 1protein （PGSC0003DMT400040461））；
CAGACAACTCAACCAGGAGAATGC和AGAGAAGTCAGTCTGCTGTCCAGC（泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858））。
反应体系为：Outer PCR (from the previous step) 2 μL，10X PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 4 μL，5′ RACE gene-specific innter primer (10 μM) 2 μL，5′ RACEinner Primer 2 μL，Nuclease-free Water To 50 μL，thermostable DNA polymerase(0.25 μL of 5 U/μL) 1.25U。反应程序与巢式PCR第一步反应相同。
（4）目的片段与T载体的连接
扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图2所示，切下目的片段用天根生化公司的柱式DNA胶回收试剂盒回收，纯化回收的具体方法严格按照说明书操作。回收产物连接到pMD®18-T Vector，连接反应体系：pMD®18-T Vector 1μL，Solution I 4 μL，回收片段 4 μL，ddH2O 1 μL
（5）连接产物的转化及测序
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，每个靶基因选取至10个阳性克隆采用Solexa高通量测序技术进行测序，测序的结果如附图3所示（箭头所指位置为miRNA降解靶基因的断裂位置）。
结合附图3和附图4的结果说明，stu-miR8045能够将靶基因泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858） mRNA特异性断裂，从而使靶基因表达下调，进而能够研究靶基因功能。
3、干旱胁迫下stu-miR8045表达量的分析
分别将不同干旱处理阶段的RNA反转录合成cDNA。用SYBR® Premix Ex TaqII™荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒检测靶基因在不同干旱处理阶段的表达情况，以延伸因子（ef1a）基因作为内参，反应体系如下：SYBR® Premix Ex TaqTM II（2×） 10 μL，qGUS-1（10 μM）0.8 μL，qGUS-2（10 μM）0.8 μL，ROX Reference Dye II（50×） 0.4 μL，RT反应液 1 μL，ddH2O 7 μL。
qRT-PCR反应条件为：
95℃预变性 10 min
95℃变性 15 sec
60℃ 1 min 40个循环
72℃ 30 sec
计算公式：应用公式RQ(相对表达量)=2–∆∆Ct计算在处理前后的相对表达量，∆∆Ct=（∆Ct处理样品－∆Ct ef1a）－（∆Ct对照样品－∆Ct ef1a）。引物序列为：CGCACUGAUAGUUGAGGUGUGUUU 和Uni-miR qPCR Primer（TaKaRa RR717）。
如附图4所示，在干旱胁迫处理后马铃薯的两个品种大西洋和紫花白的stu-miR8045基因均表现出显著上调，这表明stu-miR8045的表达受到干旱胁迫调控。因此，在马铃薯中过表达stu-miR8045基因，或者抑制stu-miR8045表达将会培育出具有高抗旱能力的马铃薯转基因品种。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，仅作为本发明可实施的技术方案提出；应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以对实验步骤做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110> 甘肃农业大学
<120> 马铃薯stu-mir8045及其应用
<160> 5
<210> 1
<211> 111
<212> RNA
<213> 马铃薯（solanum tuberosum）
<400> 1
gaacuaucau caucuaugua uuaaaacaua ccucaacuau uaguuaggaa aagagaacug 60
auaguugagg uguguuuuaa uucauauaua gauggugaua guucaaguag a 111
<210> 2
<211> 111
<212> DNA
<213> 马铃薯（solanum tuberosum）
<400> 2
gaactatcat catctatgta ttaaaacata cctcaactat tagttaggaa aagagaactg 60
atagttgagg tgtgttttaa ttcatatata gatggtgata gttcaagtag a 111
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 马铃薯（solanum tuberosum）
<400> 3
acugauaguu gagguguguu u 21
<210> 4
<211> 958
<212> RNA
<213> 马铃薯（solanum tuberosum）
<400> 4
ttttcttctt ctttcttaac aatttaataa gaatatttat tcttatttaa ttgattttct 60
agtttttaat ttgtttcata aatctttgga agtgaaaaaa aaatggattc aagaatggag 120
atagatttta tggacctcaa tagtaaacca caattatcag aaatggagaa gcaacacaaa 180
agagcttctg ggatgaagtg gccattttca ttggctgatt tagctactca tcatgaaaac 240
acattttttc agaattacaa ctccacccca atagtttcca ttaattcaaa aaattcatcc 300
ctaaacaatt acaaatccac caatgacccc caatactttg gaggggcttt tcctctagta 360
gcaaaaacaa gcacttatgg ctcaaggaaa aattatgaca attgcagtcc aaatgagtca 420
acattgacca tattctacat gggtgaggtg catatttttc cgggtatatc accagaaaag 480
gctgagctaa taattgacct ggtttctaaa tcaacaactc tccacatgga tgagatttta 540
gaaaaagtga tgaataaaga aaaatatgaa gaaaataaat cagacccttc aaatgcatcc 600
acaaattatg ctaaaggagc acttgctatg gctcgtagag caactcttgc ccgatttttg 660
gagaagagaa agcatagatt gatcaaagct aggccatatc tatatggtga aaatttatca 720
aagtttccct ttgatattca acaagaagaa gaagaaacgg cgtcgtcaag cgttcattgg 780
gaaaactaat tcaagacaaa ttgcattgtt ttgaattatt attattattc ttttagaaat 840
attataatgt tttgtacatg tgcctatcat gttgtgttta attatatatt tacattgaca 900
actataaatt ttcaaagatt attgtaattt tattatgagt taagttataa catgtttg 958
<210> 5
<211> 908
<212> RNA
<213> 马铃薯（solanum tuberosum）
<400> 5
cgtagattga aaggtatatg gtgtagtgtg aaacagcaca caccgctttg gcagcttata 60
catcacgcaa actccaaatc cttcactctt ttaactgcac aggggaagcc catcagagac 120
ggtcgattat cgaagctcat atacaaatcc tctccatttt ccatctgaaa ttattgctct 180
caggtggtga ggatgtcgac agcggcgaag aagagattga tgagggattt caagcggtta 240
cagcaggatc ctcctgctgg catcagcggt gcacctcatg acagcaatat aatgttatgg 300
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ttccatccaa atatttatgc tgatggaagt atttgtttgg acatcttgca aaatcagtgg 480
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tacaacagga aggtgcgtga aatagttgag caaagctgga cagcagactg acttctctgt 660
tgctaaatac attacatggc attctcctgg ttgagttgtc tgcatcaaac taagatgttt 720
tccagtgttt ttgctacatc aataatcaat gtagtacaat ttggtccttt tatgttgtgt 780
taggagctct gagtttcttt accttgatgt tttgttgctc cactatgaga gactctgtac 840
atatgatctg ttgtatccaa ttgtgtgaat ttctataaag ctatattccc tttaattctg 900
acgtagac 908

Claims (10)

1.马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的前体序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的二级结构为：自5’端1bp-20bp和31bp-50bp形成碱基配对，自5’端20bp-31bp形成环状结构的茎环结构。
3.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于编码所述stu-miR8045前体序列的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的成熟序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求4所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的成熟序列是前体序列自5′端57bp-77bp的一段RNA序列。
6.权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045在研究靶基因功能中应用。
7.根据权利要求6所述的马铃薯stu-miR8045在研究靶基因功能中应用，其特征在于所述靶基因为Pto-responsive gene 1 protein和泛素结合酶；Pto-responsive gene 1protein基因序列如序列表SEQ ID NO：4所示，泛素结合酶基因序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
8.根据权利要求6所述的马铃薯stu-miR8045在研究靶基因功能中应用，其特征在于所述stu-miR8045通过特异性降解靶基因，使靶基因表达下调而研究靶基因功能。
9.权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045在培育抗旱转基因植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的马铃薯stu-miR8045在培育抗旱转基因植物中的应用，其特征在于所述转基因植物为马铃薯。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031302A (zh) * 2011-09-30 2013-04-10 中国科学院上海生命科学研究院 白菜热诱导miRNA及其鉴定

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031302A (zh) * 2011-09-30 2013-04-10 中国科学院上海生命科学研究院 白菜热诱导miRNA及其鉴定

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALICIA N. MASSA ET AL.: "The Transcriptome of the Reference Potato Genome Solanum tuberosum Group Phureja Clone DM1-3 516R44", 《PLOS ONE》 *
GENBANK: "GS716426.1", 《GENBANK》 *
RUNXUAN ZHANG ET AL.: "Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing", 《PLOS ONE》 *
万琳霞 等: "计算方法预测microRNA研究进展", 《计算机应用与软件》 *
李世风 等: "马铃薯microRNA及其靶基因的预测", 《甘肃农业大学学报第》 *

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