CN105641747B - 一种流体剪切力介导的胶原自组装方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种流体剪切力介导的胶原自组装方法，属于生物医用材料及生物力学领域。在中性条件下启动胶原的自组装机制，利用锥板粘度仪等力学加载装置对其施加恒定方向的流体剪切力作用。相较传统的自组装方法，本发明将生物力学微环境考虑在内，构建了力学‑化学耦合体，更好地模拟了体内真实的组装过程。在流体剪切力的介导下，胶原纤维发生重排，更有利于后续羟基磷灰石的沉积。这种新颖的胶原纤维材料，既具有很好的生物相容性和降解性，更具有与人体骨组织胶原相匹配的力学特性，有很广阔的应用空间。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料及生物力学领域。更具体地说，本发明涉及一种流体剪切力介导的胶原自组装方法。
背景技术
由于创伤、劳损、人口老龄化、先天畸形等因素造成的骨缺损病例日益增多，骨修复材料的开发与应用日益受到人们的关注。传统的方法采用自体骨或异体骨移植，价格昂贵，且常伴随着并发症。通过模拟天然骨的成分和结构，研制开发的仿生骨修复材料为此提供了新的思路和策略。天然骨是具有复杂层级结构的胶原-磷酸钙复合系统，有机相赋予骨干韧性，无机相赋予骨干强度。胶原约占骨干重量的25％～30％，具有典型的四级结构，通过自组装逐渐形成具有一定粒径的纤维，在透射电镜下可以观察到规整的D带型。其表面含有磷酸钙沉积位点，可以诱导磷酸钙在纤维内和纤维外的矿化，调控羟基磷灰石的形貌，因此是骨基质中必不可少的有机物。Ⅰ型胶原是骨组织中含量最丰富和最重要的胶原，存在形式为[α1(Ⅰ)]2[α2(Ⅰ)]1，α1(Ⅰ)的异常会造成骨缺陷。近些年来，由于胶原的生物相容性好、可降解、毒副作用小，广泛应用于骨修复材料。
在不同的生物力学微环境下，骨组织会有不同的反应机制和力学特性，流体剪切力是其中最重要的力学刺激方式之一。Sarit-Sara Sivan，Ellen Wachtel，Eve Tsitron等研究者2008年发表在“The Journal of Biological Chemistry”的文献“Collagenturnover in normal and degenerate human intervertebral discs as determined bythe racemization ofaspartic acid”中指出，胶原的来源部位不同，D-天冬氨酸的累积率也不同，胶原的半衰期也会有差异，结合不同部位所受的应力，得出胶原是一种力敏蛋白，应力环境会影响胶原自组装的结论。
目前可通过两种方式诱导胶原进行自组装：一种方法是调节胶原溶液的温度，在一定温度范围内静置即可启动胶原的自组装机制，形成胶原纤维；另一种方法是调节体系的pH值，在中性条件下静置一段时间也可以形成纤维结构。然而，骨组织中的胶原是处于一定的力学环境中的，在体外模拟胶原的自组装过程时，不仅要考虑到化学因素，也要考虑到生物力学因素。而传统的诱导方法忽略了力学微环境，因此并不能很好地重现体内组装过程。本发明将化学环境和力学环境相耦合，对于新型骨修复材料的开发有很重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于将生物力学因素引入胶原的体外自组装过程，将力学环境与化学环境相结合，提供一种可操作性强、重现性好的体外模拟方法。
本发明提供了一种流体剪切力介导的胶原自组装方法，包括下列步骤：
(1)在离心管中依次加入10x PBS溶液、碱液、去离子水，混合均匀；
(2)将酸溶性Ⅰ型胶原溶液加入其中，用稀释氨水或稀释氢氧化钠溶液调节pH值在7.0～7.4之间；
(3)将混合均匀的上述溶液转移到应力加载装置中，设置不同的流体剪切力大小、作用时间及反应温度，开始施力；
(4)应力加载完毕，收集沉淀；
(5)将沉淀转移到玻片上，用去离子水轻轻冲洗掉上面粘附的离子，自然风干，以待观察形貌，或者转移到离心管中，经离心洗涤、冷冻干燥，得到流体剪切力介导的胶原自组装冻干样品。
上述方法中所述碱液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液中的一种。
上述方法中所述酸溶性Ⅰ型胶原溶液为鼠尾胶原、猪皮胶原或鱼鳞胶原中的一种。
上述方法中所述应力加载装置为能够提供恒定方向流体剪切力的锥板粘度仪、注射泵或平板流动腔循环装置。
上述方法中所述流体剪切力大小为0.1～3.0Pa，作用时间为0.1～24h，反应温度为20～30℃。
上述方法中所述流体剪切力介导的胶原纤维样品，其微观形貌为细长的纤维束，纤维直径10～50μm。
本发明与现有技术相比，其主要优点为：
(1)将生物力学微环境引入到胶原的体外自组装过程，构建了力学-化学耦合体，更好地模拟和重现了体内真实的组装过程。
(2)在流体剪切力的介导下，胶原纤维发生重排，更有利于后续羟基磷灰石的沉积。
(3)本发明得到的是一种新颖的胶原纤维材料，既具有很好的生物相容性和降解性，更具有与人体骨组织胶原相匹配的力学特性，有很广阔的应用空间。
(4)样品的制备方法简单，应力加载过程可实时监测，产品易于回收和处理。
附图说明
附图为流体剪切力介导胶原自组装的示意图。
具体实施方式
下面将结合一些具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，下述实施例仅用于说明本发明，并非限制本发明的保护范围。
实施例1：流体剪切力介导下的胶原自组装
在离心管中依次加入10x PBS溶液400μL、摩尔浓度为1M的NaOH溶液2.76μL、去离子水3.477mL，混合均匀，从4℃冰箱中取出质量浓度为3.34mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液，取119.8μL加入其中，配制成质量浓度为0.10mg/mL的样品溶液，用稀释氨水调节pH在7.0～7.4之间。取3.9mL样品溶液滴加到锥板粘度仪的平板上，放下锥板，设置流体剪切力0.5Pa，作用时间1h，反应温度25℃，开始施力。待应力加载完毕，收集悬浊液，高速离心洗涤3次。将沉淀置于-20℃冰箱中冷冻5h，然后转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h，得到流体剪切力介导的胶原自组装样品。
实施例2：流体剪切力介导下的胶原自组装
在离心管中依次加入10x PBS溶液400μL、摩尔浓度为1M的KOH溶液2.76μL、去离子水3.477mL，混合均匀，从4℃冰箱中取出质量浓度为3.34mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液，取119.8μL加入其中，配制成质量浓度为0.10mg/mL的样品溶液，用稀释氢氧化钠溶液调节pH在7.0～7.4之间。取3.9mL样品溶液滴加到锥板粘度仪的平板上，放下锥板，设置流体剪切力0.5Pa，作用时间1h，反应温度25℃，开始施力。待应力加载完毕，收集悬浊液，高速离心洗涤3次。将沉淀置于-20℃冰箱中冷冻5h，然后转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h，得到流体剪切力介导的胶原自组装样品。
实施例3：流体剪切力介导下的胶原自组装
在离心管中依次加入10x PBS溶液400μL、摩尔浓度为1M的NaOH溶液2.76μL、去离子水3.477mL，混合均匀，从4℃冰箱中取出质量浓度为3.34mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液，取119.8μL加入其中，配制成质量浓度为0.10mg/mL的样品溶液，用稀释氨水调节pH在7.0～7.4之间。取3.9mL样品溶液滴加到锥板粘度仪的平板上，放下锥板，设置流体剪切力2.0Pa，作用时间1h，反应温度25℃，开始施力。待应力加载完毕，收集悬浊液，高速离心洗涤3次。将沉淀置于-20℃冰箱中冷冻5h，然后转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h，得到流体剪切力介导的胶原自组装样品。
实施例4：流体剪切力介导下的胶原自组装
在离心管中依次加入10x PBS溶液400μL、摩尔浓度为1M的NaOH溶液2.76μL、去离子水3.477mL，混合均匀，从4℃冰箱中取出质量浓度为3.34mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液，取119.8μL加入其中，配制成 质量浓度为0.10mg/mL的样品溶液，用稀释氨水调节pH在7.0～7.4之间。取3.9mL样品溶液滴加到锥板粘度仪的平板上，放下锥板，设置流体剪切力0.5Pa，作用时间3h，反应温度25℃，开始施力。待应力加载完毕，收集悬浊液，高速离心洗涤3次。将沉淀置于-20℃冰箱中冷冻5h，然后转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h，得到流体剪切力介导的胶原自组装样品。
实施例5：流体剪切力介导下的胶原自组装
在离心管中依次加入10x PBS溶液400μL、摩尔浓度为1M的NaOH溶液2.76μL、去离子水3.477mL，混合均匀，从4℃冰箱中取出质量浓度为3.34mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液，取119.8μL加入其中，配制成质量浓度为0.10mg/mL的样品溶液，用稀释氨水调节pH在7.0～7.4之间。取3.9mL样品溶液滴加到锥板粘度仪的平板上，放下锥板，设置流体剪切力0.5Pa，作用时间1h，反应温度28℃，开始施力。待应力加载完毕，收集悬浊液，高速离心洗涤3次。将沉淀置于-20℃冰箱中冷冻5h，然后转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h，得到流体剪切力介导的胶原自组装样品。
实施例6：流体剪切力介导下的胶原自组装
在离心管中依次加入10x PBS溶液400μL、摩尔浓度为1M的NaOH溶液2.76μL、去离子水3.477mL，混合均匀，从4℃冰箱中取出质量浓度为3.34mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液，取119.8μL加入其中，配制成质量浓度为0.10mg/mL的样品溶液，用稀释氨水调节pH在7.0～7.4之间。取3.9mL样品溶液加到平板流动腔循环装置中，设置流体剪切力0.5Pa，作用时间1h。待应力加载完毕，收集悬浊液，高速离心洗涤3次。将沉淀置于-20℃冰箱中冷冻5h，然后转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h，得到流体剪切力介导的胶原自组装样品。
Claims (6)
1.一种流体剪切力介导的胶原自组装方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在离心管中依次加入10×PBS溶液、碱液、去离子水，混合均匀；
(2)将酸溶性Ⅰ型胶原溶液加入其中配置成质量浓度为0.10mg/mL的溶液，用稀释氨水或稀释氢氧化钠溶液调节pH值在7.0～7.4之间；
(3)将混合均匀的上述溶液转移到应力加载装置中，设置不同的流体剪切力大小、作用时间及反应温度，开始施力；
(4)应力加载完毕，收集沉淀；
(5)将沉淀转移到玻片上，用去离子水轻轻冲洗掉上面粘附的离子，自然风干，以待观察形貌，或者转移到离心管中，经离心洗涤、冷冻干燥，得到流体剪切力介导的胶原自组装冻干样品。
2.根据权利要求1所述流体剪切力介导的胶原自组装方法，其特征在于，所述碱液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液中的一种。
3.根据权利要求1所述流体剪切力介导的胶原自组装方法，其特征在于，所述酸溶性Ⅰ型胶原溶液为鼠尾胶原、猪皮胶原或鱼鳞胶原中的一种。
4.根据权利要求1所述流体剪切力介导的胶原自组装方法，其特征在于，所述应力加载装置为能够提供恒定方向流体剪切力的椎板粘度仪或平板流动腔循环装置。
5.根据权利要求1所述流体剪切力介导的胶原自组装方法，其特征在于，所述流体剪切力大小为0.1～3.0Pa，作用时间为0.1～24h，反应温度为20～30℃。
6.根据权利要求1～5任一制备方法制备的胶原纤维样品，其特征在于，其微观形貌为细长的纤维束，纤维长度10～50μm。
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