CN105637094B - 用于使生物质水解的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于使生物质水解的方法以及通过该方法制备的含糖渗透产物和含蛋白质的产物。在进一方面，本发明涉及一种用于由含糖产物制备有机化合物的方法。在另一方面，本发明涉及含蛋白质的产物用于制备发酵培养基的用途。

Description

用于使生物质水解的方法
技术领域
本发明涉及用于使生物质水解的方法以及由该方法制备的含糖渗透产物和含蛋白质的产物。在进一方面，本发明涉及用于由含糖渗透物来制备有机化合物的方法。在另一方面，本发明涉及含蛋白质的产物用于制备发酵培养基的用途。
背景技术
来自农作物例如甜菜、玉米、稻草(straw)以及其他含糖或含多糖和含蛋白质的材料的生物质不仅对于精制的糖例如单糖或二糖，而且对于其他成分例如氨基酸、蛋白质和矿物质均是有益来源。
在现有技术状态中存在用于从甜菜中水解和分离和精制单一组分例如糖的方法。但是，在这些方法中，在提取和精制单糖和二糖例如蔗糖之后，其他有益成分例如细胞壁化合物和蛋白质被丢弃。在得到认可的方法中，从例如甜菜中通过在连续对流过程中用热水提取切片的甜菜而移除糖。通常，这种方法需要添加另外的试剂，例如CaO，含量相对于每100kg甜菜为约1-3kg。这种方法的产物是称为原汁的糖溶液和所谓的甜菜果肉，后者在果肉干燥器中干燥。将原汁进一步纯化和过滤，随后浓缩以产生浓汁(65-70％的干物质含量)，或者，在结晶后，产生精制糖。在该方法中升高的温度和pH条件导致溶液中包含的关键量的单糖被破坏。而且，由于氮化合物的分解产生了氨。另外，所谓的甜菜果肉仍然不仅包含甜菜的大部分蛋白质，还包含大部分多糖例如纤维素、半纤维素和果胶。根据GermanZuckerverband，在2011/2012年，德国总计制造了4.266.670吨的糖(以“t Weiβzuckerwert”给出)，对应于1.907.302吨的Schnitzel(“残余物”)(以“tTrockenschnitzelwert”表示)。结果是，每吨糖产生了大约0.45吨的残余物作为废料。(http://www.zuckerverbaende.de/zuckermarkt/zahlen-und-fakten/zuckerm arkt-deutschland/ruebenanbau-zuckererzeugung.html)
一种先进的方法在EP 0737753A1中有述，其公开了通过真空浓缩由甜菜原汁制备蔗糖的方法，其通过向一个或多个蒸发器提供原汁，其中在逆流下浓缩且在较低温度下蒸发更加稀释的果汁。即使已经对该基本方法进行了多种改进，但是很明显，主要缺陷例如高能耗和大量未分化的残余物仍成问题。
另一种用于由甜菜果肉和土豆纤维制备发酵糖浆的方法涉及酶例如纤维素酶和果胶酶的使用，其在Beldman等人(Enzyme Microb.Technol.1984,vol.6,November,p.503-507)中有述。但是，发现在该方法过程中部分酶活性丧失。而且，采用8.44％(g/g)的极高的酶与底物的比例，使得该方法不经济。其中没有提及如何可以使所需的酶浓度最小化。而且，需要两个容器，这很昂贵。另一种使用酶用于甜菜果肉水解的方法在EP 2 256 208A1中有述，但是，所得的产物仍然包含甜菜的固体成分并且没有将其他有益成分进一步分离。
使用化学处理用于使单糖和蔗糖从含纤维素、果胶和半纤维素的生物质例如甜菜中释放的其它方法在现有技术中有述。例如，可以使用非选择性方法例如硫酸处理来使甜菜水解；但是这样的处理在低温下效率较低。在较高温下(例如，在200-250℃下的稀酸蒸汽预处理)得到了抑制性成分例如羟甲基糠醛(HMF)或糠醛，这使得随后的发酵过程有问题(Jing等人,2009Appl Biochem Biotechnol.2009；159(3):696–707)。
因此，需要一种用于使生物质水解的改进的方法，其中不仅可以获得大量的单糖和二糖，还能够保留并分离生物质的有益成分以用于特殊目的。而且，需要一种能量高效和经济性的方法。另外，需要一种使得生物质水解能够采用减少量的水解酶的方法。最后，需要一种用于从生物质中获得较高产率的单糖和二糖的方法。
因此，本发明的目的在于提供一种用于使生物质水解的方法，其不显示在现有技术状态中已知方法的任何缺点。
发明内容
在第一方面，本发明提供用于使生物质水解的方法，其包括以下步骤：
a)将生物质与酶组合物在容器中接触，所述酶组合物包含至少一种选自水解酶类的酶；
b)将一部分所述生物质除去；
c)对所述一部分生物质进行过滤，并移除渗透物；
d)将至少一部分经过滤的生物质反馈回容器；
e)任选地添加与根据步骤c)通过过滤移除的量相对应的量的液体；
其中该方法的步骤b)和步骤c)在不同的回路中进行。
本发明中使用的术语“生物质”指的是本领域技术人员已知适用于本发明方法的任何类型的生物质。特别优选的是植物来源的生物质。在进一步优选的实施方式中，生物质的初始干物质含量选自5-40wt％、更优选15-30wt％。术语“干物质”(d.m.)指的是在使用IR平衡将水和其他挥发性化合物从新鲜组织中移除之后测定的质量与生物质的比例。从而特别优选的是选择其中其干物质包含至少25wt％、更优选至少40wt％、特别优选至少60wt％、进一步优选至少80wt％的糖例如单糖、二糖以及寡糖和/或多糖的生物质。而且，合适的生物质的任意混合物包括在术语“生物质”中。
特别优选的生物质选自“甜菜生物质”和/或“甘蔗生物质”和/或“木质纤维素生物质”。术语“甜菜生物质”指的是甜菜(Beta Vulgaris)的完整且未经处理的根组织，包括其外皮和内部果肉。甜菜的干组织包含80wt％的可溶性蔗糖，而甜菜果肉包含大约7％的果胶、7％的纤维素、7％的半纤维素、17％的阿拉伯糖、20％的葡萄糖和3.5％的果糖以及10％的蛋白质，所有这些均相对于生物质的干物质(d.m.)。术语“甜菜生物质”还包括甜菜果肉(甜菜片)。
术语“甘蔗生物质”指的是甘蔗属的完整且未经处理的茎，包括外皮和内部果肉。甘蔗属的干组织包含80wt％的可溶性蔗糖，而干的甘蔗渣由大约70％的聚合糖组成，包括45％的纤维素、23％的木质素和25％的主要为木聚糖形式的半纤维素，所有这些均相对于生物质的干物质(d.m.)。术语“甘蔗生物质”还包括甘蔗压饼(甘蔗渣)。
术语“木质纤维素生物质”指的是来自农业和林业、食品加工和造纸业以及公共废料的残余物、废料和/或副产物。具体而言，本发明中使用的术语“木质纤维素生物质”包括谷草和/或斯佩尔特小麦(spelt)(例如小麦、黑麦、大麦、燕麦)、玉米秸秆、干草(stover)和/或纺锭(spindles)、草例如Sericea lespedeza、柳枝稷(Panicum virgatum)、象草(芒草(Miscanthus)；中国芦苇)、苏丹草(Sorghum sudananse，Sorghum drummondi)、芦竹、树皮、木材、木材残余物、木片和/或木屑、水果果肉和龙舌兰残余物。
适用于该方法的进一步的生物质是来自畜舍的肥料，草本材料，咖啡粉和来自榨油厂的废料例如来自工厂的菜籽压饼和废水，来自造纸厂的造纸原液(stock)和废水，废纸，蔬菜和水果的残渣。
在本发明方法的一个优选实施方式中，生物质选自含有纤维素、半纤维素和/或木质素的生物质。
在本发明方法的一个特别优选的实施方式中，生物质选自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、木材、油籽及其混合物。
在本发明方法的另一个特别优选的实施方式中，生物质为来自农业残余物例如麦秆、甘蔗渣、甘蔗叶和茎、和/或玉米秸秆和干草的木质纤维素生物质。
本发明中使用的术语“水解”应理解为通过水解反应使聚合物解聚。水解反应应理解为通过添加水使化学键断裂。一种技术上实施水解的方式是向生物质中添加水解酶。
优选地，由于根据本发明的用于使生物质水解的方法，由生物质材料获得糖，其中特别优选所获得的糖的至少50wt％、优选至少65wt％、更优选至少75wt％、同时优选至少85wt％且最优选99wt％处于单糖和二糖的形式，所有这些均相对于生物质的干物质(d.m.)。当应用根据本发明的用于使生物质水解的方法时，还可以由生物质材料获得氨基酸、寡肽、寡糖和/或蛋白质。
优选在进行酶处理之前洗涤生物质，并且在进一步加工之前，将洗涤水移除。而且，优选例如在步骤(a)之前，通过切割、研磨、碾磨、剪切、剪切分散、切削、分散和/或混合来提供颗粒形式的生物质。
该用于使生物质水解的方法的特别优势在于应用相对较大的生物质颗粒将仍然实现有利的结果。生物质颗粒的尺寸优选为使得至少90wt％的颗粒具有200mm、更优选100mm、甚至更优选50mm且最优选25mm的最大长度。进一步优选的是生物质颗粒的尺寸优选为使得至少95wt％的颗粒具有200mm、更优选100mm、甚至更优选50mm且最优选25mm的最大长度。
在用于使生物质水解的方法的步骤(a)中，将生物质与酶组合物接触，所述酶组合物包含至少一种选自水解酶类的酶。
如在用于使生物质水解的方法中使用的术语“接触”包括本领域技术人员已知适用于本发明方法的任何将生物质与酶组合物接触的类型。在优选的实施方式中，生物质与酶组合物的“接触”通过将酶组合物添加到生物质中而实现。而且，特别优选的是添加酶组合物之后或同时进行酶组合物和生物质的混合。
本发明的用于使生物质水解的方法中使用的术语“酶组合物”指的是包括至少一种选自水解酶类的酶的任意组合物。至少一种选自水解酶类的酶的量优选为1-99.99wt％(相对于酶组合物的重量)、进一步优选5-99wt％、特别优选10-95wt％且最优选20-90wt％，并且还可以包含至少一种选自裂解酶类的酶。在本发明的其中酶组合物包含至少一种选自裂解酶类的酶的实施方式中，上述至少一种选自水解酶类的酶的量优选为0.01-50wt％(相对于酶组合物的重量)、优选0.05-20wt％、更优选0.08-5wt％且最优选0.1-1wt％。
在本发明的用于使生物质水解的方法的优选实施方式中，酶组合物包含纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。
在用于使生物质水解的方法的进一步优选的实施方式中，酶组合物还包含至少一种选自果胶甲酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases)、1,3-/1,6-β-D-葡聚糖酶和/木聚糖酶的酶。
在用于使生物质水解的方法的更优选的实施方式中，酶组合物包含纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶以及至少一种选自果胶甲酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶、1,3-/1,6-β-D-葡聚糖酶和/木聚糖酶的酶。
在用于使生物质水解的方法的特别优选的实施方式中，酶组合物包含纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.-)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)、内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28)和果胶/果胶酸盐裂解酶(EC 4.2.2.2,6,9,10)。在进一步特别优选的实施方式中，该酶组合物还包含一种或多种选自β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、糖苷水解酶(GH61和CBM33)、β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(3.1.1.6)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶乙酰酯酶(EC 3.1.1-)、鼠李半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonan acetylesterase)(EC 3.1.1.86)、鼠李半乳糖醛酸聚糖内切酶(EC 4.2.2.23)、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶(EC 4.2.2-)和β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)的酶。
如本发明用于使生物质水解的方法中使用的术语“纤维素酶”、“半纤维素酶”和“果胶酶”指的是参与到聚合纤维素、半纤维素和/或果胶至单糖的水解降解(解聚)中的酶的任意混合物。如本文所用，术语“纤维素酶”、“半纤维素酶”和“果胶酶”指的是天然存在和非天然存在的混合物，其包括多种由有机体例如丝状真菌产生的酶。“纤维素酶”、“半纤维素酶”和“果胶酶”优选源自真菌例如细分真菌门和卵菌门的成员，包括但不限于以下属：曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、镰刀霉属(Fusarium)、Gilocladium、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、Phanerochaete、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、梨孢属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、蓝状菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热真菌属(Thermomyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)和栓菌属(Trametes)。在一个优选的实施方式中，丝状真菌是木霉菌种属。
在酶组合物的一个优选实施方式中，纤维素酶和/或果胶酶来自真菌来源。在酶组合物的一个特别优选的实施方式中，该真菌来源是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
术语“酶混合物”优选指的是由一种或多种微生物来源分泌的酶的混合物。在一些实施方式中，用于这些酶混合物中的酶可以由一种或多种天然存在或经过基因工程的丝状真菌的菌株制备。优选的菌株在以上列出。酶组分在最终混合物中的期望比例可以通过改变酶在最终混合物中的相对量来达到，例如，通过补充纯化的或部分纯化的酶。
如用于使生物质水解的方法中使用的术语“纤维素酶”指的是任何能够使纤维素聚合物水解为较短低聚物和/或葡萄糖的酶。在酶组合物中优选的纤维素酶包括纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.-)、内切-l,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(GH61和CBM33)、Expansin、Swollenin、Loosinin和CIP蛋白(EC 3.1.1.-；CE15)。
在一个优选的酶组合物中，术语“纤维素酶”包括至少一种选自CBH1、CBH2、EG1、EG2、EG4、木聚糖酶和木糖苷酶的酶。
如在用于使生物质水解的方法中使用的术语“半纤维素酶”指的是任何能够使半纤维素降解或支持其降解的酶。
在酶组合物中优选的半纤维素酶包括β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳糖酯酶(3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(EC3.1.1.-)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘露聚糖1,4-甘露二糖苷酶(EC3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-β-l,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181)、葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切-l,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、松柏苷β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.150,151,155)、木聚糖α-1,2-葡糖苷酸酶(glucuronosidase)(EC 3.2.1.131)、内切木半乳糖醛酸聚糖水解酶(EC3.2.1,-；GH28)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1,3-半乳糖苷酶(GH43)、-1,4,-内切半乳聚糖酶(EC 3.5.1.89；GH53)、α-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、木质素过氧化酶(EC 1.11.1.14)、Mn过氧化酶(EC 1.11.1.13)、芳基醇氧化酶(EC 1.1.3.7)、乙二醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9,10)、以及纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)。
如在用于使生物质水解的方法中所使用的术语“果胶酶”指的是任何能够使果胶降解或者支持其降解的酶。在酶组合物中的优选果胶酶包括聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15,67,82；GH28)、果胶/果胶酸盐裂解酶(EC 4.2.2.2,6,9,10)、果胶甲酯酶(EC3.1.1.11)、果胶乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李半乳糖醛酸聚糖内切裂解酶(EC 4.2.2.23)、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶(EC 4.2.2.-,)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶(rhamnogalacturonan galacturonohydrolase)(EC 3.2.1.-)、木半乳糖醛酸聚糖水解酶(EC 3.2.1.-)、果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)、β-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-l,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、β-l,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、α-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、(β-岩藻糖苷酶)(EC 3.2.1.38)、β-apiosidase(EC 3.2.1.-)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(EC 3.2.1.-)、β-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.31)、α-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.139)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和α-木糖苷酶(EC 3.2.1.x)。
在优选的酶组合物中术语“果胶酶”包括至少一种选自果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酸盐裂解酶、果胶裂解酶、木半乳糖醛酸酶、甘露糖苷酶、和鼠李半乳糖醛酸酶。
术语“果胶甲酯酶”指的是E.C.3.1.1.11类的酶，其催化改性聚半乳糖醛酸骨架上甲基取代基的水解。
术语“鼠李半乳糖醛酸酶”指的是E.C.3.2.1类的酶，其催化聚半乳糖醛酸骨架上鼠李糖取代基的水解。
术语“1,3/1,6-D-葡聚糖酶”指的是E.C.3.2.1类的酶，其催化1,3/1,6-改性糖聚合物的己糖取代基的水解。
术语“木聚糖酶”指的是E.C.3.2.1.8类的酶，其催化包含木糖残基的聚合木聚糖、聚合果胶、或半纤维素的随机水解，导致形成了包含木糖的糖低聚物和单体木糖残基。
术语“裂解酶”指的是通过除水解和氧化之外的方式催化多种化学键的断裂的酶，通常形成新的双键或者新的环结构。
根据基于国际生物化学与分子生物学联合会的酶的命名和分类(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)或者基于碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org/)的命名法将本发明用于使生物质水解的方法中提及的酶进行分类。
如本发明的用于使生物质水解方法中使用的术语酶的“活性”指的是在酶充当蛋白质催化剂将特定聚合或人造底物转化成特定低聚或单体产物的合适的条件下的酶的催化活性。在上下文中，术语“合适的条件”对本领域技术人员来说是熟知的且可适用的。
酶可以在给定的混合物中以变化的相对比例采用。
在一个优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行的时间足以使生物质的至少20wt％、优选至少30wt％、更优选至少50wt％且最优选至少60wt％水解。在本发明方法的进一步优选的实施方式中，步骤(a)进行的时间足以使生物质的可水解化合物的10-100wt％、优选50-99.5wt％水解。在本发明中，术语“水解”理解为通过化学、物理、和/或酶促方法例如水解将生物质的不溶聚合成分水解转化为可溶单体、二聚体和/或低聚化合物。
在一个特别优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行1分钟至100小时，更优选10分钟至80小时，特别优选30分钟至40小时，甚至更优选1小时至30小时，还特别优选2小时至20小时。
在进一步优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行至直到残余的不溶固体的含量小于30wt％、优选小于20wt％、甚至更优选小于12.5wt％。在进一步优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行至直到残余的不溶固体的含量为5-30wt％、优选10-20wt％且最优选12.5-17.5wt％。
在本发明的用于使生物质水解的方法的另一个优选实施方式中，步骤(a)进行至直到生物质被液化至少50％、优选至少60％且最优选至少80％，其中特别优选60-100％的液化、优选70-99％的液化。术语“液化”由方法部分给出的相应测量方法所定义。
反应温度优选选自25-80℃、更优选选自45-75℃且特别优选48-70℃。在另一个优选的实施方式中，用于使生物质水解的方法的步骤(a)进行1-80小时、优选2-40小时、更优选3-20小时，其中温度选自45-75℃、或者48-70℃。
优选向生物质中添加含量为生物质干物质的0.025-8wt％、更优选生物质干物质的0.05-4wt％、特别优选生物质干物质的0.08-2wt％，并且最优选生物质干物质的0.1-0.2wt％的酶组合物。
用于使生物质水解的方法的步骤(a)在本领域技术人员已知适用于本发明方法的任意种类的容器中、优选在反应器中进行。合适的反应器在本领域技术人员所知的范围内。优选的容器/反应器包括但不限于包括搅拌措施和/或用于使反应器内的生物质内容物泵送或循环的措施的容器/反应器。优选反应器的进一步优选的措施包括但不限于用于控制温度和/或pH和调节温度和/或pH的措施。
接着如上定义的用于使生物质水解的方法的步骤(a)，根据使生物质水解的方法的步骤(b)，将所述生物质的一部分从容器/反应器除去，在一个优选的实施方式中将所述一部分生物质从容器/反应器中连续地除去。除去操作可以通过将一部分所述生物质经由管线泵出而进行。在一个优选的实施方式中，体积交换率(volumn-exchange-rate)选自0.05-20h-1。优选地，体积交换速率选自0.1-15h-1、更优选0.5-10h-1。在上下文中，术语“体积交换率”理解为每小时从容器中重新得到初始反应体积的次数。将交换率选定在这些范围内保证了生物质在不同回路中的连续流动。从而术语“反应体积”涉及容器中存在的生物质和酶组合物的总体积。
然后根据用于使生物质水解的方法的步骤(c)使所除去的一部分生物质进行过滤。为达到最大效率和生产量，用于使生物质水解的方法的步骤(b)和(c)在不同的回路中进行，优选在至少两个不同的回路中进行。优选的是由外部回路和内部回路组成的两个回路。第一(或优选的外部)回路始于使用第一泵根据步骤(b)将一部分生物质运输和除去开始。然后将该生物质泵入第二(或优选的内部)回路，其包括第二泵和至少一个过滤组件。第二泵用于首先将所除去的一部分运输至该至少一个过滤组件且然后通过该至少一个过滤组件。根据步骤(c)将渗透物从至少一个过滤组件中移除。根据步骤(d)，将至少一部分经过滤的生物质在通过至少一个过滤组件后从第二(或优选的内部)回路收回并反馈回容器中。
两个回路/管线均装配有各自独立的提升装置-例如泵-以便能够选择用于第一和第二(或优选的外部和内部)两个回路/管线的不同的提升速度和压力。在一个优选的实施方式中，两个回路/管线均装配有泵。在一个特别优选的实施方式中，第一回路的提升装置置于容器与从第一回路至第二回路的过渡之间，并且第二回路的提升装置置于从第一回路至第二回路的过渡与过滤组件之间。在进一步特别优选的实施方式中，第一回路的提升装置建立0.25-8bar、更优选0.5-6bar、最优选1-4bar的压力。在进一步特别优选的实施方式中，第二回路的提升装置应优选产生0.1-10m/s、更优选1-8m/s、甚至更优选3-5m/s的错流速度。进一步优选的是在第一回路内建立1-4bar的压力结合在第二回路内3-5m/s的错流速度。优选的容器内生物质体积与第二回路内生物质体积的比例为1-1000、更优选10-750且甚至更优选20-500并且最优选25-400。
在用于使生物质水解的方法的另一个优选实施方式中，对膜进行反冲洗(back-flushed)以避免膜的堵塞。这样的反冲洗是通过将膜渗透侧上的压力增加至等于或大于进料侧的压力来实现的。在一个优选的实施方式中，渗透侧的压力比进料侧的压力高0-10bar、更优选比进料侧的压力高0.05-8bar、甚至更优选比进料侧的压力高0.1-6bar、并且最优选比进料侧的压力高0.15-4bar。这样的反冲洗可以实施一次或数次。在一个优选的实施方式中，膜每小时被反冲洗0.05-120次、更优选每小时0.1-60次、且更优选每小时0.15-30次、并且最优选每小时0.2-15次。在另一个优选的实施方式中，所有的反冲洗步骤的总和与步骤(c)的处理时间的比例为0-0.5、更优选0.001-0.4、甚至更优选0.002-0.3、且最优选0.004-0.2。反冲洗可以通过使用液体进行。在一个优选的实施方式中，液体为渗透物、水或渗透物和水的混合物。在另一个优选的实施方式中，可以向液体中添加另外的化学品例如清洁剂、酸、碱或其任意混合物。在另一个优选的实施方式中，可以通过向渗透的进料侧注入气体增强反冲洗的清洁效果。在一个优选的实施方式中，注入的气体是空气。
根据用于使生物质水解的方法的步骤(c)的过滤优选通过使用一个或多个包含至少一个过滤膜的过滤组件进行。优选每个过滤组件在错流(cross-flow)模式下操作。优选至少一个过滤膜是超滤膜。在一个特别优选的实施方式中，超滤膜是陶瓷膜、不锈钢膜、合成膜(优选包括聚砜)或者硅或含硅的膜或者它们的任意组合。在进一步特别优选的实施方式中，膜的截流选自0.5kDa-100kDa、更优选1kDa-50kDa、甚至更优选2kDa-25kDa。使用如本文所述用于使生物质水解的本发明方法中的超滤，获得了包含特别高含量的可溶化合物例如单糖和二糖但基本上不含有微生物污染物和较大生物聚合物例如蛋白质和多糖的渗透产物。因此，所得的渗透产物显示出较长的储存稳定性，这在此之前不添加防腐剂和/或通过使用生物保存的情况下是无法实现的。同时，没有酶的损失，因为所有使用的酶均保留在生物质内。因此，在容器内的酶浓度甚至随着时间增加。这构成了用于使生物质水解的本发明方法的特别优势，因为其随着处理时间大大增加水解反应速率。
根据本发明的用于使生物质水解的方法，至少一个过滤组件的至少一个膜还可以是微滤膜。在一个特别优选的实施方式中，微滤膜是陶瓷膜、不锈钢膜、合成膜(优选包括聚砜)或者硅或含硅的膜或者它们的任意组合。这对于本发明方法的应用是特别优选的，在本发明方法中使用的酶组合物主要由能够吸附在生物质固体颗粒表面上的酶组成，例如具有纤维素结合结构域的纤维素酶。在至少一个过滤组件中使用微滤膜的优点在于单位时间相对较高的渗透率，这使得能够实施与超滤膜相比较小的膜表面。
在一个特别优选的实施方式中，膜面积相对于每1000kg添加的生物质为0.05-100m2、进一步优选相对于每1000kg添加的生物质为0.1-70m2、更优选相对于每1000kg添加的生物质为0.2-50m2并且最优选相对于每1000kg添加的生物质为0.4-25m2。
优选将通过过滤得到的渗透产物连续地移除并且还可以将其收集在第二容器中。此外，根据用于使生物质水解的方法的步骤(d)，将剩余的经过滤的生物质或优选剩余的经过滤的生物质的一部分反馈回容器。当仅有一部分经过滤的生物质反馈回容器中的情况下，其他的生物质被泵入第二(或优选的内部)回路中。反馈到水解容器中(步骤d)的流量与渗透流量(步骤c)的优选比例为0.05-50、更优选0.1-25、且甚至更优选0.25-10且最优选0.5-5。反馈回容器的生物质与泵入第二(或优选的内部)回路内的那部分生物质的比例由生物质从容器进入外部回路以及渗透物流经至少一个过滤组件的流速而确定。
如果根据进一步任选的步骤(e)向生物质中添加一定量的液体，所述量与根据方法的步骤(c)过滤后移除的渗透产物内液体的量相对应，这是用于使生物质水解的本发明方法的特别优点。术语“与渗透产物内液体的量相对应地添加液体”应理解为添加液体的量为在方法的步骤(c)中每次移除的渗透产物内的液体的至少10vol％、优选至少25vol％、更优选至少50vol％、更优选至少70vol％，并且进一步优选为选自50-150vol％、优选70-130vol％且最优选80-120vol％。如果添加的液体体积等于渗透产物的体积是特别优选的。在另一个优选的实施方式中，连续添加液体。因此，在任选的步骤(e)期间添加到生物质中的液体的量至少部分补偿了根据步骤(c)移除的体积。
在用于使生物质水解的方法的一个特别优选的实施方式中，将与通过过滤移除的量相对应的量的液体直接添加到容器中。在用于使生物质水解的方法的另一个特别优选的实施方式中，将与通过过滤移除的量相对应的量的液体通过如上所述的对膜的反冲洗而添加。
但是，在本领域技术人员已知适用于本发明目的的用于使生物质水解的方法中的任何其他阶段添加液体也包含在本发明的范围内。优选地，将上述量的液体添加到经过滤的生物质中，即，在进行用于使生物质水解的方法的步骤(c)之后。更优选地，在容器的含量降低至初始未过滤体积的0.25-40％、更优选在降低至初始未过滤体积的0.5-30％时、甚至更优选在降低至1-20％之后，将上述量的液体添加到经过滤的生物质中。添加与过滤期间移除的量相对应的量的液体是特别有利的，因为通过在水解之后对残留在系统中少量的不溶的生物质剩余物进行冲洗并且随其携带仍然存在于固体表面上的可溶糖剩余物经过膜，产率的增长得以实现。优选添加的液体是水。
在不根据方法的步骤(e)添加液体的用于使生物质水解的本发明方法的实施方式中，经过滤的生物质仍然包含与渗透物相同浓度的糖。本发明方法的该实施方式对于将经过滤的生物质(在该情况下相当于含有蛋白质的产物)用作发酵底物或发酵培养基的补充物可能是有利的。
在本发明中还优选根据步骤(f)添加新鲜生物质而在使生物质水解的过程中添加新鲜的生物质。
这样的添加可以在方法的任意时间进行。在一个优选的实施方式中，与所有处理的生物质的总和相比，在方法开始时容器中存在的生物质的百分比为至少1wt％、优选至少5wt％、更优选至少10wt％且最优选至少15wt％。特别优选的是，与所有处理的生物质的总和相比，在方法开始时容器中存在的生物质的百分比选自1-40wt％、优选5-35wt％且特别优选10-25wt％的范围。该实施方式是优选的，因为在方法的不同时间添加总生物质的各部分是有利的，因为不需要在实施本发明方法之前储存大量新鲜的生物质。
在另一个优选的实施方式中，在方法停止之前的至少1小时、优选在方法停止之前的至少2小时、更优选在方法停止之前的至少3小时且最优选在方法停止之前的至少4小时停止添加新鲜的生物质。尤其优选的是在步骤(e)开始之前的至少1小时、优选在步骤(e)开始之前的至少2小时、更优选在步骤(e)开始之前的至少3小时且最优选在步骤(e)开始之前的至少4小时停止添加新鲜的生物质。
在用于使生物质水解的方法的优选实施方式中，将步骤(b)至(e)或步骤(b)至(f)重复至少一次以保证生物质的期望化合物的尽可能多的产率。在一个特别优选的实施方式中，将步骤(b)至(e)或步骤(b)至(f)重复2-10000次、优选10-7000次、更优选50-5000次且最优选100-1000次。在用于使生物质水解的方法的进一步优选的实施方式中，将步骤(b)至(e)或步骤(b)至(f)重复至直到经过滤的生物质中残留的可溶己糖的含量相对于生物质中初始总己糖含量为小于4wt％、优选小于2wt％、甚至更优选小于1wt％并且最优选小于0.5wt％。在用于使生物质水解的方法的一个特别优选的实施方式中，以能够实现连续工艺的方式实施步骤(b)至(e)或步骤(b)至(f)。
在根据本发明用于使生物质水解的方法中，如果步骤(a)和(b)同时进行步骤(a)的时间的至少80％、优选50-95％、特别优选60-90％、并且最优选70-85％是特别有利的。
在根据本发明的用于使生物质水解的方法中，如果步骤(a)和(c)同时进行步骤(a)的时间的至少80％、优选50-95％、特别优选60-90％、并且最优选70-85％是特别有利的。
在根据本发明的用于使生物质水解的方法中，如果步骤(a)和(d)同时进行步骤(a)的时间的至少80％、优选50-95％、特别优选60-90％、并且最优选70-85％是特别有利的。
在根据本发明的用于使生物质水解的方法中，如果步骤(a)和(e)同时进行步骤(a)的时间的至少0.1％、优选1-40％、特别优选2-30％、并且最优选3-20％是特别有利的。
在用于使生物质水解的方法的特别优选的实施方式中，添加到生物质的酶组合物的量为生物质干物质的0.05-0.15wt％，并且在3-7小时之后开始工序步骤(b)。在该方法的另一特别优选的实施方式中，添加到生物质的酶组合物的量为生物质干物质的0.15-0.25wt％，并且在2-6小时后开始工序步骤(b)。本发明的用于使生物质水解的方法能够得到具有在单糖和寡糖方面较高含量的糖的渗透产物，其显示出特别长的储存稳定性，因为其完全不含有微生物污染物。出于该原因，通常根据本发明的方法可得到的渗透产物还高度适用于食品和饲料应用。而且，渗透产物高度适用于医药应用。
因此，本发明在另一方面包括含糖渗透产物，其由本发明定义的方法制备。
在本发明的一个优选的实施方式中，渗透产物每升包括至少80g糖、优选每升100g、更优选每升120g且最优选每升130g。在本发明的一个优选的实施方式中，渗透产物每升包括至少50g果糖、优选每升至少60g果糖且还优选果糖含量为每升50-100g。在本发明的一个进一步优选的实施方式中，渗透产物每升包括至少50g的葡萄糖、优选每升至少60g葡萄糖且还优选葡萄糖含量为每升50-100g，其中特别优选的是单糖和二糖的总量为每升80g至每升200g。
本发明的用于使生物质水解的方法还能够获得具有高蛋白质含量和低糖含量的含有蛋白质的产物，优选糖含量低于4wt％但是氮含量较高，其优选在0.2-5wt％的范围内、进一步优选在0.3-4wt％的范围内。因此通过本发明的方法可得到的含有蛋白质的产物高度适合用作商业发酵培养基的补充物或者作为发酵培养基，或者用于食品和饲料应用。
因此本发明在另一方面包括含有蛋白质的产物，其通过本发明中所定义的方法制备。
在本发明的一个优选实施方式中，含有蛋白质的产物包括至少1wt％的蛋白质、优选至少2.5wt％的蛋白质、更优选至少5wt％的蛋白质、甚至更优选至少7.5wt％的蛋白质且最优选至少10wt％的蛋白质。
在进一方面，本发明涉及含有蛋白质的产物用于制备发酵培养基或者其中高蛋白质含量有益的食品和饲料应用中的用途。由于含有蛋白质的产物还包含相当高含量的氮，该含有蛋白质的产物特别适用于作为用于制备酶的发酵培养基的补充物。
在另一个方面，本发明涉及用于由如上所定义的含糖渗透产物制备有机化合物的方法，其包括以下步骤：
a)将含糖渗透产物与至少一种能够将渗透产物转化成至少一种有
机化合物的微生物接触，所述微生物选自酵母、细菌、真菌和它
们的混合物；
b)含糖渗透产物的发酵；
c)分离有机化合物。
根据有机化合物的制备方法，在将含糖渗透产物与至少一种微生物接触期间的温度选自10-65℃、优选15-55℃、特别优选20-50℃、最优选25-45℃。
特别优选的是使用嗜温酵母，例如所有酵母(Saccaromyces)属的种属，特别是贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)、Saccharomycesbulderi、Saccharomyces cariocanus、Saccharomyces cariocus、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、Saccharomycesdairenensis、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、真贝酵母(Saccharomyceseubayanus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、Saccharomyces florentinus、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces martiniae、Saccharomyces monacensis、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces spencerorum、Saccharomycesturicensis、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、Saccharomyces zonatus，以及Arxula adeninovorans、核黄菌(Ashbyagossypii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、Debaramyces hansenii、Horteawerneckii、乳酸克鲁维酵母(Kluyeveromyces lactis)、西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、Thrichosporon domesticum、Thrichosporon montevideense、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrohous)、Yarowia lypolytica、拜耳结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、赛沟毕赤酵母(Pichiasegobiensis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、纤细假丝酵母(Candida tenuis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、无名假丝酵母(Candida famata)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、Candida sonorensis、Candida sonorensis、陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)、埃皮斯克勒克酵母(Kloeckera apis)、巴氏毕赤酵母(Pichiabarkeri)、喜仙人掌毕赤氏酵母(Pichia cactophila)、Pichia deserticola、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranefaciens)、墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana)和戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)以及它们的混合物。
在用于由含糖渗透产物制备有机化合物的方法的一个另外可选的方式中，使用嗜热微生物。适用于本发明方法的嗜热酵母的实例为Candida bovina、Candidapicachoensis、Candida emberorum、Candida pintolopesii、Candida thermophila、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、Kazachstania telluris、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)。优选的嗜热菌包括热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridium thermohydrosulphuricum、热解糖梭菌(Clostridiumthermosaccharolyticum)、布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)、乙酸乙基嗜热拟杆菌(Thermobacteroides acetoethylicus)、嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)、Clostridium thermoaceticum、热自养梭菌(Clostridiumthermoautotrophicum)、凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、致黑脱硫肠状菌(Desulfotomaculum nigrificans)和Desulvovibrio thermophilus、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)和Thermoanaerobacter mathranii。
以下嗜温酵母的使用是特别优选的：酿酒酵母、树干毕赤酵母、嗜鞣管囊酵母、休哈塔假丝酵母。
在用于由含糖渗透产物制备有机化合物的方法的一个另外可选的方式中使用真菌。适用于本发明方法的真菌的实例为曲霉属(Aspergillus sp.)、木霉属(Trichodermasp.)、青霉属(Penicillium sp.)、枝顶孢属(Acremonium sp.)、根霉属(Rhizopus sp.)和蓝状菌属(Talaromyces sp.)。
在用于由含糖渗透产物制备有机化合物的方法的一个另外可选的方式中使用细菌。适用于本发明方法的细菌的实例为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、大肠杆菌(Escherichoia coli)。
发酵优选以分批模式(不连续)、分批进料模式或连续模式实施。最优选地，发酵以分批模式实施。
在一个优选的实施方式中，在用于制备有机化合物的方法的步骤a)之前，向含糖渗透产物中添加矿物质例如含有铜、锌、镁、钙、铁和含氮化合物例如硝酸盐、氨基酸、氨。在用于制备有机化合物的方法的一个特别优选的实施方式中，向发酵培养基中添加含蛋白质的产物的一部分。
从含糖渗透产物的细菌发酵中得到的有价值的有机化合物包括但不限于，有机酸(例如乙酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、富马酸、丙酸和葡萄糖醛酸)，氨基酸(例如谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天门氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸)，己内酰胺(例如α-氨基己内酰胺)，抗生素(例如博来霉素、维及霉素、洁霉素、莫能霉素、杀稻瘟菌素、四环素)，维生素(例如维生素B2、B12和C)，酶，核苷酸/核苷(例如NADH、ATP、cAMP、FAD、辅酶A)，生物气，生物聚合物(例如聚羟基丁酸酯、聚酰胺/蚕丝蛋白)，蛋白质，多糖(例如黄原胶、右旋糖酐)，氨基葡聚糖(例如透明质酸)以及有机溶剂和生物燃料(例如丙酮、乙醇、丁醇、丙二醇)。
从含糖渗透产物的酵母发酵中得到的有价值的有机化合物包括但不限于有机溶剂(例如乙醇、丙醇)，核苷酸(例如RNA)，生物表面活性剂(例如槐糖脂质)，酶以及生物聚合物(例如spidroins)。
从含糖渗透产物的真菌发酵中得到的有价值的有机化合物包括有机酸(例如柠檬酸、富马酸、衣康酸)，抗生素(例如青霉素、头孢菌素)，酶和多糖(例如几丁质)。
在本方法的进一步优选的实施方式中，有机化合物选自醇、有机酸、生物聚合物、抗生素、氨基酸、己内酰胺、多糖、有机溶剂、生物燃料、氨基葡聚糖、核苷酸/核苷、维生素、生物表面活性剂、和它们的混合物。
进一步令人惊奇地发现，通过本发明方法得到的含蛋白质的产物是对于细菌、酵母和真菌有机体来说极好的发酵底物或者商业发酵培养基的补充物，产生了增加价值的产物例如酶、药物或化学产物。从而该含蛋白质的产物还充当用于制备发酵培养基的基础。
因此，在本发明的进一方面中，涉及如上定义的含蛋白质的产物在用于制备发酵培养基中的用途。
优选的发酵方法包括使用酿酒酵母将糖发酵成乙醇或者使用乳杆菌菌株将糖发酵成乳酸或者使用土曲霉将糖发酵成衣康酸。尤其优选的是，这些发酵在不需要任何补充物的情况下进行。
在以下描述了本发明特别优选的实施方式，其不应被理解为在任何方面对发明进行限制。
特别优选的实施方式1
特别优选的是用于使生物质水解的方法，其包括以下步骤：
a)将生物质与酶组合物在容器中接触，所述酶组合物包含至少一种选自水解酶类的酶；
b)将一部分所述生物质除去；
c)使所述一部分生物质进行过滤并移除渗透物；
d)将至少一部分经过滤的生物质反馈回容器；
e)添加与根据步骤c)通过过滤移除的量相对应的量的液体；
其中方法的步骤b)和c)在不同的回路中进行，并且
其中过滤通过使用至少一个过滤组件进行，所述过滤组件包括至少一个超滤膜。在该优选的实施方式中，进一步优选酶组合物包含纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。
特别优选的实施方式2
特别优选的是用于使生物质水解的方法，其包括以下步骤：
a)将生物质与酶组合物在容器中接触，所述酶组合物包含至少一种选自水解酶类的酶；
b)将一部分所述生物质除去；
c)使所述一部分生物质进行过滤并移除渗透物；
d)将至少一部分经过滤的生物质反馈回容器；
e)添加与根据步骤c)通过过滤移除的量相对应的量的液体；
其中方法的步骤b)和c)在至少两个不同的回路中进行，即，至少一个内部回路和一个外部回路，其中每个回路装配有提升装置例如泵，并且内部回路还包括至少一个过滤组件，所述过滤组件优选包括至少一个超滤膜；
其中通过外部回路的泵施加的压力优选选自0.25-8bar、更优选1-4bar，并且其中至少一个内部回路的错流速度各自选自0.1-10m/s、优选3-5m/s。
特别优选的实施方式3
特别优选的是含糖渗透产物，其通过如本发明中所定义的方法制备，具有每升至少100g糖的糖含量，其中最优选至少40wt％的该糖含量为葡萄糖。
特别优选的实施方式4
特别优选的是含蛋白质的产物，其通过如本发明中所定义的方法制备，具有低于4wt％的糖含量但具有高的氮含量，其中优选0.3-4wt％的氮含量。
方法
测定生物质液化的百分比
将酶组合物和具有15％的d.m.含量的生物质的反应混合物(20mL)与50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)混合。将混合物在50℃孵育30分钟至5小时。然后，将反应混合物在3200g离心30分钟，并且将上清液分离并称重。将1ml上清液在95℃下热灭活10分钟，并且通过具有Aminex
Figure BDA0000966038180000212
(BioRad Labs,Hercules,USA)离子交换柱(洗脱剂：100％的水，T：85℃，流速：0.6ml/min，RI检测)的HPLC(
Figure BDA0000966038180000213
德国)分析释放出的糖的量。
Figure BDA0000966038180000211
附图说明
现在，通过以下实施例和附图来描述本发明。所有的实施例和附图仅出于示例说明性的目的而不应理解为对本发明进行限制。
图1显示出用于使生物质水解的本发明方法的步骤a)至e)的特定组合如何使容器内的酶浓度随着根据方法的步骤c)的过滤的进行随着时间增加。而且，随着根据步骤c)的过滤的进行和根据方法的步骤e)的液体添加，水解反应速率增加。
图2显示出适用于实施根据发明的用于使生物质水解的方法的示例性工艺设置，其实施一个过滤组件和两个回路(内部和外部回路)。
图3显示出适用于实施根据发明的用于使生物质水解的方法的示例性工艺设置，其实施两个回路(内部和外部回路)和在内部回路中并联的两个过滤组件。
图4显示出适用于实施根据发明的用于使生物质水解的方法的示例性工艺设置，其实施两个回路(内部和外部回路)和在内部回路中串联的两个过滤组件。
图5显示出适用于实施根据发明的用于使生物质水解的方法的示例性工艺设置，其实施一个外部回路和两个并联的内部回路。
图1对于本发明的方法中体积、酶浓度和糖产量的时间进程的说明
通过将生物质与酶组合物接触(步骤a)而开始该工艺。在仅进行步骤(a)的期间，体积和酶浓度保持恒定并且一部分生物质水解。
在一定时间后，除了步骤(a)还开始步骤(b)、(c)和(d)。由于渗透物被移除，体积下降，并且在渗透物中得到糖。因此，糖产量增加。由于酶通过膜得以保留，酶浓度增加，这改进水解。
当体积达到某个最小值时，通过连续添加与被移除渗透物相同量的水而另外开始步骤(e)。因此，体积以及酶浓度保持恒定。将糖洗出，因此糖产量进一步增加。
当在水的添加与糖产量的增加之间达到经济最佳化时，停止该过程。
图2实施一个过滤组件和两个回路(内部和外部回路)的示例性工艺设置
通过使用根据图2的工艺设置来实施根据本发明的用于使生物质水解的方法，将生物质供应至装有搅拌器(1)的容器(2)中。在容器(2)内(至少)部分地实施根据方法的步骤a)之后，根据方法的步骤b)将一部分生物质除去，并且将其通过使用第一管线(5a)运送至外部回路(5)并通过第一泵(4)泵送至内部回路(8)。
在内部回路(8)中，将除去的一部分生物质通过使用第二管线(8a)运送至第二泵(6)。第二泵(6)与第一泵(4)分开操作，从而选择泵送速率以达到所需的错流速度。第二泵(6)将除去的一部分生物质泵送至过滤组件(7)以使生物质进行根据方法的步骤c)的过滤。然后将渗透物通过管线(10)从过滤组件(7)移除，其中通过阀(9)控制输出体积。
然后将经过滤的生物质进一步通过第三管线(8b)在内部回路(8)中运输至外部回路(5)，其中通过阀(3)来调节经由第四管线(5b)根据方法的步骤d)反馈回容器的至少一部分经过滤的生物质的体积。在只有一部分经过滤的生物质反馈回容器(2)的情况下，通过使用管线(8.1e)将余下的经过滤的生物质在内部回路(8)中循环。将与过滤期间移除的量相对应的量的液体通过管线(12)从储器(11)添加到容器(2)中。
图3实施两个回路(内部和外部回路)和两个在内部回路中并联的过滤组件的示例 性工艺设置
通过使用根据图3的工艺设置来实施根据本发明的用于使生物质水解的方法，将生物质供应至装有搅拌器(1)的容器(2)中。在容器(2)内(至少)部分地实施根据方法的步骤a)之后，根据方法的步骤b)将一部分生物质除去，并且将其通过使用第一管线(5a)运送至外部回路(5)并通过第一泵(4)泵送至内部回路(8)。
在内部回路(8)中，将除去的一部分生物质通过使用第二管线(8.1a)运送至第二泵(6)。第二泵(6)与第一泵(4)分开操作，从而选择泵送速率以达到所需的错流速度。第二泵(6)将除去的一部分生物质通过使用管线(8.1c)泵送至第一过滤组件(7.1)，而且同时，通过使用管线(8.2a)泵送至第二过滤组件(7.2)，以使生物质进行根据方法的步骤c)的过滤。因此，根据图3的示例性工艺设置，第一和第二过滤组件(7.1)和(7.2)可以并联操作。然后将渗透物通过管线(10.1)和管线(10.2)从第一过滤组件(7.1)和第二过滤组件(7.2)移除，其中通过阀(9.1)和阀(9.2)独立地控制输出体积。
然后将经过滤的生物质进一步通过管线(8.1b)、(8.1d)且通过管线(8.2b)在内部回路(8)中运输至外部回路(5)，其中通过阀(3)来调节经由管线(5b)根据方法的步骤d)反馈回反应器的经过滤的生物质的体积。在仅有一部分经过滤的生物质反馈回容器(2)的情况下，通过使用管线(8.1e)将余下的经过滤的生物质在内部回路(8)中循环。将与过滤期间移除的量相对应的量的液体通过管线(12)从储器(11)添加到容器中。
图4实施两个回路(内部和外部回路)和两个在内部回路中串联的过滤组件的示例 性工艺设置
通过使用根据图4的工艺设置来实施根据本发明的用于使生物质水解的方法，将生物质供应至装有搅拌器(1)的容器(2)中。在容器(2)内(至少)部分地实施根据方法的步骤a)之后，根据方法的步骤b)将一部分生物质除去，并且将其通过使用第一管线(5a)运送至外部回路(5)，并且通过第一泵(4)泵送至内部回路(8)。
在内部回路(8)中将除去的一部分生物质通过使用第二管线(8a)运送至第二泵(6.1)。第二泵(6.1)与第一泵(4)分开操作，从而选择泵送速率以达到所需的错流速度。第二泵(6.1)将除去的一部分生物质泵送至第一过滤组件(7.1)，以使生物质进行根据方法的步骤c)的过滤。然后将渗透物通过管线(10.1)从第一过滤组件(7.1)移除，其中通过阀(9.1)独立地控制输出体积。
然后将经过滤的生物质进一步通过管线(8c)在内部回路(8)中运输并通过第三泵(6.2)泵送至第二过滤组件(7.2)，从而选择泵送速率以达到所需的错流速度。第三泵(6.2)同样与第一泵(4)和第二泵(6.1)分开操作。然后通过管线(10.2)将渗透物从第二过滤组件(7.2)中移除，其中通过阀(9.2)独立地控制输出体积。因此，根据图4的示例性工艺设置，第一和第二过滤组件(7.1)和(7.2)可以串联操作。
然后将经过滤的生物质进一步通过管线(8b)在内部回路(8)中运输至外部管线(5)，其中通过阀(3)来调节经由管线(5b)根据方法的步骤d)反馈回反应器的经过滤的生物质的体积。在只有一部分经过滤的生物质反馈回容器(2)的情况下，通过使用管线(8.1e)将余下的经过滤的生物质在内部回路(8)中循环。将与过滤期间移除的量相应的量的液体通过管线(12)从储器(11)添加到容器中。
图5实施一个外部回路和两个并联的内部回路的示例性工艺设置
通过使用根据图5的工艺设置来实施根据本发明的用于使生物质水解的方法，将生物质供应至装有搅拌器(1)的容器(2)中。在容器(2)内(至少)部分地实施根据方法的步骤a)之后，根据方法的步骤b)将一部分生物质除去，并且将其通过使用第一管线(5a)运送至外部回路(5)并通过第一泵(4)泵送至第一内部回路(8.1)，且同时泵送至第二内部回路(8.2)。
在第一内部回路(8.1)中将除去的一部分生物质通过使用管线(8.1a)运送至第二泵(6.1)。第二泵(6.1)与第一泵(4)分开操作，从而选择泵送速率以达到所需的错流速度。第二泵(6.1)将除去的一部分生物质泵送至第一过滤组件(7.1)，以使生物质进行根据方法的步骤c)的过滤。
在第二内部回路(8.2)中将除去的一部分生物质通过使用管线(8.2a)运送至第三泵(6.2)。第三泵(6.2)与第一泵(4)和第二泵(6.1)分开操作，从而选择泵送速率以达到所需的错流速度。第三泵(6.2)将除去的一部分生物质泵送至第二过滤组件(7.2)，以使生物质进行根据方法的步骤c)的过滤。因此，根据图5的示例性工艺设置，第一和第二内部回路(8.1)和(8.2)可以并联操作。
然后将渗透物通过管线(10.1)和管线(10.2)从第一过滤组件(7.1)和第二过滤组件(7.2)移除，其中独立地通过阀(9.1)和阀(9.2)来控制输出体积。然后将经过滤的生物质进一步通过管线(8.1b)在第一内部回路(8.1)、并通过管线(8.2b)在第二内部回路(8.2)中运输至外部回路(5)，其中通过阀(3)来调节经由管线(5b)根据方法的步骤d)反馈回反应器的经过滤的生物质的体积。在只有一部分经过滤的生物质反馈回容器(2)的情况下，通过使用管线(8.1e)将余下的经过滤的生物质在内部回路(8.1)和/或内部回路(8.2)中循环。将与过滤期间移除的量相应的量的液体通过管线(12)从储器(11)添加到容器中。
具体实施方式
实施例1：
由取样自德国贝德堡(Bedburg)的新鲜甜菜根制备全甜菜材料。洗涤甜菜根以除去残留的土并且切割。然后通过高剪切混合器对材料进行处理以使其允许泵送。甜菜材料平均具有22％的d.m.含量。
使用以下的酶：43.4％(w/w)的
Figure BDA0000966038180000262
6.3％(w/w)的
Figure BDA0000966038180000264
Figure BDA0000966038180000263
和50.3％(w/w)Pectinex Ultra
Figure BDA0000966038180000265
这些产品混合在50mM的NaAc缓冲液(pH＝5)中。
将该酶混合物与200kg新鲜的甜菜材料以0.2wt％的E/S混合。最终的反应混合物包含18％d.m.的甜菜材料。将混合物在轻微搅拌下在50℃孵育。在孵育4小时后，使用各自装有泵的两个回路(一个用于增加跨膜压力且一个用于使生物质通过膜单元运输)开始超滤步骤。使用的膜是具有10kDa截留的陶瓷膜(GEA Filtration,GEA Wiegand GmbH)。应用的跨膜压力为0.5-3bar且错流速度为3-4m/s。得到的渗透物流量为15-20L/h。在9小时超滤后，将去离子水以15-20L/h添加至反应器中，而超滤在相同的渗透物流速下继续进行。在2小时后停止该工艺。最终的渗透物质量和回收的保留物质量分别为180kg和160kg。C6糖产率>98％并且液化达到85wt％。
随后将样品用于HPLC分析。通过具有Aminex HPX 87(BioRad Labs,Hercules,USA)离子交换柱(洗脱剂：100％的水，T：85℃，流速：0.6ml/min，RI检测)的HPLC(Agilent，德国)分析得到的水解混合物。
结果示于表1。
Figure BDA0000966038180000261
表1显示出在步骤b)至d)期间得到的渗透物、步骤b)至e)期间得到的渗透物和经过滤的生物质中得到的糖浓度(误差估计为+/-10％)。
实施例2
由取样自德国贝德堡(Bedburg)的新鲜甜菜根制备全甜菜材料。洗涤甜菜根以除去残留的土并且切割。然后通过高剪切混合器对材料进行处理以使其允许泵送。甜菜材料平均具有22％的d.m.含量。
使用以下的酶：43.4％(w/w)的
Figure BDA0000966038180000272
6.3％(w/w)的
Figure BDA0000966038180000274
Figure BDA0000966038180000273
和50.3％(w/w)Pectinex Ultra
Figure BDA0000966038180000275
这些产品混合在50mM的NaAc缓冲液(pH＝5)中。
将该酶混合物与150kg新鲜的甜菜材料以0.1wt％的E/S混合。最终的反应混合物包含18％d.m.的甜菜材料。将混合物在轻微搅拌下在50℃孵育。在孵育5小时后，使用各自装有泵的两个回路(一个用于增加跨膜压力且一个用于使生物质通过膜单元运输)开始超滤步骤。使用的膜是具有10kDa截留的陶瓷膜(GEA Filtration,GEA Wiegand GmbH)。应用的跨膜压力为0.5-3bar且错流速度为3-4m/s。得到的渗透物流量为10-20L/h。在9小时超滤后，将去离子水以10-20L/h添加至反应器中，而超滤在相同的渗透物流速下继续进行。在1.5小时后停止该工艺。最终的渗透物质量和回收的保留物质量分别为126kg和16kg。C6糖产率>90％并且液化达到80wt％。
随后将样品用于HPLC分析。通过具有Aminex HPX 87(BioRad Labs,Hercules,USA)离子交换柱(洗脱剂：100％的水，T：85℃，流速：0.6ml/min，RI检测)的HPLC(Agilent，德国)分析得到的水解混合物。
结果示于表2。
Figure BDA0000966038180000271
表2显示出在步骤b)至d)期间得到的渗透物、步骤b)至e)期间得到的渗透物和经过滤的生物质中得到的糖浓度(误差估计为+/-10％)。
比较例2
根据实施例2制备全甜菜材料。
使用以下的酶：43.4％(w/w)的
Figure BDA0000966038180000281
6.3％(w/w)的
Figure BDA0000966038180000283
Figure BDA0000966038180000282
和50.3％(w/w)Pectinex Ultra
Figure BDA0000966038180000284
这些产品混合在50mM的NaAc缓冲液(pH＝5)中
将该酶混合物与150kg新鲜的甜菜材料以0.1wt％的E/S混合。最终的反应混合物在50mM的乙酸钠缓冲液中(pH5)中包含18％d.m.的甜菜材料。
将反应混合物在50℃孵育30分钟至5小时。在液化和水解之后将反应混合物在3200g离心30分钟并且将上清液分离并称重。将1ml上清液在95℃热灭活10分钟并通过具有Aminex HPX 87(BioRad Labs,Hercules,USA)离子交换柱(洗脱剂：100％的水，T：85℃，流速：0.6ml/min，RI检测)的HPLC(Agilent，德国)分析释放的糖的量。
结果示于表3。
上清液
葡萄糖[g/l] 54
果糖[g/l] 53
阿拉伯糖[g/l] 9
纤维二糖[g/l] 5
表3显示出在上清液中得到的糖浓度。
由于比较例2的上清液具有与实施例2的渗透物相比更低的糖浓度，因此根据本发明的方法更高效。
实施例3：使用含糖的渗透产物制备乙醇
将750mL含糖渗透产物用50mL酿酒酵母的接种物(inoculate)接种，导致1.8的起始光密度。将发酵培养基在400rpm在pH 4.5和32℃下用
Figure BDA0000966038180000285
实验室发酵器(
Figure BDA0000966038180000286
瑞典)进行搅拌。在70.5小时后停止发酵。随后对样品进行HPLC和GC分析。结果显示葡萄糖以及果糖被完全消耗并且产生65g/L的乙醇。

Claims (13)

1.一种用于使生物质水解的方法，包括以下步骤：
a)将所述生物质与酶组合物在容器中接触，所述酶组合物包含至少一种选自水解酶类的酶；
b)除去一部分所述生物质；
c)使所述一部分生物质进行过滤，并移除渗透物，其中通过使用至少一个过滤组件进行过滤，所述过滤组件包括至少一个超滤膜，
所述超滤膜是陶瓷膜；
d)将至少一部分经过滤的生物质反馈回所述容器；
e)任选地添加与根据步骤c)通过过滤移除的量相对应的量的液体；
其中所述方法的步骤b)和步骤c)在包括至少一个内部回路(8，8.1，8.2)和一个外部回路(5)的至少两个不同的回路中进行，
在所述外部回路(5)中，所述容器(2)、装有第一泵(4)的第一管线(5a)、装有第二泵(6，6.1，6.2)的第二管线(8a，8.1a，8.2a)、所述至少一个过滤组件(7，7.1，7.2)、第三管线(8b，8.1b，8.2b)、第四管线(5b)和所述容器(2)顺序连接形成回路，
在所述至少一个内部回路(8，8.1，8.2)中，装有第二泵(6，6.1，6.2)的第二管线(8a，8.1a，8.2a)、所述至少一个过滤组件(7，7.1，7.2)、第三管线(8b，8.1b，8.2b)和旁路管线(8.1e)顺序连接形成回路。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个过滤组件为单个过滤组件、或串联或并联连接的多个过滤组件。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个内部回路包括两个并联的内部回路。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
f)添加一定量的新鲜生物质。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将步骤b)至e)或者步骤b)至f)重复至少一次。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤a)至e)至少部分地同时进行。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中各个回路装有泵。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述酶组合物包含纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酶组合物还包含至少一种选自果胶甲酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶、1,3-/1,6-β-D-葡聚糖酶和木聚糖酶的酶。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生物质选自含有纤维素、半纤维素和/或木质素的生物质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物质选自甜菜、甘蔗、稻草、玉米、木材、油籽和它们的混合物。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生物质的干物质含量选自5-40wt％。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将与通过过滤移除的量相等的量的液体添加到所述容器中。
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