CN105624181A - 一种高通量筛选产生1-脱氧野尻霉素菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量筛选产生脱氧野尻霉素菌株的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β-半乳糖苷酶的出发菌；2)得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；3)以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行MEGAWHOP？PCR，得到MEGAWHOP？PCR质粒突变体库；4)将所述MEGAWHOP？PCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平板；从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落，即为高产DNJ菌。本发明可以筛选高产DNJ、低产DNJ或者不产DNJ的菌株，提高到了筛选效率，节省时间，简化筛选步骤。

Description

一种高通量筛选产生1-脱氧野尻霉素菌株的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高通量筛选产生脱氧野尻霉素菌株的方法。

背景技术

1-脱氧野尻霉素(DNJ)(图1)是一种哌啶类多羟基生物碱，能够竞争性结合蔗糖酶、海藻糖酶、α-葡萄糖苷酶等的底物结合口袋，从而抑制其活性，降低碳水化合物的消化和葡萄糖的产生，从而达到防治糖尿病的作用。另外，DNJ还具有抗病毒、抗肿瘤转移等功效，对于研制糖尿病治疗的新药及开发抗病毒药物具有非常重要的学术意义和实用价值。

天然的DNJ目前在植物(主要为桑科植物)、动物(主要包括家蚕以及食用桑叶为主的昆虫)以及微生物(主要为链霉菌以及芽孢杆菌)都能够生成。目前合成DNJ的方法主要是通过化学合成，以及在生物体内进行合成。链霉菌以及芽孢杆菌能够以葡萄糖为底物通过异构、转氨、氧化、还原等步骤合成DNJ，但是从中所分离得到的DNJ的含量极低。虽然通过基因工程菌手段和定向进化方法可以提高DNJ产量，但是由于缺乏有效的筛选手段，难以筛选到高效合成DNJ的野生型和基因工程突变体。

目前DNJ的检测主要采用反相高效液相色谱-紫外检测法，采用9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC-Cl)对DNJ进行结构衍生，用荧光检测器检测生成的荧光产物，此方法虽然具有重复性好，稳定性高等优点，但是操作繁琐、灵敏度低、经过衍生后所得的产物不太稳定等，不适合测定低浓度，样品量少的检测，并且检测器价格比较昂贵，在应用普及方面受到较大限制，根本不适合于DNJ高效合成菌株的高通量筛选。

发明内容

本发明的目的是提供高通量鉴定高产或低产或不产脱氧野尻霉素菌株的方法。

本发明提供的高通量鉴定高产或低产或不产脱氧野尻霉素菌株的方法，包括如下步骤：

1)构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β-半乳糖苷酶的出发菌；

所述表达DNJ生物合成途径的重组载体按照包括如下步骤的方法获得：将3个DNJ合成基因共同插入表达载体中，得到表达DNJ生物合成途径的重组载体；

所述3个DNJ合成基因为gabT1基因、yktc1基因和gutB1基因；

所述表达β-半乳糖苷酶的出发菌按照包括如下步骤的方法获得：将表达β-半乳糖苷酶的基因整合到大肠杆菌染色体上，得到表达β-半乳糖苷酶的出发菌；

2)针对任一个所述DNJ合成基因设计易错PCR扩增引物，并以所述重组载体为模板，进行易错PCR扩增，得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；

3)以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行MEGAWHOPPCR，得到MEGAWHOPPCR质粒突变体库；

4)将所述MEGAWHOPPCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平板；且将所述重组载体转入所述出发菌中，涂平板，得到野生菌平板；

从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落，即为高产DNJ菌；

从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色深的菌落，即为低产或不产DNJ菌；

所述高产DNJ菌为DNJ产量高于野生型菌的菌；

所述低产或不产DNJ菌为DNJ产量低于野生型菌的菌；

所述野生型菌为将所述表达DNJ生物合成途径的重组载体导入所述出发菌中，得到的菌。

所述整合按照包括如下步骤的方法进行：将所述lacS基因通过载体pAH156LACS导入大肠杆菌中，所述载体pAH156LACS为将lacS基因(序列2)插入载体pAH156获得的重组载体。

上述方法中，步骤1)中，所述DNJ合成基因来源于芽孢杆菌或链霉菌；

所述3个DNJ合成基因以含有3个DNJ合成基因的DNA片段的形式插入所述表达载体中；

步骤2)中，所述易错PCR扩增引物为gutB1基因的易错PCR扩增引物。

上述方法中，步骤1)中，所述表达载体为pMAL-P2X；

所述含有3个DNJ合成基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述β-半乳糖苷酶的基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

步骤2)中，所述gutB1基因的易错PCR扩增引物由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成。

上述方法中，所述大肠杆菌为BW25113。

上述方法中，所述方法还包括如下步骤：在步骤4)后重复步骤4)。

本发明的另一个目的是提供一种高产DNJ的重组菌。

本发明提供的重组菌，为如下1)或2)或3)或4)：

1)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第2278位T突变为C得到的菌；

2)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第2895位A突变为G得到的菌；

3)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第3206位G突变为A得到的菌；

4)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第2677位A突变为G得到的菌；

所述高产DNJ为高产DNJ的重组菌的DNJ产量高于所述目的菌；

所述目的菌为重组菌BW25113LACS/pDNJ5wt，其为将重组载体pDNJ5转入重组菌BW25113LACS中得到的目的菌；

所述重组菌BW25113LACS为将β-半乳糖苷酶的LACS基因同源重组到大肠杆菌BW25113中得到的重组菌；

所述pDNJ5重组载体为将含有gabT1、yktc1和gutB1的片段插入表达载体pMAL-P2X中得到的重组载体，其中，含有gabT1、yktc1和gutB1的片段的核苷酸序列为序列表中序列1。

本发明的实验证明，本发明利用芽孢杆菌源的DNJ合成基因，基于DNJ对半乳糖苷酶的抑制活性，利用蓝白斑原理，设计DNJ的高通量筛选方法，通过设计高通量筛选方法对DNJ进行高效定量检测，可以筛选高产DNJ、低产DNJ或者不产DNJ的菌株，提高到了对于不同产量DNJ菌株筛选效率，节省时间，简化了筛选步骤。

附图说明

图1为脱氧野尻霉素结构式

图2为解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌中DNJ合成途径

图3为gutB1基因的易错PCR结果

图4为DNJ突变体库的构建

图5为DNJ突变体平板复筛

图6为DNJ产量的检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

图2为解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌中DNJ合成途径

实施例1、高通量筛选(或鉴定)高产脱氧野尻霉素(DNJ)菌株的方法

一、筛选高产DNJ的菌株

DNJ合成基因为gabT1、yktc1和gutB1(TYB)，根据基因序列设计引物对1(DNJ-for-NdeI:5'-ATACATATGGGGACGAAGGAAATTACAAA-3',DNJ-rev-SacI:5'-ATATGAGCTCTTACACCAGCTTCGGATCAGATAC-3')可以用来扩增这三个基因。

1、合成DNJ基因的获得

提取萎缩芽孢杆菌ACCC02297(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC02297)基因组DNA，用引物对1进行PCR扩增，得到3237bp的PCR产物，为含有gabT1、yktc1和gutB1的片段(gabT1基因在序列1自5’末端第1-1269位核苷酸,yktc1基因在序列1自5’末端第1266-2216位核苷酸,gutB1基因在序列1自5’末端第2191-3237位核苷酸)。

2、重组载体的构建

将上述含有gabT1、yktc1和gutB1的片段经过NdeI和SacI酶切，与经过同样酶切的表达载体pMAL-P2X(购自NEB#E8000S)连接，得到重组载体pDNJ5。

3、易错PCR扩增产物的获得

为了提高DNJ活性，合成DNJ所必须的三个酶基因进行易错PCR突变库的构建；

以突变gutB1基因的引物为例：引物对2(GutB-For：CGTAAGTTATTGGAGGATATAAAGTGA(序列3)，GutB-rev：CTCTACATATTCAAGTTTGTCGTTA(序列4))；

gutB1基因的突变：以重组载体pDNJ5为模板，用引物对2进行易错PCR扩增收集1047bpPCR产物。

经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析检测，结果如图3所示，泳道1可见约1kb的特异性条带，与预期基因大小一致。

经过测序，得到的PCR产物为gutB1发生突变，且突变率达到1-4个碱基/kb。

上述易错PCR扩增的反应体系和反应程序如下：

表1为易错PCR扩增的反应体系

表2为PCR反应程序

4、MEGAWHOPPCR突变体库的构建

将上述3得到的易错PCR产物进行胶回收作为大引物，以所提取的质粒pDNJ5为模板随后进行megawhopPCR，得到PCR产物(野生型质粒和突变质粒的混合物)。

反应体系及反应参数如下表3和表4：

表3为MEGAWHOPPCR突变体库的构建的反应体系

表4为MEGAWHOPPCR突变体库构建的PCR反应程序

随后向上述PCR产物中加入1μl的DpnI酶切1h用于去除野生型质粒pDNJ5，然后在80℃作用20min将酶进行失活，得到MEGAWHOPPCR质粒突变体库(突变质粒的混合物)。

5、出发菌的获得

由于双质粒系统的不稳定性以及实验所设想的在平板上利用DNJ能够竞争性抑制LACS与X-gal的反应，于是在大肠杆菌BW25113染色体中插入半乳糖苷酶基因，具体如下：

pAH156LACS的制备：将表达β-半乳糖苷酶的lacS基因(序列2)插入表达载体pAH156(Haldimann,A,BLWanner2001.Conditional-replication,integration,excision,andretrievalplasmid-hostsystemsforgenestructure-functionstudiesofbacteria.J.Bacteriol.183(21):6384-93.公众可从中国科学院微生物研究所获得)中，得到表达β-半乳糖苷酶的重组载体pAH156LACS。

将重组载体pAH156LACS导入大肠杆菌感受态BW25113，得到重组菌BW25113/pAH156LACS；

将重组菌BW25113/pAH156LACS测序，结果β-半乳糖苷酶的lacS基因整合到大肠杆菌BW25113中，得到重组菌BW25113LACS。

6、筛选高产DNJ的菌株

1)初筛

将经过4制备的突变质粒文库转入重组菌BW25113LACS中，涂于含有100μg/mlAmp，2mML-阿拉伯糖，0.05mMIPTG，80μg/mlX-gal，10mM葡萄糖的LB固体平板，得到BW25113LACS/pDNJ5mu(突变库平板)。

将重组载体pDNJ5转入重组菌BW25113LACS中，涂于含有100μg/mlAmp、2mML-阿拉伯糖、0.05mMIPTG、80μg/mlX-gal、10mM葡萄糖的LB固体平板，得到BW25113LACS/pDNJ5wt。

将空载体pMAL-P2X转入重组菌BW25113LACS中，涂于含有100μg/mlAmp、2mML-阿拉伯糖、0.05mMIPTG、80μg/mlX-gal、10mM葡萄糖的LB固体平板，得到BW25113LACS/pMAL-P2X(对照平板)。

观察平板，结果如图4所示，A.BW25113LACS/pMAL-P2X、B.BW25113LACS/pDNJ5wt、C.BW25113LACS/pDNJ5mu；大概14个小时左右会出现对照平板是深蓝，野生平板是浅蓝，突变文库的平板有深有浅有白的。

从突变库平板上选取颜色比野生型平板上浅的菌落，记作高产DNJ菌(比野生型菌的DNJ产量高的菌株)；

从突变库平板上选取颜色比野生型平板上深的菌落，记作低产或不产DNJ菌(比野生型菌的DNJ产量低的菌株)。

2)复筛

将上述高产DNJ菌或低产或不产DNJ菌划线至含有100μg/mlAmp，2mML-阿拉伯糖，0.05mMIPTG，80μg/mlX-gal，10mM葡萄糖的LB固体平板，37℃培养14-24h，进行复筛，以野生型菌BW25113LACS/pDNJ5wt为对照。

结果如图5所示，再次选取颜色比野生型平板上浅的菌落，2次筛选均为颜色比野生型平板上浅的菌落，即为高产DNJ菌落(比野生型菌的DNJ产量高的菌株)，共得到4株高产DNJ的菌yk18、yk30、4y2、8y1。

再次选取颜色比野生型平板上深的菌落，2次筛选均为颜色比野生型平板上深的菌落，即为低产或不产DNJ菌落。

二、DNJ产量的检测

从平板上筛选得到四株高产DNJ的菌yk18、yk30、4y2、8y1，摇瓶培养12h的种子液接菌1％至含有100μg/mlAmp的20ml的LB液体培养基中，在37℃250rpm摇菌约2.5h至OD600＝0.8，加入终浓度为0.5mMIPTG在30℃250rpm摇菌2h，加入终浓度为10mM葡萄糖，在30℃250rpm摇菌18h，取1ml菌液12,000g离心1min，收集上清液。

以ONPG为底物进行活性测试：

反应体系：700μlZbuffer(10.594gNa₂HPO₄，3.12gNaH₂PO₄，0.372gKCl，0.123gMgSO₄，加蒸馏水定容到500ml)，5μlLACS酶液(将LACS通过原核表达、纯化获得的蛋白即为LACS酶液)，5μl上述获得的上清液，40μlONPG。37℃水浴10min加入1MNa₂CO₃进行终止，OD₄₂₀下进行检测。

以野生型菌BW25113LACS/pDNJ5wt作为对照。

野生型菌BW25113LACS/pDNJ5wt、yk18、yk30、4y2、8y1的DNJ产量分别为0.25g/L、0.29g/L、0.28g/L、0.271、0.274；

各个突变体分别对野生型产量提高的倍数如图6所示，yk18、yk30、4y2、8y1分别对野生型产量提高的倍数分别为14.8％、12.6％,8.7％,10％.

上述结果表明，四株高产DNJ的菌yk18、yk30、4y2、8y1产量比野生型提高，为高产DNJ的菌株。

将四株产DNJ的菌yk18、yk30、4y2、8y1提取基因组DNA，测序，结果如表5所示，表明分别在相应的位点发生了突变。

表5为突变株的突变位点

Claims (6)

1.一种高通量鉴定高产或低产或不产脱氧野尻霉素菌株的方法，包括如下步骤：

1)构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β-半乳糖苷酶的出发菌；

所述表达DNJ生物合成途径的重组载体按照包括如下步骤的方法获得：将3个DNJ合成基因共同插入表达载体中，得到表达DNJ生物合成途径的重组载体；

所述3个DNJ合成基因为gabT1基因、yktc1基因和gutB1基因；

所述表达β-半乳糖苷酶的出发菌按照包括如下步骤的方法获得：将表达β-半乳糖苷酶的基因整合到大肠杆菌染色体上，得到表达β-半乳糖苷酶的出发菌；

2)针对任一个所述DNJ合成基因设计易错PCR扩增引物，并以所述重组载体为模板，进行易错PCR扩增，得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；

3)以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行MEGAWHOPPCR，得到MEGAWHOPPCR质粒突变体库；

4)将所述MEGAWHOPPCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平板；且将所述重组载体转入所述出发菌中，涂平板，得到野生菌平板；

从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落，即为高产DNJ菌；

从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色深的菌落，即为低产或不产DNJ菌；

所述高产DNJ菌为DNJ产量高于野生型菌的菌；

所述低产或不产DNJ菌为DNJ产量低于野生型菌的菌；

所述野生型菌为将所述表达DNJ生物合成途径的重组载体导入所述出发菌中，得到的菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述DNJ合成基因来源于芽孢杆菌或链霉菌；

所述3个DNJ合成基因以含有3个DNJ合成基因的DNA片段的形式插入所述表达载体中；

步骤2)中，所述易错PCR扩增引物为gutB1基因的易错PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述表达载体为pMAL-P2X；

所述含有3个DNJ合成基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述β-半乳糖苷酶的基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

步骤2)中，所述gutB1基因的易错PCR扩增引物由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述大肠杆菌为BW25113。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述方法还包括如下步骤：在步骤4)后重复步骤4)。

6.一种高产DNJ的重组菌，为如下1)或2)或3)或4)：

1)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第2278位T突变为C得到的菌；

2)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第2895位A突变为G得到的菌；

3)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第3206位G突变为A得到的菌；

4)将目的菌的gutB1基因核苷酸序列的第2677位A突变为G得到的菌；

所述高产DNJ为高产DNJ的重组菌的DNJ产量高于所述目的菌；

所述目的菌为重组菌BW25113LACS/pDNJ5wt，其为将重组载体pDNJ5转入重组菌BW25113LACS中得到的目的菌；

所述重组菌BW25113LACS为将β-半乳糖苷酶的lacS基因同源重组到大肠杆菌BW25113中得到的重组菌；

所述pDNJ5重组载体为将含有gabT1、Yktc1和gutB1的片段插入表达载体pMAL-P2X中得到的重组载体，其中，含有gabT1、Yktc1和gutB1的片段的核苷酸序列为序列表中序列1。