CN105617396B

CN105617396B - 一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物及其制备方法

Info

Publication number: CN105617396B
Application number: CN201610071476.3A
Authority: CN
Inventors: 吴正治; 段丽红
Original assignee: Shenzhen Institute of Gerontology
Current assignee: Wu Zhengzhi; Shenzhen Jintai Pharmaceutical Technology LP
Priority date: 2016-02-01
Filing date: 2016-02-01
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2036-02-01
Also published as: CN105617396A

Abstract

本发明提供了一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物及其制备方法，首先利用高碘酸盐对壳聚糖进行氧化处理，得到了不同分子量、壳聚糖链上含有邻二醛功能基团的醛化壳聚糖，进一步以DMSO做溶剂，亚氯酸作为氧化剂，将邻二醛功能基团氧化成邻二羧基化壳聚糖，羧基化壳聚糖与加兰他敏进行酯化反应既得本发明靶向药物。本发明药物可以通过嗅区黏膜沿着包绕在嗅神经束周围的连接组织或嗅神经元的轴突到达脑脊液或脑部，因而可绕过血脑屏障进入中枢神经系统，被直接吸收入脑，具有如下特点：起效快；无须注射给药；避免肝脏首过效应；应用定量装置，使用方便。

Description

一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物及其制备方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer′sdisease，AD)是老年期痴呆中最常见的类型，居中枢神经系统退行性疾病之首，它以进行性的认知功能损害和记忆力减退、精神行为异常以及生活能力减退等为主要表现。随着人类社会年龄结构老龄化，老年性痴呆症发病率日趋上升，已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大健康杀手。据2010年失智症报告数据显示，全球约有3560万AD患者，且以每20年增加1倍的速度增加，至2030年将达6500万人，而多发于发展中国家。因此，对AD治疗方面的探讨研究，不仅是一个亟待解决的医学课题，还是一个严峻的社会问题。

AD病因及分子机制十分复杂，至今尚不很明确，关于其病因学者提出了以下假说：中枢胆碱能损伤学说、微管相关蛋白-tau蛋白异常学说、Aβ级联学说、基因突变或多型性学说、免疫功能突变学说和兴奋性氨基酸毒性学说。脑内胆碱能系统缺陷在AD中起重要作用。在AD的发病机制中，胆碱能损伤学说是很早就得到公认的学说。中枢胆碱能损伤学说认为：在AD的病理过程中，基底前脑区的胆碱能神经元丢失，乙酰胆碱酯酶活性和胆碱乙酰转移酶降低，致使乙酰胆碱的运输、合成、摄取、释放下降，学习、记忆能力衰退，被认为是衰老性老年痴呆症的重要病因。AD患者尸检和脑活检证明，前脑基底核内胆碱能神经元有70％～80％变性以致死亡，突触前乙酰胆碱的合成、乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶活力下降，突触前M受体减少和胆碱摄取功能下降。

胆碱能假说提供了治疗AD的理论依据，目前国内外对AD的临床治疗方法主要是增强中枢胆碱能系统功能，胆碱酯酶(acetylcholine esterase，AchE)抑制剂是迄今唯一一类通过美国FDA批准上市治疗AD的药物，也被认为是对AD疗效最确定的临床治疗药物，并已成为轻中度AD病人的标准治疗。例如从石蒜中提取的一种石蒜生物碱加兰他敏(Galantamine)被证实为可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，已成为第二代胆碱酯酶抑制剂在欧美注册用于治疗AD。但现有胆碱酯酶抑制剂多常规口服给药，药物全身分布，外周副作用明显，限制了AChEIs的临床应用。所以，研究适用于脑部治疗的靶向缓释制剂是目前解决这些生物碱临床应用问题最快捷、有效的方法。

迄今为止，对加兰他敏的药理，特别是胆碱酯酶的抑制作用国内外都有了些研究。研究表明：加兰他敏具有胆碱酯酶抑制作用，但其体内分布广泛、存在较多的外周副作用，目前尚无用于老年性痴呆的研究。此外，血脑屏障的存在限制了它们应用于临床，而对于如何增强加兰他敏血脑屏障通透性与脑靶向性、提高生物利用度、降低其毒副作用的研究尚属罕见。目前解决药物有效透过血脑屏障的方法有：制备前体药物、打开血脑屏障紧密结构或使用载体系统如抗体、脂质体、纳米粒等。前体药物存在改变药性、引入毒性的风险而打开血脑屏障紧密结构有可能引入其他有害物质。鼻腔给药可使药物可以通过嗅区黏膜沿着包绕在嗅神经束周围的连接组织或嗅神经元的轴突到达脑脊液(Cerebral Spinal Fluid，CSF)或脑部，因而可绕过血脑屏障进入中枢神经系统，被直接吸收入脑。具有起效快；无须注射给药；避免肝脏首过效应；应用定量装置，使用方便的特点。本发明从抑制胆碱酯酶、增强胆碱能活性，保护神经元，改善突触可塑性等多靶点治疗老年性痴呆角度出发，将乙酰胆碱酯酶抑制剂加兰他敏与生物相容性好、具有生物吸附性且降解产物对神经细胞具有保护及促进再生作用的壳聚糖相结合研制多靶点协同发挥作用的抗老年性痴呆新型药物，目前还未见有相关报道。

发明内容

本发明针对现有治疗老年痴呆药物存在的血脑屏障的缺点，目的在于提供一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物，以消除血脑屏障的存在使药物无法进入脑组织的缺点。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物，其结构式如式I所示：

式I

其中X的范围为2-30，Y的范围为2-20，Z的范围为10-50。

所述的加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物通过羧基化壳聚糖与加兰他敏进行酯化反应合成得到。

式I的合成路线为：

其中R-OH为加兰他敏；X的范围为2-30，Y的范围为2-20，Z的范围为10-50。

所述的羧基化壳聚糖为邻二羧基化壳聚糖(CS-COOH)，其结构如

式II所示：

式II

其中X的范围为2-30，Y的范围为2-20，Z的范围为10-50。

所述的羧基化壳聚糖通过以下方法制备：

1)氮气气氛下，壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液与高碘酸钾在4℃下搅拌反应，然后向溶液中加入乙二醇溶液中止反应，产物经旋转蒸发浓缩后分别在NaCl水溶液和去离子水中透析以除去杂质，最后产物冷冻干燥，得到醛化壳聚糖(CS-CHO)；

2)以DMSO为溶剂，亚氯酸作为氧化剂，将醛化壳聚糖(CS-CHO)氧化为邻二羧基化壳聚糖(CS-COOH)。

羧基化壳聚糖的合成路线为：

1)

2)

本发明还提供了加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物的合成方法，具体包括以下步骤：

1)氮气气氛下，壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液与高碘酸钾在4℃下搅拌反应，然后向溶液中加入乙二醇溶液中止反应，产物经旋转蒸发浓缩后分别在NaCl水溶液和去离子水中透析以除去杂质，最后产物冷冻干燥，得到醛化壳聚糖(CS-CHO)；其中，所述壳聚糖、醋酸-醋酸钠缓冲溶液、高碘酸钾、乙二醇之间的摩尔体积比为1：(1～5)：(0.1～1)：(0.1～1)；

2)以DMSO为溶剂，亚氯酸作为氧化剂，将醛化壳聚糖(CS-CHO)氧化为邻二羧基化壳聚糖(CS-COOH)；其中，所述醛化壳聚糖、DMSO、亚氯酸钠之间的摩尔体积比为1：(1～6)：(1～2)；

3)将羧基化壳聚糖与加兰他敏进行酯化反应即得；其中，所述羧基化壳聚糖、加兰他敏之间的摩尔体积比为1：(1～2)。

本发明所述的壳聚糖为聚合物，分子量的范围为0.4-2万g/mol。

本发明还提供了加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物在治疗老年痴呆靶向药物中的应用，所述的靶向为脑靶向。

本发明的有益效果为：选取降解产物对神经细胞具有保护及促进再生作用、生物吸附性好，可生物降解，能可逆性的、暂时性打开上皮细胞之间的紧密连接，增强膜通透性的壳聚糖作为药物载体，针对含羟基的加兰他敏，设计一种新的可控的方式来合成带羧基的羧基化壳聚糖，通过羧基与加兰他敏的羟基相结合，调节羧基化壳聚糖与加兰他敏的反应比例，从而形成最佳的经鼻脑靶向给药的多靶点抗老年性痴呆的壳聚糖载加兰他敏药物。与已有的合成药物相比：

1、本本发明药物结合了优良的乙酰胆碱酯酶抑制剂加兰他敏和解产物可以保护神经元、改善突触可塑性的壳聚糖，实现多靶点抗老年性痴呆，提高了治疗病因复杂的老年性痴呆的效果；

2、本发明引入了生物吸附性好，可生物降解，能可逆性的、暂时性打开上皮细胞之间的紧密连接，增强膜通透性的壳聚糖载体制备的经鼻脑靶向制剂，提高脑靶向性的同时不会改变药物的药性和引入其他有害物质；

3、加兰他敏通过该经鼻脑靶向制剂经鼻给药后能更加集中地分布在脑内，生物利用度得到提高。

附图说明：

图1氢溴酸加兰他敏溶液剂及实验范围内最大载药量的新型药物的体外释放曲线；

图2 1mL加兰他敏新型药物溶液TLC生物自显影测试结果，其中：右边为0.1mg/mL，中间为0.5mg/mL，左边为1.0mg/mL。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物的制备

本实施例提供了本发明经鼻给药抗老年痴呆靶向药物的一种制备方法，具体包括以下步骤：

1)氮气气氛下，10mol壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液与1mol高碘酸钾在4℃下搅拌反应48h，然后向溶液中加入1mol乙二醇溶液中止反应，产物经旋转蒸发浓缩后分别在1mol/LNaCl水溶液和去离子水中透析48h以除去杂质，最后产物冷冻干燥，得到醛化壳聚糖(CS-CHO)；

2)将1mol醛化壳聚糖(CS-CHO)溶解在3mol DMSO，再加入1mol亚氯酸钠，搅拌反应24h，产物经旋转蒸发浓缩后分别在1mol/L NaCl水溶液和去离子水中透析48h以除去杂质，最后产物冷冻干燥，得到邻二羧基化壳聚糖(CS-COOH)；

3)将1mol羧基化壳聚糖、1mol加兰他敏分别溶解在150ml的水中，两种溶液混合，搅拌反应24h，产物经旋转蒸发浓缩后分别在1mol/L NaCl水溶液和去离子水中透析48h以除去杂质，最后产物冷冻干燥，得到壳聚糖负载加兰他敏药物。

实施例2

壳聚糖负载加兰他敏药物的体外药物释放研究

将药物置于透析袋中，定时从释放介质中取样分析药物含量。具体过程为将所得的药物溶液冻干，精确称取一定量后重新超声分散在10ml人工脑脊液中，装入透析袋(MWCO＝12,000)后置于100ml锥形瓶中，补充40ml人工脑脊液于恒温振荡器中(设定温度37℃，转速60r/min)，隔时取样2ml，并补充同等量的释放介质。该法可以保证高分子胶束留在透析袋中，使得测定的药物含量更加准确。

结果如图1所示，氢溴酸加兰他敏溶液剂的释放速率较快，在12h内基本全部释放，累积释放百分率约为87％。相比于溶液剂，本发明加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物的体外释放则相对缓慢，120h内释放了70.4％，表明本发明药物具有明显的缓释作用。

实施例3脑靶向性评价

取健康大鼠，随机分为4组，分别为加兰他敏原药组(原药组)；纳米载药胶束组(实验组)；空白载体胶束(空白组)；生理盐水(阴性对照组)。实验前24h禁食不禁水。

大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(40m/kg)麻醉后，仰卧固定于鼠板上，切开颈部皮肤、肌肉，分离气管、食管，食管、气管，做气管插管，食管上段结扎以避免鼻腔给药后药液向胃肠道流失。整个实验过程中适时补充麻醉剂，以保证大鼠始终处于麻醉状态。

大鼠手术后30min，鼻腔给药组以针头部加有塑料软管的微量注射器双侧鼻孔给药，静脉注射给药组尾静脉注射给药，给药体积均根据给药剂量、大鼠体重、浓度精密折算。

原药溶液鼻腔给药后5、15、30、60、90、120、240、360、480min，静脉注射给药后2、5、15、30、60、90、120、240、360、480min；胶束溶液鼻腔给药后5、15、30、60、90、120、240min、6、8、12、24、36h，静脉注射给药后2、5、15、30、60、90、120、240min、6、8、12、24、36h，分别将大鼠断头处死，肝素抗凝离心管收集全血，3000rpm离心15min分离血浆，剪开头盖骨，分离嗅球、嗅束、大脑、小脑组织适量，去除血污，精密称重，按1:2(W/V)的比例加入0.1M的pH值10.0的Trsi溶液，探头式超声细胞破碎仪超声匀浆，血浆和脑组织匀浆样品-20℃冷冻保存待测。每个时间点处死大鼠4只。

取-20℃冷冻保存的血浆及脑组织匀浆样品，室温复融，用高效液相色谱的方法测定血浆样品和组织样品中加兰他敏的含量。

列出每个时间点的血药浓度、不同部位脑组织药物浓度与时间数据，并计算平均值和标准差。应用中国药理学会数学药理专业委员会编制的3P87药代动力学计算程序处理，计算主要的动力学参数。其中药物在体内达到峰值时的浓度Cmax和达到最高浓度时的时间Tmax由实测值计算，曲线下面积(AUC，Area under curve)采用线性梯形面积法求算。

脑靶向性指数(DTI，durg targeting index)用于评价纳米载药胶束鼻腔给药后的脑靶向作用，DTI被定义为鼻腔给药后脑组织药物的AUC与血浆药物AUC的比值与静脉注射给药后脑组织药物的AUC与血浆药物AUC的比值之比，即：

DTI值大于l表明具有脑靶向性，DTI值越大，脑靶向作用就越强。

加兰他敏原药溶液和加兰他敏新型药物分别对大鼠进行静脉注射给药与鼻腔给药后，不同部位的药物AUC值见表1，反映脑靶向性的评价指标脑靶向性指数(DTI)的计算结果见表2。

表1加兰他敏原药溶液及其新型药物溶液

表2加兰他敏原药及其新型药物溶液在静脉注射与鼻腔给药后的脑靶向性指数

脑组织	加兰他敏原药	加兰他敏新型药物
			嗅球	1.1	36.0
嗅束	1.0	16.2
			大脑	1.1	26.2
小脑	1.2	25.6

由表1和表2实验数据表明，加兰他敏原药鼻腔给药后的DTI在嗅球、大脑、小脑中也大于1，有一定的脑靶向性，这可能是由于加兰他敏为小分子药物，本身也可通过鼻腔到达脑部。然而加兰他敏新型药物鼻腔给药后在嗅球、嗅束、大脑、小脑中，DTI远远大于原药的，加兰他敏新型药物鼻腔给药具有明显的脑靶向性，且嗅球处的脑靶向性指数最大，靶向性最好。

实施例4对乙酰胆碱酯酶抑制作用的研究

结合TLC生物自显影法、Ellman法的检测结果，综合分析本发明药物抑制乙酰胆碱酯酶的作用效果。

1)TLC生物自显影法

选取硫代乙酰胆碱为底物，DTNB为显色剂。在薄层板上将待测样品展开，然后将薄层板与乙酰胆碱酯酶、底物相接触，培养一定时间后喷显色剂，有抑制活性的成分将会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，不能与底物，显色剂反应，这样该部位会出现薄层板本身的白色，而其他部位根据不同的底物和显色剂为不同的背景色。

从TLC生物自显影测试结果可以看出，3种不同剂量的加兰他敏纳米靶向药物(图2)都在紫色背景下出现了不同程度的白色斑点，因而加兰他敏纳米靶向药物可能具有抑制AChE的作用。然后又用假阳性实验对结果进行了排除，发现均无假阳性结果，这说明可以用TLC生物自显影方法确定加兰他敏纳米靶向药物抑制AChE的活性。

2)Ellman法

Ellman法是一种能够定量评价乙酰胆碱酯酶抑制活性的方法。与TLC生物自显影法不同，本方法选取碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)作为底物，它在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成405nm下有最大光吸收的黄色物质5-巯基-2-硝基苯甲酸盐。根据测得的A值计算酶抑制率，公式如下：

抑制率＝[(A空白组－A完全抑制组)－(A样品－A样品本底)]/(A空白组－A完全抑制组)×100％

为了进一步确定加兰他敏纳米靶向药物的抗AChE活性，又用Ellman方法对加兰他敏新型药物进行了抑制AChE活性测试(结果见表3)。分别测定了0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL药物含量的加兰他敏新型药物溶液的抑制率，数据显示，随着含药浓度提高，新型药物溶液的抑制率均增加，加兰他敏纳米靶向药物溶液的抑制率最高达到了93.0％。该部分的实验证明引入壳聚糖载体并不会改变加兰他敏的药性。

表3加兰他敏药物的Ellman方法测定结果

样品	抑制率(％)±S.D.
		0.1mg/ml	27±3
0.5mg/ml	54±2
		1.0mg/ml	89±4

Claims

1.一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物，其特征在于：结构式如式I所示，

其中X的范围为2-30，Y的范围为2-20，Z的范围为10-50；

所述的加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物通过羧基化壳聚糖与加兰他敏进行酯化反应合成得到；所述羧基化壳聚糖与加兰他敏的摩尔体积比为1:(1-2)。

2.根据权利要求1所述的一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物，其特征在于：所述的羧基化壳聚糖为邻二羧基化壳聚糖(CS-COOH)，其结构如式II所示：

其中X的范围为2-30，Y的范围为2-20，Z的范围为10-50。

3.根据权利要求2所述的一种加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物，其特征在于：所述的羧基化壳聚糖通过以下方法制备：

4.权利要求1所述加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)以DMSO为溶剂，亚氯酸作为氧化剂，将醛化壳聚糖(CS-CHO)氧化为邻二羧基化壳聚糖(CS-COOH)；

3)将羧基化壳聚糖与加兰他敏进行酯化反应即得。

5.权利要求1所述加兰他敏经鼻给药纳米脑靶向药物在制备治疗老年痴呆靶向药物中的应用。