CN105603056B - 一种植物油脂掺杂检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测油脂掺杂的方法，本发明提供的方法包括：(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA；(3)、HRM分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种油脂掺杂检测的方法，更具体地说，涉及植物油掺杂检测的方法。
背景技术
DNA定性检测精炼植物油对油脂真实性检测和转基因检测有重要意义。运用分子生物学技术对食用油进行检测越来越广泛(Wu，2008；杨冬燕，2010；覃文，2002；金红，2004)，其首要前提是从食用油中提取出适合检测的DNA。有很多关于从橄榄油中成功提取DNA的报道，主要原因是初榨橄榄油不经过精炼，极大地避免DNA的破坏和损失(Wu，2008；Ayed，2009)。精炼植物油由于精炼过程中的高温，水洗等过程，DNA的残留量很低。常规的DNA提取方法可以从粗制大豆植物油中提取DNA，但对精炼植物油往往有困难，例如精炼大豆油是在原油基础上经过沉降、脱胶、脱酸、脱色、脱臭等精炼过程，其中的DNA多为200bp以下片段，含量极低(Costa，2010)。SN/T 1203-2010标准中用到的提取DNA方法，对一级精炼油提取过程繁杂，耗时长(3-4天)，不利于快速检测，大大降低了实验的可重复性。这对开发精炼植物油快速，高效，可重复性高的DNA提取技术提出了挑战。目前国内外多种商品化的DNA提取纯化试剂盒，如离子交换柱、磁珠等。虽然操作简单，获得的DNA质量较高，但难以用于精炼食用油的大量富集提取中。
因此业界急需建立一套快速、高效、通用性好的食用油DNA提取方法，以推进食用油DNA检测技术的应用。
发明内容
本发明的发明人发现，利用精炼植物油荧光定量PCR扩增rbcL，各油种其HRM曲线单一固定并且不同油种的HRM曲线有明显区别。
因此，本发明的第一个方面在于，提供一种检测油脂掺杂的方法。
本发明提供的检测油脂掺杂的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA；
(3)、HRM分析。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括在步骤(3)检测HRM特征曲线和/或TM值。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括将结果与所述油脂纯品或所述油脂种子DNA的HRM特征曲线进行比对的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个具体实施方案中，使用的吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐。在本发明的一个具体实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、硫氰酸盐、氯盐和胍盐接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
本发明的第二个方面在于，提供一种检测油脂来源的方法。
本发明提供的检测油脂来源的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA，并确定CT值。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，使用的吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐。在本发明的一个优选实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、硫氰酸盐、氯盐和胍盐接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
本发明的第三个方面在于，提供一种扩增油脂DNA的方法。
本发明提供的扩增油脂DNA的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，使用的吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐。在本发明的一个具体实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、硫氰酸盐、氯盐和胍盐接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
本发明的第四个方面在于，提供一种检测油脂真实性的方法。
本发明提供的检测油脂真实性的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA；
(3)、HRM分析。
在本发明的一个优选实施方案中，检测油脂真实性包括但不限于检测所述油脂是否是所宣称的油脂、检测所述油脂是否掺杂有其他油脂。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括在步骤(3)检测HRM特征曲线和/或TM值。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括将结果与所述油脂纯品或所述油脂种子DNA的HRM特征曲线进行比对的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，使用的吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐。在本发明的一个具体实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、硫氰酸盐、氯盐和胍盐接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA。在本发明的一个优选实施方案中，磁珠吸附时，硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M。在本发明的一个具体实施方案中，使用的硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，氯盐为NaCl和/或KCl，胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
采用本发明提供的方法，实现了快速，高效的DNA提取。该DNA提取方法结合荧光定量PCR检测和高分辨率熔解曲线HRM分析，可以获得已知油品的特征曲线。利用特征曲线的比较，可以对该油品进行真实性检测。对精炼植物油的DNA提取和检测分析，有效地解决了油品中掺杂其他精炼植物油的检测和鉴别标准缺乏的难题。
附图说明
图1显示了不同货架期精炼大豆油样品及对照的HRM分析图，其中，a为花生油的检测结果；b为大豆种子DNA的检测结果；c为调和油的检测结果；d为菜籽油的检测结果；e为大豆油的检测结果；f-j为不同货架期大豆油(f货架期18个月；g货架期15个月；h货架期12个月；i货架期6个月；j货架期1个月)的检测结果。
图2显示了大豆、油菜、花生、玉米和葵花籽的PCR-HRM分析图谱，其中，a为玉米油的图谱，b为花生油的图谱，c为葵籽油的图谱，d为大豆油的图谱，e为菜籽油的图谱。
图3显示了芝麻油混杂玉米油样品的HRM特征曲线，其中，a为芝麻油的检测结果；b-f为芝麻油混合不同比例玉米油(b为1％；c为5％；d为10％；e为30％；f为50％)的检测结果；g为玉米油的检测结果。
图4显示了花生油样品HRM分析图谱，其中，a为花生种子DNA的检测结果；b为大豆油的检测结果；c为菜籽油的检测结果；#1为纯花生油的检测结果；2#，3#，4#，5#和6#分别为精炼花生油样2#，3#，4#，5#和6#的检测结果。
图1-4中的RFU指的是Relative Fluorescence Unit，即相对荧光单位，表示荧光强度。
具体实施方式
应理解，本发明组合物所含组分的重量百分比之和等于100％。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
在本发明中，“HRM分析”指的是高分辨率熔解曲线(high resolution melting)分析，它根据目标DNA序列的长度、GC含量及碱基的互补性差异，利用高分辨率的熔解曲线对样品的基因型进行分析，用HRM分析样品时，待测样品先进行一次常规的染料法定量扩增，紧接着一步高分辨率熔解，既而便可通过熔解曲线的形状判断样品的基因型。“HRM特征曲线”指的是各种作物高分辨率熔解曲线的特征曲线，根据它们独特的熔解曲线，就可以对不同的核酸片段进行区分，用以区分不同油种。
在本发明中，“TM值”指的是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。可通过荧光定量PCR后熔解曲线分析确定。
在本发明中，荧光定量PCR的CT值指的是循环阈值(Cycle threshold)，即每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时，所经历的反应循环数，可通过荧光定量PCR程序读取确定。通过Ct值按荧光定量PCR中的算法可以算出提取样品DNA起始浓度，即可根据CT值表征所提取DNA浓度的大小，CT值越小，表示提取DNA浓度越高。
方法
1、检测油脂掺杂的方法：
本发明提供的检测油脂掺杂的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA；
(3)、HRM分析。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括在步骤(3)检测HRM特征曲线和/或TM值。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括将结果与所述油脂纯品或所述油脂种子DNA的HRM特征曲线进行比对的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，从纯的目标油脂中提取DNA或从目标油脂的种子中提取DNA，进行HRM分析，以与待检测油脂的HRM分析结果比较。在本发明的一个优选实施方案中，还包括将提取的DNA进行扩增的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括根据步骤(3)中获得的HRM特征曲线和/或TM值确定油脂是否掺杂有其他油脂的步骤。在本发明的一个具体实施方案中，可将步骤(3)中获得的HRM特征曲线和/或TM值与不同油脂的HRM特征曲线和/或TM值比较，例如包括但不限于将步骤(3)中获得的HRM特征曲线和/或TM值与预先制备的不同油脂的HRM特征曲线表和/或TM值表比对，以确定油脂来源和/或油脂是否掺杂有其他油脂。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
2、检测油脂来源的方法
本发明提供的检测油脂来源的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA，并确定CT值。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括根据步骤(2)中获得的CT值确定油脂来源的步骤。在本发明的一个具体实施方案中，可将步骤(2)中获得的CT值与不同油脂的CT值比较，例如包括但不限于将步骤(2)中获得的CT值与预先制备的不同油脂的CT值表比对，以确定油脂来源。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
3、扩增油脂DNA的方法
本发明提供的扩增油脂DNA的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
4、检测油脂真实性的方法
本发明提供的检测油脂真实性的方法包括：
(1)、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
(2)、荧光定量PCR扩增步骤(1)获得的DNA；
(3)、HRM分析。
在本发明的一个优选实施方案中，检测油脂真实性包括但不限于检测所述油脂是否属于所宣称的油脂、检测所述油脂是否掺杂有其他油脂。
在本发明的一个具体实施方案中，在步骤(1)前还包括油脂核酸富集的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，从纯的目标油脂中提取DNA或从目标油脂的种子中提取DNA，进行HRM分析。在本发明的一个优选实施方案中，还包括将提取的DNA进行扩增的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括在步骤(3)检测HRM特征曲线和/或TM值。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括将结果与所述油脂纯品或所述油脂种子DNA的HRM特征曲线结果进行比对的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，从纯的目标油脂中提取DNA或从目标油脂的种子中提取DNA，进行HRM分析，以与待检测油脂的HRM分析结果比较。在本发明的一个优选实施方案中，还包括将提取的DNA进行扩增的步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，还包括根据步骤(3)中获得的HRM特征曲线和/或TM值确定油脂真实性的步骤。在本发明的一个具体实施方案中，可将步骤(3)中获得的HRM特征曲线和/或TM值与不同油脂的HRM特征曲线和/或TM值比较，例如包括但不限于将步骤(3)中获得的HRM特征曲线和/或TM值与预先制备的不同油脂的HRM特征曲线表和/或TM值表比对，以确定油脂来源和/或油脂是否掺杂有其他油脂。
在本发明的一个具体实施方案中，所述油脂为植物油。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
实施例
在本发明的下述实施例中，使用的一级精炼大豆油，花生油，玉米油，葵籽油，油菜籽油均购自上海嘉里粮油工业有限公司，大豆、油菜、花生、玉米、葵花籽的种子市场购买获得。
在本发明的下述实施例中，检测用大豆油样品、纯花生油样品均购自上海嘉里粮油工业有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的正己烷、异丙醇、醋酸钠、三氯甲烷、异戊醇、乙醇等为分析纯，购自国药集团；CTAB、1×TE缓冲液购自生工生物(上海)有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的蛋白酶K，RNAse酶，niversal genomic DNAExtraction Kit等均购自Takara公司。SsoAdvancedTM 
Green Supermix，SsoFastTM 
Supermix购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。荧光定量PCR仪为Bio-RadCFX96。
在本发明的下述实施例中，使用的硅胶珠购自：QIAGEN公司；磁珠购自TOYOBO公司。
实施例1、油料作物种子DNA提取
使用研磨机分别把大豆、油菜、花生、玉米和葵花籽种子磨碎，称取100mg粉末，按厂商提供的方法，使用TakaRa DNA提取试剂盒universal genomic DNA Extraction Kit提取，分别获得大豆、油菜、花生、玉米和葵花籽种子DNA。
实施例2、精炼油核酸富集
将250ml正己烷和30ml 2％CTAB溶液加入750ml精炼大豆油中，充分混合搅拌10min；
使用500ml离心管，取350ml混合油样离心，10000g离心10min，吸出油样，保存水相，重复2次，合并获得的水相，将水相加入等体积的氯仿-异戊醇溶液(氯仿:异丙醇＝24:1)，轻缓颠倒数次，以使混合物形成为乳浊液，12000g离心10min；离心后保留水相。
实施例3、直接沉淀法提取DNA
取实施例2中制备的离心后的水相，加1/10体积NaAC和实施例2中制备的水相等体积的冷异丙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜；
分装于1.5ml离心管；于4℃，17000g离心20min，收集沉淀DNA；
向沉淀中加入1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀，10000g离心5min，去除乙醇，并干燥得到DNA沉淀；
向其中一个离心管中加入200μL 1×TE缓冲液，溶解DNA沉淀，溶解完全后溶液转入另外一个离心管接着溶解新管中DNA沉淀，依次溶解完30-40管DNA沉淀，最后溶液4℃保存备用。
按实施例2的方法，重复富集精炼油核酸2次，并按实施例3的方法将富集的精炼油核酸使用直接沉淀法分别提取DNA，统计显示，采用直接沉淀法提取DNA平均耗时30h。
实施例4、硅胶共沉淀法提取DNA
按实施例2的方法富集精炼油核酸，向制备获得的离心后的水相中加1/10体积NaAC、与实施例2的水相等体积异丙醇和20ul硅胶珠，上述混合液-20℃放置过夜，以共沉淀DNA；
加入50ml离心管；于4℃，14500g离心20min，收集沉淀，获得硅胶DNA；
向硅胶DNA中加入1ml 4℃预冷的75％乙醇，以洗涤沉淀，离心，去除乙醇，室温干燥，得到硅胶与DNA的沉淀；
向得到的硅胶DNA沉淀中加入50μL 1×TE缓冲液，以溶解硅胶DNA沉淀，14500g离心5min沉淀硅胶珠后吸出DNA溶液，4℃保存备用。
按实施例2的方法，重复富集精炼油核酸2次，将富集的精炼油核酸使用硅胶共沉淀法分别提取DNA，统计显示，采用硅胶共沉淀法提取DNA平均耗时16h。
实施例5、磁珠吸附法提取DNA
按实施例2的方法富集精炼油核酸，向制备获得的离心后保留的水相，加入50μl磁珠和吸附液混合，以使混合后溶液中含有0.675M KSCN，0.375M NaCl和0.125M CH5N3·HCl，pH＝4.2)，于50ml离心管吸附DNA；漩涡混合器振荡10sec，使磁珠充分混匀，静置30min；将50ml离心管于磁力架上分离磁珠，作用5分钟；吸除上清，加入1ml 4℃预冷的75％乙醇清洗磁珠，漩涡振荡10sec，磁力架上去除乙醇，于55℃干燥磁珠5min；
将50μL 1×TE缓冲液加入到干燥磁珠离心管中，以溶解磁珠DNA，放置磁力架上吸出DNA溶液，4℃保存备用。
按实施例2的方法，重复富集精炼油核酸2次，将富集的精炼油核酸使用磁珠吸附法分别提取DNA，统计显示，采用磁珠吸附法提取DNA平均耗时5h。
实施例6、荧光定量PCR
分别以直接沉淀法提取的DNA、硅胶共沉淀法提取的DNA和磁珠吸附法提取的DNA为模板，以Rbcl-F和Rbcl-R为引物，使用荧光定量PCR进行检测，其中，Rbcl-F和Rbcl-R的序列如下：
Rbcl-F：CTTGATTTTACCAAAGATGATGA(SEQ ID NO:1)，
Rbcl-R：TTCTTCGCATGTACCCGCAG(SEQ ID NO:2)。
PCR反应体系为20μL，其中SsoAdvancedTM 
Green Supermix 10μL，上下游引物各0.25μM，模板DNA 1μL，无菌水补齐至20μL。空白对照以无菌水代替模板DNA。每个反应做三个重复。
PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。
通过荧光PCR，确定循环阈值(CT值Cycle Threshold)，并分别计算使用直接沉淀法提取的DNA、硅胶共沉淀法提取的DNA和磁珠吸附法提取的DNA进行荧光PCR扩增的平均CT值，结果如表1所示。
表1
| 直接沉淀法 | 硅胶共沉淀法 | 磁珠吸附法 | |
| CT值 | 33.5±1.2 | 31.4±0.8 | 28.2±0.5 |
根据上述结果，使用磁珠吸附法提取精炼油DNA，不仅所需时间远少于直接沉淀法和硅胶共沉淀法，而且CT值低，说明反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时，所经历的反应循环数少。DNA浓度高，CT值变幅小，可重复性好，DNA质量高。
实施例7、磁珠吸附法优化
一般的磁珠吸附法仅用于极少量吸附液对高浓度DNA的提取操作，对于富集大量精炼植物油而得到的大体积水相溶液，DNA含量低，一般吸附液不利于DNA的吸附，不易提取到高浓度、高质量的DNA。
按实施例2的方法富集精炼油核酸，向制备获得的离心后保留的水相中加入50μl磁珠，漩涡混合器振荡10sec，向各溶液分别加入TE(使得溶液中含有10mmol/L Tris.Cl,0.1mmol/L EDTA)、吸附液I(使得溶液中含有0.75mol/L NaCl)、吸附液II(使得溶液中含有0.625M KSCN+0.375M NaCl+0.125M CH5N3·HCl)、吸附液III(使得溶液含有1.25M KSCN+0.75M NaCl+0.25M CH5N3·HCl)于50ml离心管吸附DNA，漩涡混合器振荡10sec，使磁珠充分混匀，静置30min；将50ml离心管于磁力架上分离磁珠，作用5分钟；吸除上清，加入1ml 4℃预冷的75％乙醇清洗磁珠，漩涡振荡10sec，磁力架上去除净乙醇，55℃干燥磁珠5min；
将50μL 1×TE缓冲液加入到干燥磁珠离心管中，以溶解磁珠DNA，放置磁力架上吸出DNA溶液，4℃保存备用。
为确定吸附液组分、pH对磁珠法获得的DNA的影响，设置不同吸附液、不同pH实验(使用吸附液II)磁珠吸附效果，对获得的DNA进行实施例6的操作，荧光定量PCR后获得不同的CT值，结果如下表1和表2：
表1：
| 吸附溶液 | CT值 |
| TE | 32.0±0.7 |
| 吸附液I | 32.4±0.5 |
| 吸附液II | 27.5±0.6 |
| 吸附液III | 29.4±0.8 |
表2：
| 吸附液PH值 | CT值 |
| PH＝6.0 | 30.2±0.7 |
| PH＝5.0 | 28.3±0.4 |
| PH＝4.2 | 27.5±0.6 |
根据上表结果，筛选出磁珠法吸附DNA的pH使用范围pH4～6、、KSCN浓度为0.675-1.25M、NaCl浓度为0.375-0.75M、CH5N3·HCl浓度为0.125-0.25M时，磁珠吸附效果最优。
实施例8、
为确定油品的不同储存期对磁珠吸附法获得的DNA的影响，发明人进一步试验了不同货架期的精炼大豆油的DNA提取和荧光定量PCR检测，具体过程如下：
取货架期分别为18个月，15个月，12个月，6个月和1个月的精炼大豆油，按实施例2的方法分别富集相应精炼油的核酸，按实施例5的磁珠吸附法提取DNA，按实施例6的方法进行荧光定量PCR，确定CT值，结果如表2所示。
表2、
| 大豆油样 | 18个月精炼大豆油 | 15个月精炼大豆油 | 12个月精炼大豆油 |
| CT值 | 30.5±1.5 | 29.0±1.2 | 29.0±0.9 |
| 大豆油样 | 6个月精炼大豆油 | 1个月精炼大豆油 | |
| CT值 | 29.0±0.5 | 27.5±0.8 |
根据表2结果，对于精炼大豆油而言，储存期的延长对检测的结果影响并不特别明显。
实施例9
为确定不同油种对磁珠吸附法获得的DNA的影响，发明人进一步试验了不同花生油的DNA提取和荧光定量PCR检测，具体过程如下：
取已知纯花生油(精炼花生油样1#)和配制的5个花生油样品(精炼花生油样2#-6#，其中精炼花生油样2#为纯花生油添加25％玉米油，精炼花生油样3#为纯花生油添加30％玉米油，精炼花生油样4#为纯花生油，精炼花生油样5#为纯花生油添加25％葵籽油，精炼花生油样6#为纯花生油添加30％葵籽油)，并以油菜籽油、大豆油和花生种子DNA为对照，按实施例2的方法分别富集相应精炼油的核酸，按实施例5的磁珠吸附法提取DNA，按实施例6的方法进行荧光定量PCR，确定CT值，结果如表3所示。
表3
| 花生油样品 | 精炼花生油样1# | 精炼花生油样2# | 精炼花生油样3# |
| CT值 | 30.0±0.6 | 30.5±0.5 | 31.0±0.4 |
| 花生油样品 | 精炼花生油样4# | 精炼花生油样5# | 精炼花生油样6# |
| CT值 | 31.0±0.5 | 30.0±0.6 | 31.0±0.8 |
根据表3结果，对于不同花生油，CT值基本相同，DNA提取质量基本一致。
根据上述结果，磁珠吸附法和荧光定量PCR检测方法可用于不同货架期的油品和不同油种的定性检测。
实施例10、荧光定量PCR结合HRM分析确定植物油的特征曲线
分别将实施例1中获得的大豆、油菜、花生、玉米和葵花籽的DNA作为模板，以Rbcl-F和Rbcl-R为引物，进行荧光定量PCR，获得HRM特征曲线，具体过程如下：
分别取模板DNA 1μl，SsoFastTM 
Supermix 10μl，上下游引物(Rbcl-F和Rbcl-R)各0.25μmol/L，并用去离子水补充至20μl。PCR反应条件为98℃3min，98℃15s，52℃30s，72℃延伸30s，共45个循环。95℃1min，70℃1min，然后以0.2℃/0.1s的速度从70℃升温至95℃进行熔解曲线读取程序。
PCR扩增完成与熔解曲线程序读取后，获得表3中各物种TM值，将获得的PCR-熔解曲线数据直接应用Bio-Rad Precision Melt Analysis Software进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析，获得HRM特征曲线(图2)。
表3
| 植物名称 | TM值℃ |
| 花生 | 80.0±0.1 |
| 大豆 | 79.6±0.1 |
| 油菜 | 78.8±0.2 |
| 玉米 | 81.0±0.1 |
| 葵花籽 | 79.6±0.1 |
实施例11、精炼大豆油与不同储存期精炼大豆油的HRM特征曲线
为确定精炼大豆油的HRM特征曲线与大豆种子的HRM特征曲线是否一致，以及确定油品的不同储存期对使用上述方法测定的HRM特征曲线的影响，分别使用货架期分别为18个月，15个月，12个月，6个月和1个月的精炼大豆油DNA样品进行荧光定量PCR扩增，并进行HRM特征曲线分析，并以花生油，油菜油，大豆油，调和油(油菜油和大豆油体积比7:3混合)和大豆种子DNA为对照，结果如图1所示。
根据图1结果，不同货架期精炼大豆油DNA荧光定量PCR扩增的熔解度曲线与菜油的有明显区别，表明大豆油有一致的HRM特征曲线。根据图1结果，不同货架期精炼大豆油DNA荧光定量PCR扩增的熔解度曲线是和大豆种子DNA的一致，因此，HRM分析也适用于所得不同货架期精炼大豆油。
实施例12、食用油掺杂检测
12.1
将芝麻油以不同比例与玉米油混合，其中玉米油含量分别为1％、5％、10％、30％和50％。分别使用磁珠吸附法提取上述混合油脂的DNA，进行PCR-HRM特征曲线分析，以纯芝麻油和纯玉米油为对照，结果如图3所示。
根据图3结果，上述掺杂了玉米油的芝麻油的HRM特征曲线与芝麻油、玉米油的HRM特征曲线不同，因此，可通过HRM特征曲线进行食用油掺杂检测。
12.2
为进一步确定本发明的方法的可行性，将纯花生油(花生油1#)及配制的花生油(花生油2#，3#，4#，5#和6#，其中精炼花生油样2#为纯花生油添加25％玉米油，精炼花生油样3#为纯花生油添加30％玉米油，精炼花生油样4#为纯花生油，精炼花生油样5#为纯花生油添加25％葵籽油，精炼花生油样6#为纯花生油添加30％葵籽油)5个样品作为盲样(即实验人员仅知为花生油，但不清楚样品是否掺杂及如何掺杂)分别检测TM值和HRM分析，并以纯花生油样品为对照，结果如图4所示。
图4结果显示，5个待检测花生油样品和1个纯花生油样品的曲线是不完全一致的，它们的TM值上也有显著差异，其中，油样#4和纯花生油#1一致，TM值为80.0；油样#2和#3的TM值比纯花生油#1的高，油样#5和#6的TM值比纯花生油的明显低。高分辨率熔解曲线HRM分析可以更清晰地看出：油样#4、纯花生油#1与花生DNA的一致；#2和#3油样在花生的上方归为一类，表明掺杂的食用油是同一种方向的油，同一种油掺杂比例相近；#5和#6油样在花生的下方归为一类，表明掺杂的食用油是同一种方向的油，同一种油掺杂比例相近。该结果与配制的结果一致，因此，该方法可行有效，甚至可用于初步判断所掺杂的油种。
实施例13、
分别按实施例2的方法富集精炼玉米油、菜籽油和葵花籽油的核酸，并按实施例5的方法提取DNA，按实施例6的方法进行荧光定量PCR，确定CT值，结果显示，磁珠吸附法提取精炼食用油DNA对这三种精炼植物油均适用，CT值基本相同，DNA提取质量基本一致，因此，认为本发明的磁珠吸附法适合所有精炼植物油的DNA提取，而且提取效果稳定。进一步检测HRM特征曲线，结果显示：每种精炼植物油的HRM曲线和各自种子DNA的HRM特征曲线一致，因此，磁珠吸附法提取的DNA对各种植物油的HRM曲线没有任何影响，食用油的真实性可以通过比对HRM特征曲线是否一致来判断。
采用本发明提供的磁珠吸附法，实现了对精炼植物油快速，高效的DNA提取。该DNA提取方法结合荧光定量PCR检测和高分辨率熔解曲线HRM分析，可以获得已知油品的特征曲线。利用特征曲线的比较，可以对该油品进行真实性检测。对精炼植物油的DNA提取和检测分析，有效地解决了油品中掺杂其他精炼植物油的检测和鉴别标准缺乏的难题。
可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。
Claims (9)
1.一种检测油脂掺杂的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
（2）、荧光定量PCR扩增步骤（1）获得的DNA；
（3）、HRM分析；
所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA，所述吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐；
所述硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，所述氯盐为NaCl和/或KCl，所述胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl；
磁珠吸附时硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为 0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。
2.一种检测油脂来源的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
（2）、荧光定量PCR扩增步骤（1）获得的DNA，并确定CT值；
所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA，所述吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐；
所述硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，所述氯盐为NaCl和/或KCl，所述胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl；
磁珠吸附时硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为 0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。
3.一种扩增油脂DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
（2）、荧光定量PCR扩增步骤（1）获得的DNA；
所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA，所述吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐；
所述硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，所述氯盐为NaCl和/或KCl，所述胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl；
磁珠吸附时硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为 0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。
4.一种检测油脂真实性的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）、磁珠吸附法提取所述油脂中的DNA；
（2）、荧光定量PCR扩增步骤（1）获得的DNA；
（3）、HRM分析；
所述磁珠吸附为将DNA水相与磁珠、吸附液接触，以吸附富集于水相的油脂中的DNA，所述吸附液中包含硫氰酸盐、氯盐和胍盐；
所述硫氰酸盐为KSCN、硫氰酸胍和/或异硫氰酸胍，所述氯盐为NaCl和/或KCl，所述胍盐类化合物为硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或CH5N3·HCl；
磁珠吸附时硫氰酸盐浓度为0.675-1.25M、氯盐浓度为 0.375-0.75M、胍盐浓度为0.125-0.25M，pH4-6。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（1）前还包括油脂核酸富集的步骤。
6.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤（3）检测HRM特征曲线和/或TM值。
7.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述方法包括将HRM分析结果与所述油脂纯品或所述油脂种子DNA的HRM特征曲线进行比对的步骤。
8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂为植物油。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为大豆、油菜、花生、玉米或葵花籽。
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