CN105601582B - 一种从披碱草中提取得到的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从披碱草中提取分离得到的化合物，其特征在于：其结构式为：本发明还提供其制备方法和应用。本申请人首次从带内生真菌bromicola的披碱草中提取分离得到本发明的化合物，并通过一系列的谱图(高分辨质谱、氢谱、碳谱、二维核磁等)以及X射线单晶衍射分析，最终确定了它的结构，是一种首次分离得到的新颖骨架的大环肽化合物。通过对其进行实验，发现其有很好的杀虫效果，尤其对于甘蓝蚜有良好的杀虫效果，因此，该化合物是一种极有前景的可持续利用的植物源农药。并且，以带有内生真菌
Description
技术领域
本发明涉及一种从披碱草中提取得到的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
我国草地业发展缓慢，最直接的影响就是造成畜牧业发展也减速，因而致使每年我国从国外进口牧草以及购买婴儿奶制品的数量逐年上升。究其原因主要是因为我国缺少具有抗性的优异牧草品种，如有杀虫活性的牧草。每年我国牧草由于各种昆虫的危害，造成大面积减产和生长缓慢，并且还影响奶制品的安全。虽然现阶段化学合成的杀虫药物在植物病害防治中起着不可代替的作用，但是大家对农药毒性和农药对环境的污染问题越来越重视，从微生物中寻找新的无毒、无污染、可持续利用的生物源杀虫剂已成为现代农药研究开发的一个热点。
植物源杀虫剂是指利用植物及其代谢产物来防治害虫。由于这类植物微源杀虫剂不会对生态环境产生污染，还具有可持续性，所以，将是杀虫药物研制与生产单位重要的工作方向。
发明内容
本发明提供了一种从披碱草中提取得到的化合物，是一种新颖骨架的环肽化合物，具有良好的杀虫活性；并且提供其制备方法和应用。
禾草的很多草已成为具有杀虫活性的优异牧草，如醉马草，中华羊茅等，根据本申请人分析，其抗性特点来源于自身的内生真菌为其宿主提供的此利益。如果能从带内生真菌的禾草中找到具有杀虫活性的代谢物，那么可以从这些具有杀虫活性的牧草中筛选出具有抗虫性的优良牧草，这将解决我国缺乏具有杀虫抗性的优良牧草问题；同时，得到一种对生态环境无污染的植物源生物农药。
本发明的第一个目的是提供一种从披碱草中提取分离得到的化合物，其结构式如式(Ⅰ)所示：
本发明还提供上述化合物的制备方法，所述化合物是从带内生真菌bromicola的披碱草中提取分离得到的。
作为优选，将带内生真菌bromicola的披碱草干燥粉碎后，先用甲醇提取，再用乙酸乙酯萃取，然后用大孔树脂柱和反相色谱柱分离，重结晶得到的。
作为优选，步骤如下：
(1)收集带内生真菌bromicola的披碱草并晾干粉碎，得到干草；
(2)用工业甲醇在室温下浸泡3-7天，浸泡3-4次；作为优选，所述干草(kg)与工业甲醇(L)的用量比为1:2-1:6；
(3)去除溶剂，得到粗浸膏；
(4)将粗浸膏溶解后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，去除溶剂，得到浸膏；
作为优选，所述粗浸膏(g)和乙酸乙酯(mL)的用量比为1:5-1:10；
作为优选，萃取的次数为3-5次；
(5)将浸膏以水-甲醇作溶剂过大孔树脂柱，再以反相色谱柱和重结晶分离，得到化合物。
作为优选，所述大孔树脂柱的规格为：外径10.0cm，长60.0cm；
作为优选，过大孔树脂柱时水和甲醇的体积比为1:1-3:1。
作为优选，所述反相色谱柱的规格为：外径2.0cm，长30.0cm；
作为优选，过反相色谱柱时水和甲醇的体积比为3:2-5:2。
本发明的第三个目的是提供上述化合物在制备杀虫剂中的应用。
作为优选，所述虫为甘蓝蚜。
本发明的第四个目的是提供一种植物源杀虫剂，所述杀虫剂的有效成分为权利要求1所述的化合物。
本发明的第五个目的是提供上述化合物在检测披碱草抗虫性和筛选具有杀虫活性的披碱草中的应用。
本申请人首次从带内生真菌bromicola的披碱草中提取分离得到本发明的化合物，并通过一系列的谱图(高分辨质谱、氢谱、碳谱、二维核磁)以及X射线单晶衍射分析，最终确定了它的结构，是一种首次分离得到的新颖骨架的大环肽化合物。通过对其进行实验，发现其有很好的杀虫效果，尤其对于甘蓝蚜有良好的杀虫效果，因此，该化合物是一种极有前景的可持续利用的植物源农药。并且，以带有内生真菌bromicola的披碱草为种子，可以培育出具有杀虫活性的优势草，为草地业的发展做出贡献。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明化合物的氢谱图；
图2为本发明化合物的碳谱图；
图3为本发明化合物的DEPT谱图；
图4为本发明化合物的1H-1H COSY谱图；
图5为本发明化合物的HSQC谱图；
图6为本发明化合物的HMBC谱图；
图7为本发明化合物的高分辨质谱图；
图8为本发明化合物的X射线单晶衍射图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明化合物的制备过程如下：
1)播种带bromicola内生真菌的披碱草(Elymus dahuricus)种子，该bromicola内生真菌选用文献Origin,Divergence,and Phylogeny of AsexualEndophyte in Elymus Species from Western China，10(5):e0127096.doi:10.1371/journal.pone.0127096中标号为NI_201306的菌株，上述披碱草是从甘肃采集的，十月份左右将带bromicola内生真菌的披碱草进行收集；
2)将步骤1)得到的披碱草放置阴凉处进行晾干，得到干草；
3)将步骤2)得到的干草粉碎，用工业甲醇在室温下进行浸泡，每次3-7天，共浸泡3-4次；干草(kg)与工业甲醇(L)的用量比为1:2-1:6；
4)将步骤3)得到的浸泡液体用旋转蒸发仪去除溶剂，得到粗浸膏；
5)将步骤4)得到的粗浸膏用蒸馏水溶解，再用乙酸乙酯进行萃取，萃取3-5次，合并萃取液体，用旋转蒸发仪去除溶剂得到浸膏；粗浸膏(g)和乙酸乙酯(mL)的用量比为1:5-1:10；
6)将浸膏以水-甲醇(体积比1:1-3:1)作溶剂过大孔树脂柱子(柱子规格为外径10.0cm，长60.0cm；型号为HP-20，日本三菱)，再经反相色谱柱(型号RP-18,德国默克)水-甲醇(体积比3:2-5:2)(外径2.0cm，长30.0cm)和重结晶分离得到本发明的化合物：dahurelmusin A。
实施例1本发明的化合物的制备实施例
1)播种带bromicola内生真菌的披碱草(Elymus dahuricus)种子，该bromicola内生真菌选用文献Origin,Divergence,and Phylogeny of AsexualEndophyte in Elymus Species from Western China，10(5):e0127096.doi:10.1371/journal.pone.0127096中标号为NI_201306的菌株，上述披碱草是从甘肃采集的，十月份左右将带bromicola内生真菌的披碱草进行收集；
2)将步骤1)得到的披碱草放置阴凉处进行晾干，得到干草4.0kg；
3)将步骤2)得到的干草粉碎，用16L工业甲醇在室温下进行浸泡，每次6天，共浸泡3次；
4)将步骤3)得到的浸泡液体用旋转蒸发仪去除溶剂，得到粗浸膏40g；
5)将步骤4)得到的粗浸膏用350mL蒸馏水溶解，再用350mL的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液体，用旋转蒸发仪去除溶剂得到浸膏25.0g；
6)将浸膏以水-甲醇(体积比1:1)作溶剂过大孔树脂柱子(柱子规格为外径10.0cm，长60.0cm；型号为HP-20，日本三菱)，再经反相色谱柱(型号RP-18,德国默克)水-甲醇(体积比3:2)(外径2.0cm，长30.0cm)和重结晶分离得到本发明的化合物：dahurelmusinA，重量为9.2mg。
实施例2本发明的化合物的制备实施例
1)播种带bromicola内生真菌的披碱草(Elymus dahuricus)种子，该bromicola内生真菌选用文献Origin,Divergence,and Phylogeny of AsexualEndophyte in Elymus Species from Western China，10(5):e0127096.doi:10.1371/journal.pone.0127096中标号为NI_201306的菌株，上述披碱草是从甘肃采集的，十月份左右将带bromicola内生真菌的披碱草进行收集；
2)将步骤1)得到的披碱草放置阴凉处进行晾干，得到干草4.0kg；
3)将步骤2)得到的干草粉碎，用8L工业甲醇在室温下进行浸泡，每次7天，共浸泡4次；
4)将步骤3)得到的浸泡液体用旋转蒸发仪去除溶剂，得到粗浸膏40g；
5)将步骤4)得到的粗浸膏用300mL蒸馏水溶解，再用200mL的乙酸乙酯进行萃取，萃取5次，合并萃取液体，用旋转蒸发仪去除溶剂得到浸膏25.0g；
6)将浸膏以水-甲醇(体积比3:1)作溶剂过大孔树脂柱子(柱子规格为外径10.0cm，长60.0cm；型号为HP-20，日本三菱)，再经反相色谱柱(型号RP-18,德国默克)水-甲醇(体积比5:2)(外径2.0cm，长30.0cm)和重结晶分离得到本发明的化合物：dahurelmusinA，重量为9.0mg。
实施例3本发明的化合物的制备实施例
1)播种带bromicola内生真菌的披碱草(Elymus dahuricus)种子，该bromicola内生真菌选用文献Origin,Divergence,and Phylogeny of AsexualEndophyte in Elymus Species from Western China，10(5):e0127096.doi:10.1371/journal.pone.0127096中标号为NI_201306的菌株，上述披碱草是从甘肃采集的，十月份左右将带bromicola内生真菌的披碱草进行收集；
2)将步骤1)得到的披碱草放置阴凉处进行晾干，得到干草4.0kg；
3)将步骤2)得到的干草粉碎，用24L工业甲醇在室温下进行浸泡，每次3天，共浸泡3次；
4)将步骤3)得到的浸泡液体用旋转蒸发仪去除溶剂，得到粗浸膏40g；
5)将步骤4)得到的粗浸膏用380mL蒸馏水溶解，再用300mL的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，合并萃取液体，用旋转蒸发仪去除溶剂得到浸膏25.0g；
6)将浸膏以水-甲醇(体积比2:1)作溶剂过大孔树脂柱子(柱子规格为外径10.0cm，长60.0cm；型号为HP-20，日本三菱)，再经反相色谱柱(型号RP-18,德国默克)水-甲醇(体积比2:1)(外径2.0cm，长30.0cm)和重结晶分离得到本发明的化合物：dahurelmusinA，重量为9.3mg。
实施例4本发明的化合物的制备实施例
1)播种带bromicola内生真菌的披碱草(Elymus dahuricus)种子，该bromicola内生真菌选用文献Origin,Divergence,and Phylogeny of AsexualEndophyte in Elymus Species from Western China，10(5):e0127096.doi:10.1371/journal.pone.0127096中标号为NI_201306的菌株，上述披碱草是从甘肃采集的，十月份左右将带bromicola内生真菌的披碱草进行收集；
2)将步骤1)得到的披碱草放置阴凉处进行晾干，得到干草4.0kg；
3)将步骤2)得到的干草粉碎，用14L工业甲醇在室温下进行浸泡，每次4天，共浸泡3次；
4)将步骤3)得到的浸泡液体用旋转蒸发仪去除溶剂，得到粗浸膏40g；
5)将步骤4)得到的粗浸膏用350mL蒸馏水溶解，再用250mL的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，合并萃取液体，用旋转蒸发仪去除溶剂得到浸膏25.0g；
6)将浸膏以水-甲醇(体积比1:1)作溶剂过大孔树脂柱子(柱子规格为外径10.0cm，长60.0cm；型号为HP-20，日本三菱)，再经反相色谱柱(型号RP-18,德国默克)水-甲醇(体积比5:2)(外径2.0cm，长30.0cm)和重结晶分离得到本发明的化合物：dahurelmusinA，重量为9.1mg。
实施例5本发明的化合物的制备实施例
1)播种带bromicola内生真菌的披碱草(Elymus dahuricus)种子，该bromicola内生真菌选用文献Origin,Divergence,and Phylogeny of AsexualEndophyte in Elymus Species from Western China，10(5):e0127096.doi:10.1371/journal.pone.0127096中标号为NI_201306的菌株，上述披碱草是从甘肃采集的，十月份左右将带bromicola内生真菌的披碱草进行收集；
2)将步骤1)得到的披碱草放置阴凉处进行晾干，得到干草4.0kg；
3)将步骤2)得到的干草粉碎，用20L工业甲醇在室温下进行浸泡，每次4天，共浸泡3次；
4)将步骤3)得到的浸泡液体用旋转蒸发仪去除溶剂，得到粗浸膏40g；
5)将步骤4)得到的粗浸膏用400mL蒸馏水溶解，再用300mL的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液体，用旋转蒸发仪去除溶剂得到浸膏25.0g；
6)将浸膏以水-甲醇(体积比3:1)作溶剂过大孔树脂柱子(柱子规格为外径10.0cm，长60.0cm；型号为HP-20，日本三菱)，再经反相色谱柱(型号RP-18,德国默克)水-甲醇(体积比3:2)(外径2.0cm，长30.0cm)和重结晶分离得到本发明的化合物：dahurelmusinA，重量为9.2mg。
实施例6
本申请人对应用本发明的方法得到的dahurelmusin A进行了鉴定，其结构如下所示：
具体鉴定过程为：
(1)Dahurelmusin A，为无色晶体。结合核磁13C NMR和DEPT谱图,以及高分辨质谱得出该化合物的分子式为C18H30O5N2。该化合物的1H NMR显示该化合物存在一个N-H官能团其化学位移为δH 6.89(d,J＝10.0Hz)；一个连氧次甲基质子δH 5.19(d,J＝9.2Hz)；1个氮甲基官能团δH 3.16，2个单峰甲基化学位移分别为δH 1.76和1.62；3个双峰甲基化学位移分别为δH 1.32(d,J＝7.2Hz),1.02(d,J＝7.2Hz),0.91(d,J＝6.8Hz)；以及1个三重峰甲基δH0.94(t,J＝7.2Hz)。13C NMR和DEPT谱显示该化合物有18个碳，包括4个羰基碳，1个季碳，4个次甲基碳，2个亚甲基碳以及7个甲基碳。2个氨基酸碳(δC/H 54.9/2.92,4.96；49.9/4.60)，1个氮甲基官能团(δC/H 36.5/3.16)，2个酰胺碳(169.8,170.0)显示该化合物是一个肽。
(2)该化合物1H-1H COSY显示出H3-11,H-3以及N-H相关；HMBC谱图显示H3-11(δH5.19)和C-4相关揭示其存在一个丙氨酸。同时HMBC谱图中，H-1(δH 2.92,4.96)与C-2相关，氮甲基(δH 3.16)与C-1和C-9相关表明该化合物包含一个氮甲基甘氨酸。另外，1H-1H COSY显示H3-15,H2-14,H-12,H-5,H-6,和H3-16相关；HMBC谱图显示c H3-17/18(δH 1.62,1.76)与C-7,C-8以及C-9相关表明该化合物存在5-hydroxy-2,2,4,6-tetramethyl-3-oxo-octanoic acid(HTMOO)片段。在HMBC谱图中，H-1(δH 2.92,4.96)与C-3；氮甲基(δH 3.16)羰基碳(δC 170.0)；H-5(δH 5.19)酰胺碳(δC 169.5)相关，将该化合物的整个平面结构确定了。同时单晶图也更进一步确定了该化合物的结构。
(3)本申请人通过核磁共振(氢谱和碳谱参见表1)、二维核磁和高分辨质谱确定了该化合物的分子式为C18H30O5N2。从核磁数据(δC/H 54.9/2.92,4.96；49.9/4.60)、(δC/H36.5/3.16)、2个酰胺碳(δC 169.8,170.0)可以分别看出有两个氨基酸碳、一个N-甲基、两个酰胺碳，这些数据说明本发明的化合物dahurelmusin A为肽类化合物。
(4)本申请人通过X射线单晶衍射分析确定了该化合物的平面结构和立体中心。单晶衍射图参见图8。
表1本发明化合物的氢谱和碳谱
实施例7
本发明的化合物dahurelmusin A对甘蓝蚜的杀虫活性
1、供试虫为：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)。
2、实验方法：
Dahurelmusin A的杀虫活性按照一下方法进行：将测试样品用少量丙酮溶解至浓度为2g/L，然后用含吐温-80的蒸馏水稀释到所需要浓度。30只成年甘蓝蚜用配好的溶液进行实验，在虫体前胸背板处点滴约0.5μL供试液,之后将虫子转入垫有保湿滤纸的培养皿中,饲喂新鲜油菜叶片，放置室温，24小时后观察其死亡率。每个实验重复3次。丙酮作为空白对照。
3、实验结果：
Dahurelmusin A对甘蓝蚜的触杀活性的LC50为92.0μM，说明其具有潜在的杀虫活性。
实施例8
检测披碱草抗虫性强弱的方法如下：
对采集的披碱草按照实施例1的方法进行提取，得到的化合物量多，则抗虫性强，量少，则抗虫性相对较弱。
实施例9
将带有bromicola内生真菌的披碱草的种子播种，就能够得到具有杀虫活性的披碱草。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.化合物的制备方法，所述化合物的结构式如式（Ⅰ）所示，其特征在于：所述化合物是从带内生真菌Epichloë bromicola的披碱草中提取分离得到的
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（Ⅰ）。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将带内生真菌Epichloë bromicola的披碱草干燥粉碎后，先用甲醇提取，再用乙酸乙酯萃取，然后用大孔树脂柱和反相色谱柱分离，重结晶得到的。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）收集带内生真菌Epichloë bromicola的披碱草并晾干粉碎，得到干草；
（2）用工业甲醇在室温下浸泡3-7天，浸泡3-4次；
（3）去除溶剂，得到粗浸膏；
（4）将粗浸膏溶解后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，去除溶剂，得到浸膏；
（5）将浸膏以水-甲醇作溶剂过大孔树脂柱，再经反相色谱柱和重结晶分离，得到化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述干草与工业甲醇的用量比为1:2-1:6，单位为kg：L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述粗浸膏和乙酸乙酯的用量比为1:5-1:10，单位为g：ml。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，萃取的次数为3-5次。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述大孔树脂柱的规格为：外径10.0cm，长60.0cm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：过大孔树脂柱时水和甲醇的体积比为1:1-3:1。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反相色谱柱的规格为：外径2.0cm，长30.0cm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：过反相色谱柱时水和甲醇的体积比为3:2-5:2。
11.权利要求1中所述的化合物在制备杀虫剂中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述虫为甘蓝蚜。
13.一种植物源杀虫剂，其特征在于：所述杀虫剂的有效成分为权利要求1中所述的化合物。
14.权利要求1中所述的化合物在检测披碱草抗虫性和筛选具有杀虫活性的披碱草中的应用。
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