CN105572383A - 一种用于检测细胞角蛋白19的胶体金层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于细胞角蛋白19（CK19）的胶体金层析试纸条及其制备方法。胶体金层析试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，所述底板一端顺次搭接粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其特征在于：所述结合垫为涂覆有CK19单克隆抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜,所述硝酸纤维膜上包被检测T线和质控C线，T线为CK19的多克隆抗体，C线为与CK19单克隆抗体对应的二抗。本发明制备的胶体金层析试纸条使用简便、快捷、灵敏度高、特异性好，能够用于术中检测，为临床医生提供后续手术方案的指导，具有重要的临床意义。

Description

一种用于检测细胞角蛋白19的胶体金层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫检测分析技术领域，特别是涉及一种用于检测淋巴组织、肿瘤组织裂解液或体液中、肿瘤细胞中细胞角蛋白19（CK19）的胶体金层析试纸条及其制备方法。

背景技术

随着生活方式的快速改变，现代人罹患癌症的概率不断增高，其高发病率和死亡率已经成为城市和农村人口死亡的主要原因。手术是癌症治疗最常用的手段之一。随着人们对癌症治疗认识的不断深入，手术治疗的模式也逐渐从“最大可耐受治疗”向“最小可有效治疗”转变，更加关注患者术后的生活质量。

前哨淋巴结是指通过淋巴管进行转移的癌细胞首先到达的一个或数个淋巴结。淋巴结分级是决定早期癌症的诊断、治疗和预后的重要因素之一。根据癌灶附近淋巴结的状态，医生可以为患者制定相应的治疗策略。如果前哨淋巴结中能够检测到肿瘤细胞，则证明癌症已经不是局部病变，已经发展成全身性疾病，必须通过淋巴清扫来局部抑制肿瘤的发展，同时结合放、化疗进行后续治疗，而患者的预后通常不好；如果前哨淋巴结中没有发现癌细胞的转移，则证明患者的肿瘤分期较早，可以不用进行淋巴清扫。淋巴清扫直观的反映就是淋巴循环中断，造成患者局部水肿；淋巴清扫时伤及神经，造成患者局部麻木，持续性疼痛；淋巴清扫时伤及肌肉组织，造成患者运动障碍。随着影像学技术和人们对癌症防范意识的提高，癌症的早期确诊率在不断提高，而通常在早期癌症中，很多患者的癌旁淋巴结通常没有发生癌症转移，对这部分病人进行淋巴清扫不但不能提高病人的生存率，而且会因为过度治疗极大的影响病人的生存质量，给病人及家属带来很多麻烦。

为了准确评估癌旁淋巴组织的状态，临床上逐渐探索出了前哨淋巴活检术的方法。现有的前哨淋巴中癌细胞的转移状态可以通过组织病理学检查来判断，目前最常用的方法是冰冻切片和石蜡切片两种。冰冻切片的优势在于简单快速，通过HE染色，大约30分钟左右可以得到结果，如果结果为阳性就需要进行淋巴清扫，结果为阴性则仅需切除癌组织。该方法最大的不足是假阴性率较高，不同医院结果不同，通常在5%～10%之间，假阴性结果会给病人带来二次手术的痛苦。石蜡切片是判断癌细胞是否发生转移的金标准，该方法通常需要3～5天才能得到结果，不能在术中快速提供前哨淋巴是否发生癌转移的信息。如果采用该方法，则病人要进行两次手术，对病人造成很大痛苦同时耽误后续治疗。同时，切片方法还存在有共同的不足之处：1.前哨淋巴的数量一般会多达10枚以上，为了节省人力，一般只随机挑选几个进行检测，容易造成漏检。2.组织的利用程度低，通常只会截取几个截面进行染色分析，其余的遗弃，如果转移灶的体积较小则容易造成漏检。3.结果非客观标准。不同病理医生对同一张片子的判读结果可能不同。

细胞角蛋白19（CK19）是上皮细胞的特异性标志物，在肌肉组织（平滑肌、心肌、骨骼肌等）、结缔组织（血液、骨、脂肪）和神经组织中均不表达，90%以上的恶性肿瘤是上皮细胞发展而来，因此通过检测CK19蛋白可以确定前哨淋巴结中是否存在有转移的癌细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种方便、快捷、准确度高的检测CK19的胶体金层析试纸条及其制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种用于细胞角蛋白19（CK19）检测的胶体金层析试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，所述底板一端顺次搭接粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其特征在于：所述结合垫为涂覆有CK19单克隆抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜,所述硝酸纤维膜上包被检测T线和质控C线，T线为CK19的多克隆抗体，C线为与CK19单克隆抗体对应的二抗。

进一步，还包括一卡壳，所述胶体金层析试纸条置于所述卡壳内，卡壳上开有显色区和加样孔，加样区对准样品垫所在区域，显色区对准T线和C线所在区域。

此外，本发明还提供了一种胶体金层板试纸条的制备方法，包括如下步骤：

（1）取200μgCK19蛋白的单克隆抗体置于透析袋中采用5mMTris-HCl透析24h,在此过程中，每隔2h换一次水，透析完成后，将单克隆抗体取出置于离心管中，加入三蒸水至2mL,离心后弃去沉淀杂质；

（2）制备结合物垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器用王水过夜浸泡，然后冲洗干净,将烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入10mL的1%的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1%的氯金酸溶液，煮沸15min后停止加热，待冷却后置于4度冰箱保存;颗粒直径大约为20~50nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入150μL0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7.0，搅拌均匀，然后加入离心好的单克隆抗体，搅拌20min左右，然后加入2mL10%的BSA溶液，离心，（40min,10000rpm），然后弃去上清液，再加入1%的BSA的溶液（含有1mM的pH8.6的缓冲溶液）继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：150mM的NaCl，1%的BSA，0.5%的蔗糖，0.5%的酪蛋白钠，将其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后冻干，作为结合垫，室温避光保存备用；

（3）在聚氯乙烯(PVC)胶板上一端顺次相互搭接地贴附样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

（4）通过三维平面划膜仪在硝酸纤维素膜上包被T线和C线，C线为CK19单克隆抗体对应的二抗，浓度为0.5-5mg/mL，包被参数为0.5-3μL/cm；T线为CK19的多克隆抗体，浓度为0.1-3mg/mL,包被参数为0.5-3μL/cm；；

（5）将PVC胶板及贴附的材料切成4mm宽度的试纸条；

（6）将步骤（5）中的试纸条装入卡壳内，卡壳上开有显色区和加样孔，加样区对准样品垫位置，显色区对准T线和C线所在区域；

（7）将试纸条装在铝箔袋中，内装一个干燥剂和滴管，进行密封室温保存。

本发明提供了一种用于淋巴组织、肿瘤组织裂解液或体液中、肿瘤细胞中CK19检测的胶体金层析试纸条及其制备方法，较之前的方法使用更加简便、快捷、灵敏度高、特异性好。能够用于术中检测，为临床医生提供后续手术方案的指导。通过提高组织利用度减少了假阴性的发生率，通过层析试纸条的方法加快了检测速度，最终达到降低漏诊率、减轻病人痛楚、提高医生工作效率的目的，具有重要的临床意义。

附图说明

图1为用于检测CK19的胶体金试纸条示意图；

图2为胶体金试纸条的产品示意图；

其中，附图2中各标号所代表的结构如下：

1、加样区；2、观测区；3、T线；4、C线；5、卡壳。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如图1所示，本发明提供了一种用于细胞角蛋白19（CK19）检测的胶体金层析试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，所述底板一端顺次搭接粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其特征在于：所述结合垫为涂覆有CK19单克隆抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜,所述硝酸纤维膜上包被检测T线和质控C线，T线为CK19的多克隆抗体，C线为与CK19单克隆抗体对应的二抗。

优选地，所述检测线T线包被的蛋白的浓度为0.1-3mg/mL，优选为0.2-1mg/mL，进一步优选为0.5mg/mL；所述检测线T线包被的蛋白的包被参数为0.5-3μL/cm，优选为0.6-2.5μL/cm，进一步优选为1μL/cm。

所述质控线C线包被的蛋白的浓度为0.5-5mg/mL，优选为0.5-3mg/mL，进一步优选为1mg/mL；所述质控线C线包被的蛋白的包被参数为0.5-3μL/cm，优选为0.6-2.5μL/cm，进一步优选为1μL/cm。

优选地，所述试纸条的检测线T线与质控线C线之间的距离为2-8mm，优选为3-7mm，进一步优选为4mm。

进一步，所述CK19单克隆抗体-胶体金结合物中胶体金可替换为修饰银、铜、铁、铂、钯、硒、碳、硼、镁、铝、钙、钛、钴、锰、钼、锌或镉、铬纳米材料中的任意一种或多种组合。

优选地，如图2所示，还可将所述胶体金层析试纸条置于一卡壳5内，卡壳5上开有显色区2和加样区1，加样区1对准样品垫所在区域，显色区2对准T线3和C线4所在区域。

此外，本发明还提供了一种胶体金层板试纸条的制备方法，包括如下步骤：

（1）取200μgCK19蛋白的单克隆抗体置于透析袋中采用5mMTris-HCl透析24h,在此过程中，每隔2h换一次水，透析完成后，将抗体1取出置于离心管中，加入三蒸水至2mL,离心后弃去沉淀杂质；

（2）制备结合垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器用王水过夜浸泡，然后冲洗干净,将烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入10mL的1%的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1%的氯金酸溶液，煮沸15min后停止加热，待冷却后置于4度冰箱保存;颗粒直径大约为20~50nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入150μL0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7.0，搅拌均匀，然后加入离心好的抗体1，搅拌20min左右，然后加入2mL10%的BSA溶液，离心，（40min,10000rpm），然后弃去上清液，再加入1%的BSA的溶液（含有1mM的pH8.6的缓冲溶液）继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：150mM的NaCl，1%的BSA，0.5%的蔗糖，0.5%的酪蛋白钠，将其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后冻干，作为结合物垫，室温避光保存备用；

（3）在PVC胶板上一端顺次相互搭接地贴附样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜，另一端贴附有吸水纸；

（4）通过三维平面划膜仪在硝酸纤维素膜上包被T线和C线，C线为CK19单克隆抗体对应的二抗，浓度为0.5-5mg/mL，包被参数为0.5-3μL/cm；T线为CK19的多克隆抗体，浓度为0.1-3mg/mL,包被参数为0.5-3μL/cm；

（5）将PVC胶板及贴附的材料切成4mm宽度的试纸条；

（6）将步骤（5）中的试纸条装入卡壳内，卡壳上开有显色区和加样孔，加样区对准样品垫位置，显色区对准T线和C线所在区域；

（7）将试纸条装在铝箔袋中，内装一个干燥剂和滴管，进行密封室温保存。

上述胶体金层析试纸条检测前哨淋巴中CK19的方法如下：

（1）前哨淋巴结样品收集。将所获取的前哨淋巴结裂解，进行CK19蛋白提取并获得样品溶液。采取常用的组织裂解技术，包括称量、剪碎、匀浆、离心等步骤；

（2）开始检测，打开铝箔袋，取出试纸条，平放在检测台面上，然后滴加淋巴结组织裂解液100μl于加样区中，10到15分钟左右观察结果，20分钟以后检测结果视为无效；

（3）结果判断：若T线处显示红色条带，说明样品中含有CK19蛋白，判定为阳性，发生了肿瘤转移；若T线处未显示红色条带，说明样品中不含有CK19蛋白，判定为阴性，未发生了肿瘤转移；无论T线处情况如何，只要C线处未显示红色条带，则该试纸条判定为无效。

通过以上方法可以方便快速地检测前哨淋巴裂解液中是否存在CK19，进而检测前哨淋巴是否发生肿瘤转移，操作简便快速、灵敏性高、特异性好，可作为现有术中前哨淋巴结快检方法的辅助方法，甚至是取代方法。

以上所述仅为本发明的几个实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于细胞角蛋白19（CK19）检测的胶体金层析试纸条，包括底板以及在底板上顺次搭接粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，其特征在于：所述结合垫为涂覆有CK19单克隆抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜,所述硝酸纤维膜上包被两条线，分别为：检测线T线，对应CK19的多克隆抗体；质控线C线，为与CK19单克隆抗体对应的二抗。

2.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述检测线T线包被的蛋白的浓度为0.1-3mg/mL，所述检测线T线包被的蛋白的包被参数为0.5-3μL/cm。

3.根据权利要求1或2所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述质控线C线包被的蛋白的浓度为0.5-5mg/mL，所述质控线C线包被的蛋白的包被参数为0.5-3μL/cm。

4.根据权利要求1－3任一项所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述检测线T线与质控线C线之间的距离为2-8mm。

5.根据权利要求1－4任一项所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述CK19单克隆抗体-胶体金结合物中胶体金可替换为修饰银、铜、铁、铂、钯、硒、碳、硼、镁、铝、钙、钛、钴、锰、钼、锌、镉或铬纳米材料中的任意一种或多种组合。

6.根据权利要求1－5任一项所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，还包括一卡壳，所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫置于卡壳内，所述卡壳上开有加样区和显色区两个窗口，加样区对准样品垫所在区域，显色区对准T线和C线所在区域。

7.一种如权利要求1－6任一项所述的胶体金层析试纸条在肿瘤转移检测中的应用。

8.一种用于细胞角蛋白19（CK19）检测的胶体金层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

（1）将CK19蛋白的单克隆抗体进行透析,透析完成后离心去除沉淀杂质；

（2）制备结合垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器用王水过夜浸泡，然后冲洗干净,将烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入10mL的1%的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1%的氯金酸溶液，煮沸15min后停止加热，待冷却后置于4度冰箱保存;颗粒直径大约为20~50nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入150μL0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7.0，搅拌均匀，然后加入离心好的单克隆抗体，搅拌20min左右，然后加入2mL10%的BSA溶液，离心，然后弃去上清液，再加入1%的BSA的溶液继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：150mM的NaCl，1%的BSA，0.5%的蔗糖，0.5%的酪蛋白钠，将其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后冻干，作为结合垫，室温避光保存备用；

（3）在PVC胶板上一端顺次相互搭接地贴附样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；

（4）通过三维平面划膜仪在硝酸纤维素膜上包被T线和C线，C线为CK19单克隆抗体对应的二抗，浓度为0.5-5mg/mL，包被参数为0.5-3μL/cm；T线为CK19的多克隆抗体，浓度为0.1-3mg/mL,包被参数为0.5-3μL/cm；

（5）将PVC胶板及贴附的材料切成4mm宽度的试纸条；

（6）将步骤（5）中的试纸条装入卡壳内，卡壳上开有显色区和加样孔，加样区对准样品垫位置，显色区对准T线和C线所在区域；

（7）将试纸条装在铝箔袋中，内装一个干燥剂和滴管，进行密封室温保存。