CN105555300A

CN105555300A - 用于治疗口炎性腹泻的组合物和方法

Info

Publication number: CN105555300A
Application number: CN201480050953.7A
Authority: CN
Inventors: J·B·西格尔; D·贝克; I·S·普尔兹
Original assignee: University of Washington Center for Commercialization
Current assignee: University of Washington Center for Commercialization
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2016-05-04
Also published as: US20160194621A1; WO2015023728A1; US10487318B1; JP6764555B2; AU2014306716A1; CA2918347A1; JP2016528253A; EP3033100B1; US20210246437A1; US20200123521A1; ES2702907T3; JP6517204B2; EP3033100A1; US11008558B2; US10266815B2; EP3520808A1; JP2019135252A; AU2014306716B2; EP4008340A1; US20240158774A1

Abstract

本发明提供了用于治疗口炎性腹泻的组合物和方法。

Description

用于治疗口炎性腹泻的组合物和方法

相关申请

本申请要求2013年8月14日提交的美国临时专利申请序列号61/865,787的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本申请中。

联邦资助声明

本发明是在国防高级研究计划局给予的HR0011-08-1-0085的政府支持下完成的，政府享有本发明的某些权益。

背景技术

口炎性腹泻(celiacsprue)是一种极常见的疾病，该病是在小麦、大麦、黑麦产品中发现的被称为“麸质”的食用蛋白质在遗传学上易感染个体的小肠中引起的免疫反应。由此导致的炎症会造成小肠绒毛的退化，阻碍营养物的吸收。其症状会在儿童早期或人生的后期出现，严重程度分布广泛，从腹泻、疲劳、体重减轻到腹胀、贫血及神经症状。目前对这种伴随终生的疾病尚没有有效的治疗方法，只能从饮食中完全排除麸质。尽管仍有很大一部分口炎性腹泻未被检测出来，但该病在美国和欧洲的患病率据估计占人口的0.5-1.0％。由于要在人类消化道的恶劣及强酸环境下特异性地、有效地降解麸质源性肽有着严苛的物理和化学要求，很难找到合适的自然产生的酶以口服疗法治疗口炎性腹泻。

发明内容

在一个方面，本发明提供了用于治疗口炎性腹泻的方法，包括给患有口炎性腹泻的患者施用有效量的用于治疗口炎性腹泻的一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包括选自由SEQIDNOS:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其经加工的版本(processedversion)组成的组中的多肽的氨基酸序列，或由选自由SEQIDNOS:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成。在一个实施例中，所述一种或多种多肽包括包含了选自由SEQIDNOs:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列的一种或多种多肽，或者由选自由SEQIDNOs:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成的一种或多种多肽。在进一步的实施例中，所述一种或多种多肽包括含有SEQIDNO:89的氨基酸序列的多肽。

在另一方面，本发明提供了分离的多肽，其选自由以下多肽或其经加工的版本组成的组：

(a)SEQIDNO：95，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基116是V或D；(ii)AA残基255是S、K或G；(iii)AA残基284是D；(iv)AA残基285是T；(v)AA残基286是A、T或N；(vi)AA残基312是S；(vii)AA残基347是N；(viii)AA残基350是T或A；(ix)AA残基351是N或G；(x)AA残基354是D；和(xi)AA残基361是S或H；

(b)SEQIDNO：75，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基106是D；(ii)AA残基246是S、K或G；(iii)AA残基275是D；(iv)AA残基276是S；(v)AA残基277是A、T或N；(vi)AA残基303是S；(vii)AA残基338是S；(viii)AA残基341是T或A；(ix)AA残基342是N或G；(x)AA残基345是Q或D；和(xi)AA残基352是S或H；

(c)SEQIDNO：76，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基120是D；(ii)AA残基259是S、K或G；(iii)AA残基288是D；(iv)AA残基289是T；(v)AA残基290是A、T或N；(vi)AA残基316是S；(vii)AA残基351是S或N；(viii)AA残基354是A；(ix)AA残基355是N或G；(x)AA残基358是D；和(xi)AA残基365是S或H；

(d)SEQIDNO：78；

(e)SEQIDNO：79，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基107是V或D；(ii)AA残基245是S、K或G；(iii)AA残基274是D；(iv)AA残基275是T；(v)AA残基276是A、T或N；(vi)AA残基302是S；(vii)AA残基337是S或N；(viii)AA残基340是T或A；(ix)AA残基341是N或G；(x)AA残基344是Q或D；和(xi)AA残基351是S或H；

(f)SEQIDNO：80，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基76是V或D；(ii)AA残基206是S、K或G；(iii)AA残基235是D；(iv)AA残基236是S；(v)AA残基237是A、T或N；(vi)AA残基262是S；(vii)AA残基297是S或N；(viii)AA残基300是T或A；(ix)AA残基301是N或G；(x)AA残基302是Q或D；和(xi)AA残基309是S或H；

(g)SEQIDNO：81，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基105是D；(ii)AA残基244是S或K；(iii)AA残基272是D；(iv)AA残基273是S；(v)AA残基274是A、T或N；(vi)AA残基299是S；(vii)AA残基334是N；(viii)AA残基337是T或A；(ix)AA残基338是N或G；(x)AA残基341是Q或D；和(xi)AA残基348是S或H；

(h)SEQIDNO：82，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基106是V或D；(ii)AA残基244是S、K或G；(iii)AA残基273是D；(iv)AA残基274是T；(v)AA残基275是A、T或N；(vi)AA残基301是S；(vii)AA残基336是N；(viii)AA残基339是T或A；(ix)AA残基340是N或G；(x)AA残基343是D；和(viii)AA残基350是S或H；

(i)SEQIDNO：83，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基107是V或D；(ii)AA残基245是S、K或G；(iii)AA残基274是D；(iv)AA残基275是T；(v)AA残基276是A、T或N；(vi)AA残基302是S；(vii)AA残基337是N；(viii)AA残基340是T或A；(ix)AA残基341是N或G；(x)AA残基344是Q或D；和(xi)AA残基351是S或H；

(j)SEQIDNO：84，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基104是V或D；(ii)AA残基241是S、K或G；(iii)AA残基270是D；(iv)AA残基271是S；(v)AA残基272是D、A、T或N；(vi)AA残基398是S；(vii)AA残基33是S；(viii)AA残基336是A；(ix)AA残基337是N或G；(x)AA残基340是D；和(xi)AA残基347是S或H；

(k)SEQIDNO：85，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基104是D；(ii)AA残基245是S、K或G；(iii)AA残基274是D；(iv)AA残基275是S；(v)AA残基276是A、T或N；(vi)AA残基302是S；(vii)AA残基337是S或N；(viii)AA残基340是T或A；(ix)AA残基341是N或G；(x)AA残基344是Q或D；和(xi)AA残基351是S或H；

(l)SEQIDNO：86，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基118是V或D；(ii)AA残基250是K或G；(iii)AA残基279是D；(iv)AA残基280是S；(v)AA残基281是A、T或N；(vi)AA残基307是S；(vii)AA残基342是S或N；(viii)AA残基345是A；(ix)AA残基346是N或G；(x)AA残基349是Q或D；和(xi)AA残基356是S或H；

(m)SEQIDNO：87，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基121是V或D；(ii)AA残基253是S、K或G；(iii)AA残基282是D；(iv)AA残基283是S；(v)AA残基284是A、T或N；(vi)AA残基310是S；(vii)AA残基345是S；(viii)AA残基348是T或A；(ix)AA残基349是N或G；(x)AA残基352是Q或D；和(xi)AA残基357是S或H；

(n)SEQIDNO：88，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或所有十个为真：(i)AA残基111是S、K或G；(ii)AA残基139是D；(iii)AA残基140是T或S；(iv)AA残基141是D、A、T或N；(v)AA残基164是S；(vi)AA残基199是S或N；(vii)AA残基202是T或A；(viii)AA残基203是N或G；(ix)AA残基204是Q或D；和(x)AA残基211是S或H；和

(o)SEQIDNO：89。

在其他方面，本方面提供了编码本发明的多肽的核酸，核酸表达载体包括本发明的分离的核酸，重组宿主细胞包括本发明的核酸表达载体。

在又一方面，本发明提供了组合物，包括：

(a)一种或多种多肽，包括选自由SEQIDNOs:74-89、95、97-99和102-111或它们经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列；和

(b)一种或多种其他多肽，包括选自由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：

(A)与SEQIDNO:35的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列，其中：

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基278是Ser，残基78是Glu，残基82是Asp；

(B)与SEQIDNO:1的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列，其中：

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基467是Ser，残基267是Glu，残基271是Asp。

在又一方面，本发明提供了药物组合物，包括本发明的分离的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞或组合物，与药学上可接受的载体。

附图说明

图1是示出了各种多肽切断结合了荧光基团和淬灭基团的麦醇溶蛋白的荧光类似物的活性的图表。X-轴：特异性同源物数目。KWT＝Kumamolisin-As。Y-轴：任意的酶单位。

图2是示出了在不同的pH水平下多肽切断麦醇溶蛋白的荧光类似物的活性的图表。SCPEP：源自荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonascapsulata)的脯氨酰内肽酶。WT：Kumamolisin-As。Max：KumaMax^TM。蓝条代表在所示pH水平下最佳的蛋白酶活性。

图3是示出了不同的多肽切断作为麸质降解产物的两种肽的活性的图表。X-轴是以分钟计的时间，Y-轴是残余肽片段。Max＝KumaMax^TM；K3＝Kumamolisin-As活性位点突变株；H4M＝同源物4(SEQIDNO：75)KumaMax^TM-突变株；33＝33mer肽(SEQIDNO：72)；26＝26mer肽(SEQIDNO：73)。

图4是示出了不同的其他多肽切断麸质的33mer肽降解产物(SEQIDNO:72)的活性的图表。

详细说明

所有引用的参考文献的全部内容通过引用并入本申请中。在本申请中，除非另有说明，采用的技术能够在任意公知的参考文献中找到，比如：MolecularCloning(分子克隆)：ALaboratoryManual(Sambrook,etal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress),GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology,Vol.185,editedbyD.Goeddel,1991.AcademicPress,SanDiego,CA),“GuidetoProteinPurification”inMethodsinEnzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)AcademicPress,Inc.)；PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis,etal.1990.AcademicPress,SanDiego,CA),CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,2^ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,NY),GeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton,N.J.)，以及theAmbion1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。

除非本申请另有明确地说明，本申请中使用的单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代。本申请中使用的“和”能够也“或”互换使用，除非另有明确地说明。

本申请中使用的氨基酸残基采用如下缩写：丙氨酸(Ala；A)，天冬酰胺(Asn；N)，天冬氨酸(Asp；D)，精氨酸(Arg；R)，半胱氨酸(Cys；C)，谷氨酸(Glu；E)，谷氨酰胺(Gln；Q)，甘氨酸(Gly；G)，组氨酸(His；H)，异亮氨酸(Ile；I)，亮氨酸(Leu；L)，赖氨酸(Lys；K)，蛋氨酸(Met；M)，苯基丙氨酸(Phe；F)，脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)，苏氨酸(Thr；T)，色氨酸(Trp；W)，酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

本发明任意方面的所有实施例能够结合使用，除非本申请另有明确地说明。

在第一方面，本发明提供了用于治疗口炎性腹泻的方法，包括给患有口炎性腹泻的患者施用有效量的用于治疗口炎性腹泻的一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包括选自由下述组或其经加工的版本组成的组中多肽的氨基酸序列，或由选自由下述组或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成。

同源物1

MAPSDVEIVDPVAPEERITVTVLLRRRSSIPDQLIEGPDTLSRAELADRHGADPADVEAVRVAMSGAGLTVVGTDLPSRRVTVAGTAEALMRTFGAELQIVRDASGFQHRARSGELRIPAALDGIVIAVLGLDNRPQAEARFRASQPEAARSFRPDALGRVYRFPANTDGTGQTIAIVELGGGFRQSELDTYFGGLGIPAPQVLAVGVDGGQNLPSGDAGSADGEVLLDIEVAGALAPGARQVVYFAPNTDRGFVDAVTTAVHADPTPAAVSISWGAPEDKWTAQARRAFDAALADAAALGVTVTAAAGDRGSADGEGGGGLHTDFPASSPHLLACGGTKLAVADGGTVASETVWNGGERGGATGGGVSVAFGLPAYQRNAGVDKRRKTGKPGRGVPDVAAVADPATGYEVLVDGEQLVFGGTSAVAPLWAALVARLTQALGRPLGLLNTALYDGAQPGRTQPGFRDVTEGDNDISGKHGPYPARAGWDACTGLGVPDGEALLAALRKPGKE(SEQIDNO:74)；

同源物2

MQRGTKEGLNMARHLQADREPRIVPESKCLGQCDPAERIHVTIMLRRQEEGQLDALVHQLATGDARAKPVSRDAFAQRFSANPDDIRKTEDFAHRHQLTVDRVDPVESVVVLSGT(I/V/D)AQFEAAFSVKLERFEHRSIGQYRGRSGPIVLPDDIGDAVTAVLGLDSRPQARPHFRFRPPFKPARGAAAVTFTPIQLASLYDFPAGDGAGQCIAIIELGGGYRAADIQQYFRGLGITTPPKLVDVNVGTGRNAPTGEP(N/S/K/G)GPDGEVALDIEIAGAIAPAAKIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIQAVNAAVTDKTNQPSVISISW(G/S)GPEAIWQAQSAQAFNRVLQAAAAQGITVCAASGD(S/N)GS(G/T/A)(D/N/G)GL(Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYVLGCGGTQLDALPGQGIRSEVTWNDEASGGGAGGGGVSALFDLPAWQQGLKVARADGTTTPLAKRGVPDVAGDASPQTGYEVSVAGTPAVMGGTSAVAPLWAALIARINAANGASAGWINPVLYKHPGALRDITKGSNGTYAAASGWDACTGLGSPNGAQLATILARKPSS(SEQIDNO:95)；

同源物4

MANHPLNGSERECLKDAQPIGKADPNERLEVTMLVRRRSHDAFEKHISALAAQGASAKHIDHDEFTKHFGADSADLAAVHAFAQKHGLSVVESHEARRAVVLSGT(V/D)AQFDAAFGVSLQQYEHDGGTYRGRTGPIHLPDELNGVVDAVMGLDNRPQARPSFRTRAQGNVRWTARAAGASTFTPVQLASLYDFPQGDGQNQCIGIIELGGGYRPADLKTYFASLNMKAPSVTAVSVDHGRNHPTGDP(N/S/K/G)GPDGEVMLDIEVAGAVAPGAKIVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)AGFIDAIGTAIHDTKNKPSVISISW(G/S)GPESAWTQQAMNAFDQAFQSAAALGVTICAASGD(N/S)GS(G/T/A)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYALGCGGTSLQASGNGIASETVWNDGANGGATGGGVSSFFALPAWQEGLRVTRAGGAHSPLAMRGVPDVAGNADPVTGYEVRVDGHDMVIGGTSAVAPLWAGLIARINAIKGAPVGYINPHLYKDPLALVDITKGNNDDFHATAGWDACTGLGRPDGKKVKDAVS(SEQIDNO:75)；

同源物5

MNHDHSPTGGELSNWVRVPGSERAAVQGSRKVGPADPNEQMSVTVVVRRPAADTAVTSMIEKVGAQPLSERRHLTREEFASTHGANPADLSKVEKFAHEHNLQVKEVNAAAGTMVLSGT(V/D)TSFSKAFGVELSTYEHPDFTYRGRIGHVHIPDYLADTIQSVLGLDNRPQASPRFRVLKEEGGVTTAHAGRTSYTPLEVAALYNFPSIHCKDQCIGILELGGGYRPADLQTYFNGLGIPQPNITDVSVGGAANRPTGDP(N/S/K/G)GPDGEVVLDIEVAAAVTPGAKIAVYFAD(N/D)(S/T)(D/A/T/N)DGFLNAITTAIHDTRNKPSVISISW(G/S)KAEIGWTPQAINAMNQAFRDAAALGVTICCASGD(D/S/N)GS(T/A)(D//N/G)RV(Q/D)DGRYHV(D/S/H)FPASSPYVLACGGTRLESSGSTITQEVVWNEGALGGGATGGGVSDVFDRPNWQANANVPTSANPERRIGRGVPDWAGNADPATGYQILVDGTRAVIGGTSAVAPLFAGLIAIINQKLGHSVGFINPILYNLSAQHNVFHDITSGNNDMSGQNGPYEAQPGWDACTGLGSPDGTKLMNAISEAHRLVSVG(SEQIDNO:76)；

同源物6

MAPEERRTLPGSAMPRPAGAQVLGQIPDDERVEVTVVLQPRAPLPEPGPTPMSRAELADLRSPPEGALEAIARYVAGQGLEVIAADAPRRRIVLAGSAARIAALFGISFVRLQLEGRRYRTYEGEISLPAELAPLVVAVLGLDTRPFARSHRRPAVAPNAPTTAPTVARAYDFPTAYDGRGTTIGFIELGGGFQESDLVRYCEGLGLSTPQVSVVGVDGARNAPTGDPNGPDAEVMLDLEVATGVANGADLVLYMAANTDAAFYSAIATALRDATHAPVAISISWGAPEESYPATTIAAFESVLEEAVHVGVTVLVAAGDQGSTDGVDDGRAHVDYPAASPYVLACGGTRLDLDGTTIVAETVWNDLPNGGATGGGISALFPVPSWQAGIAMPPSANPGAGPGRGVPDVAGNADPDTGYRIVVDGVATVVGGTSAVAPLWAGLVARCHQAGARGGFWNPLLYAARGSSAFHEITVGSNGAYDAGPIWNACCGLGSPNGTAILQTLRA(SEQIDNO:77)；

同源物6突变株

MAPEERRTLPGSAMPRPAGAQVLGQIPDDERVEVTVVLQPRAPLPEPGPTPMSRAELADLRSPPEGALEAIARYVAGQGLEVIAADAPRRRIVLAGSAARIAALFGISFVRLQLEGRRYRTYEGEISLPAELAPLVVAVLGLDTRPFARSHRRPAVAPNAPTTAPTVARAYDFPTAYDGRGTTIGFIELGGGFQESDLVRYCEGLGLSTPQVSVVGVDGARNAPTGDPNGPDAEVMLDLEVATGVANGADLVLYMAANTDAAFYSAIATALRDATHAPVAISISWSAPEESYPATTIAAFESVLEEAVHVGVTVLVAAGDQGSTGGVDDGRAHVHYPAASPYVLACGGTRLDLDGTTIVAETVWNDLPNGGATGGGISALFPVPSWQAGIAMPPSANPGAGPGRGVPDVAGNADPDTGYRIVVDGVATVVGGTSAVAPLWAGLVARCHQAGARGGFWNPLLYAARGSSAFHEITVGSNGAYDAGPIWNACCGLGSPNGTAILQTLRA(SEQIDNO:78)；

同源物9

MTKQPVSGSSDKIHPDDAKCIGDCDPSEQIEVIVMLRRKDEAGFRQMMSRIDAGEAPGQAVSREEFDRRFTASDEDIDKVKAFAKQYGLSVERAETETRSVVLKGT(I/V/D)EQFQKAFDVKLERFQHHNIGEYRGRTGPVNVPDEMHDAVTAVLGLDSKPQARPHFRFRPPFKPLRGAAPASFSPVDLAKLYDFPDGDGAGQCIAIIELGGGYRDSDLSAYFSKLGVKAPTVVPVGVDGGKNAPTGNP(N/S/K/G)GPDGEVTLDIEIAGAIAPGARIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFVDAVNRALHDAANKPSVISISW(G/S)GPESNWSPQSMSAFNDVLQSAAALGVTVCAASGD(G/S/N)GS(A/T)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYVLGCGGTSLAASGAGIAKEVVWNDGDQGGAGGGGVSGTFALPVWQKGLSVTRNGKHIALAKRGVPDVAGDASPQTGYEVLIDGEDTVVGGTSAVAPLWAALIARINAIDASPAGFVNPKLYKAKTAFRDITEGNNGSFSAAAGWDACTGMGSPDGGKIAAALKPAKPSQSAGQQ(SEQIDNO:79)；

同源物10

MGRLQGSYRPSLGTPVGPVPDDQPIDVTVVLRPTAADDFRADPDDVAAVRAFAGRAGLDVAEVDEPARTVRLRGP(A/V/D)AAARTAFDTPLALYDSGGRAIRGREGDLGLPDELDDRVVAVLGLDERPAARPRFQPAASARQGLTALQVARAYDFPAATGEGQTIAIIELGGGFGQADLDTYFGGLDLPTPAVSAVGVQGAANVPGGDP(/S/K/G)DGADGEVLLDIEVAGAVAPGAAQVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)AGFLAAINAAAAATPRPAAISISWG(G/S)PESSWTAQAMRAYDQAFAAARAAGITVLAAAGD(A/S/N)GA(D/T/A)(D/S/N/G)(A/Q/D)TDRLVA(D/S/H)FPAGSPNVIACGGTKLTLDAAGARASEVVWNEAADSATGGGYSATFTRPAWQPAAVGRYRGLPDISGNADPQTGYRVVVDGQPTVVGGTSAVAPLLAGLVARLAQLTGAPVADLAAVAYANPAAFTDITAGDNQGYPARSGWDPASGLGSPVGTKLLTAVGGPTPPPTTPPPTTPPPTTPPPTIPPPTTPPTQTVDAADRALWSAVATWAGGTHTGANARAAKAVRAWAQAKSLA(SEQIDNO:80)；

同源物12

MTQPRYTPLPGSEREAPLLAARSNATAARASRAQTASATVVLRRRSELPEALVLDQQFISSDELAARYGADPVDIEKVRSVLERFKVSVVEVDAASRRVKVEGA(V/D)ADIERAFNIALHSASGTDPHSGRGFEYRYRTGVLSVPAELGGIVTAVLGLDNRRQAETRLRVVPAAALGSSYTPVQLGEIYNFPQDATGAGQRIAIIELGGGYTPAGLRRYFASLGVVPPKVAAVSVDGAQNAPGPDP(G/S/K/G)ADGEVQLDVEVAGALAPGAHVLVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFLDAVSQAAHATPPPTAISISW(G/S)ASEDSWTASARDALNQALRDAAALGVTVTAAAGD(S/N)GS(S/T/A)(D/N/G)GV(P/Q/D)DRRAHV(D/S/H)FPASSPYVLATGGTSLRADPATGVVQSETVWNDSQGSTGGGVSDVFPRPAWQAHVDVPHAGRGVPDVSAVADPATGYQVLVDNQPAVIGGTSAVAPLWAALVARLAESLGRPLGLLQPLVYPRTPGSTAYPGFRDITIGNNGAYKAGKGWDAATGLGVPDGTELLAHLRGLNGSE(SEQIDNO:81)；

同源物13

MARHLHAGSEPKVITESKCIGACDPAERIHVTVMLRREGEQALDALVDKLASGDPAAKPVSREDFAKRFGARADDIQHTEAFAKRHQLTVERVDPVQSVVELAGT(I/V/D)AQFENAFGVKLEKYEHHAIGSFRARTGAIALPDELHDAVTAVLGLDTRPQAHPHFRFRPPFQPARSGAGTSYTPLQLASIYNFPEGDGAGQCIALVELGGGYRAADIRQYFEQLGVKPPKLVDVSVNGGRNAPTDDP(N/S/K/G)GPDGEVALDIEVAGAIAPGATIAVYFAG(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIQSVNQAIHDSTNRPSVVSISW(G/S)GPEASWTQQSITAFNNVLKTAASLGVTVCAASGD(S//N)GS(S/T/A)(D/N/G)GL(Q/D)DGSNHV(D/S/H)FPASSPYVLACGGTTLDAQAGQGIRREVVWNDEAASGGAGGGGVSAVFPAPSYQKGLSAKATGGGSTPLSQRGVPDVAGDASPTTGYIISIAGTTAVLGGTSAVAPLWAALIARINANGKSPVGWANPKLYAQPGAFHDITQGNNGAFAASEGWDACTGLGSPDGAKVAAALQGASGGSQQGRATGA(SEQIDNO:82)；

同源物14

MTKHPLPGSERVLAPGSKVVAQCDPSETIEVVVVLRRKNEQQFAQMMKTIEAGAAGARPLTREELEQRFGALPEDIAKLKAFAAQHGLSVVREDASARTVVLSGR(I/V/D)EQFQQAFDVQLQHYEHQSMGRFRGRTGAISVPDELHGVVTAVLGLDDRPQARPHFRIRPPFQPARAQSASSFTPLQLASLYRFPQGDGSGQCIGIVELGGGYRTADLDSYFSSLGVGSPKVVAVGVDQSGNQPTGDP(N/S/K/G)GPDGEVTLDIEIAGALAPAATIAVYFTT(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIDAVSQAVHDRTNQPSVISISW(G/S)APESMWTAQSMKALNDVLQSAAAIGVTVCAASGD(S/N)GS(S/T/A)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGRDHV(D/S/H)FPASSPYVLACGGTSLQGSGRTVAHEVVWNDGSNGGATGGGVSGAFPVPAWQEGLSTSAAQGGQRALTGRGVPDVAGDASPLTGYDVIVDGNNTVIGGTSAVAPLWAALIARINGAKGAPVGFVNPKLYKASACNDITQGNNGSYAATTGWDACTGLGSPDGVKVAAAL(SEQIDNO:83)；

同源物15

MSPIASRRSALPLSERPAPENARALAAVEPDRTMTVSVLVRRKKPLVLADLEGKKLTHREFERRYGASEKDFATIAKFAAGHGLAVDHHASSLARRTVVLRGT(A/V/D)RQMQQAFGVTLHDYEDSETQQRYHSFTGAITVPAAHARIIESVLGLDARPIAKPHFRVRKRSAAATGAVSFNPPQVASLYSFPTGVDGSGETIGILELGGGYETSDIQQYFSGLGIQPPTVVAVSVDGAVNAPGNP(N/S/K/G)GADGEVALDIQVAGSIAPGAKLAVYFAP(N/D)(T/S)(E/D/A/T/N)QGFVDAITTAVHDTANKPSVLSISW(G/S)GPESSWPQAAAQSLNNACESAAALGVTITVASGD(N/S)GS(T/A)(D/N/G)GV(Q/D)DGQNHV(D/S/H)FPASSPYVLACGGTYLAAVNNGVPQESVWDDLASGGGATGGGVSALFPLPAWQTGANVPGGSMRGVPDVAGDASPESGYNVLVDGQPQVVGGTSAVAPLWAALIALVNQQKGEAAGFVNAALYQNPSAFHDITQGSNGAYAAAPGWDPCTGLGSPMGTAIAKILA(SEQIDNO:84)；

同源物16

MSAFDQLVPLPGSEKTVPDAAPSQTLDPNEVLTVTIRIRRKRTLASLVSTTAPVTEVVSRSEYASRFGADPAIVKQVEAFASAYDLSLVEQSLARRSVLLRGT(V/D)AQMEQAFGVSLANYQLADGTVFRGRTGVVNVPSELVEHIEGVFGLDNRPQARAHFQVYKPEKGTKVAPRAGGISYTPPQLARLYNFPTGVTGKGQCIAIIELGGGFRTADIKTYFGGLGLKPPTVVAVSVDGGHNAPSTA(D/S/K/G)SADGEVMLDIDVAGGVAPGAKIVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFLDAITTAMHDTKNKPSVISISW(G/S)AAESNWTPQALTSFNQAFQAAAALGITVCAAAGD(T/S/N)GS(D/T/A)(D/N/G)SV(G/Q/D)DGKAHV(D/S/H)FPASSPFVLACGGTKLTATDNVIASEVVWHESKTSATGGGVSDVFDLPDYQQKSHVPPSVNDKTRIGRGVPDVAAVADPVTGYAVRVDGSNLVFGGTSAVAPLMAGLIALINQQRGKAVGFIHPLIYANPSAFRDITQGNNTTTTGNKGYAATTGWDACTGLGVADGKKLASVLTATPVA(SEQIDNO:85)；

同源物17

MAATPRFASQPRVTLPGSQKHPLTTDTEVPPPAPVKAAATKLSATPFTVTVIVKRKNPLNLKQVLKPAGRLTHAAFAKAHGPSPDGVKLVKAFAKEFGLTVAPAPGQGRRALYLTGT(A/V/D)AAMQTAFGVTFATKIMEGTKYRVREGDICLPKELIGHVDAVLGLDNRPQAKPHFRHHKPAATSVSYTPVQVGQLYGFPSGAKATGQTIGLIELGGGFRAADITAYFKTLGQTAPKVTAVLVDKAKNTPTTS(S/K/G)SADGEVMLDIEVAAAVAPGANIAVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFIDAISQAVHDTVNKPSVISISW(G/S)GPESTWTAQSLAALDAACQSAAALGITITVAAGD(D/S/N)GS(T/A)(D/N/G)GV(K/Q/D)GTVNHV(D/S/H)FPASSPHVLGCGGTKLLGSGTTITSEVVWNELTANEGATGGGVSNVFPLPTWQAKSNVPKPTVAAGGRGVPDVSGNADPSTGYTVRVDGSTFPIGGTSAVAPLWAGLIALCNAQNKTTAGFINPALYAAAAAKSFRDITSGNNGGFKAGPGWDACTGLGSPIGTAIAKTLAPATKSTSKTAVKNAPEIRFRPHKKAPTKTAAKTPALRRLK(SEQIDNO:86)；

同源物19

MPTSSRFASQSRVPLPGSERKPFVPAGAPKAAKTPKVSTAVKTVPATGRIRVSLIVPPKQPLDTKRLGKLDARLSRAQFAARHGADPASVRLVKAFAKEFGLTVEPITQPGRCTVQLSGT(C/V/D)AAMRKAFAISLVEHTTEQGKFRLREGEISLPAELEGHVLAVLGLDNRPQAKPHFRIAKPRATNVSYTPVQVAQMYGFPAGATATGQTIGIIELGGGYRAADLTAYFKTLGLPAPTVTAVPIDGGKNTPGNA(N/S/K/G)GADGEVMLDIEVCAAVAQGAKIAVYFTT(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFIDAITTAVHDSTNKPSVISISW(G//S)GPESSWTEQSMTALDAACQAAAAVGVTITVAAGD(N/S)GS(S/T/S)(D/N/G)GA(S/Q/D)GDNV(D/S/H)FPASSPHVLACGGTKLVGSGSTITSEVVWDETSNDEGATGGGVSTVFALPTWQKNANVPSPTTSAGGRGVPDVSGDADPSTGYTIRVDSETTVIGGTSAVAPLWAGLIALANAQNKVAAGFVNPALYAAGAKKAFRDITQGNNGSFSAGPGWDACTGLGSPVGNLVIQAVAPKSTTTKKAKKGKTK(SEQIDNO:87)；和

同源物26

MHSYLKQQSHMQSYLEQENHMRSYLEMRKKPYFDDLANIRPGGLTPAQVCQAYQFAKVQPVRPVKLGIVSLAGQYLSSDMSKAFTGYGLPTPVVSTAGSQVLGDLWSNVE(N/S/K/G)MMDIEIAGAAWAYATGTAATLLMQFEP(N/D)(N/T/S)(E/D/A/T/N)TGIPNAINALVAAGCEVISISW(G/S)APANLQTMEAITARKEACKQAAVQNVHVFAASGD(E/S/N)SL(N/T/A)(D/N/G)(G/Q/D)TNSRTP(D/S/H)DPCCDPNVWGVGGTRLVLQADGSIAQESAWGDGNAADKGGGGGFDSREPLPDYQVGVVHSEHRGSPDSSANADPGTGYAIVANGQWLIGGGTSASAPLTAGYVAAILSTLPGPISQSVLQRKLYTAHKTAFRDILLGSNGAPARPGWEEATGLGSINGPGLAAALQS(SEQIDNO:88)。

本申请中公开的多肽是在以“麦醇溶蛋白”而知名的富含羟脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)组分的麸质中的Kumamolisin同源物多肽和其修饰版本，所述修饰版本经鉴定具有与Kumamolisin-As类似的、改进的或互补的活性，所述“麦醇溶蛋白”被认为是造成绝大部分口炎性腹泻患者的大部分免疫反应的元凶。发明人测试的很多其他Kumamolisin同源物的这种麦醇溶蛋白水解活性很小或没有。因此，本申请中公开的多肽能够用于治疗口炎性腹泻。本申请中公开的氨基酸序列是针对所述多肽的预加工版本(preprocessedversion)，其可以以经加工的形式(processedform)水解它们的底物。因此，本申请也涵盖了使用所述多肽的经加工的版本。本领域的那些技术人员应当理解，一种细胞类型或一组条件与另一种细胞类型或另一组条件之间所述多肽的具体加工处理是不同的。在一个实施例中，所述同源物的经加工的形式没有下述表1中示出的残基，其为本申请公开的以预加工形式而不是经加工的形式存在的Kummamolisin和各同源物的残基的对照。

表1：

在一个实施例中，一种或多种多肽选自由以下同源物或其经加工的版本组成的组。

同源物1(NCBIYP_005536585)

同源物2(NCBIZP_04943175)

MQRGTKEGLNMARHLQADREPRIVPESKCLGQCDPAERIHVTIMLRRQEEGQLDALVHQLATGDARAKPVSRDAFAQRFSANPDDIRKTEDFAHRHQLTVDRVDPVESVVVLSGTIAQFEAAFSVKLERFEHRSIGQYRGRSGPIVLPDDIGDAVTAVLGLDSRPQARPHFRFRPPFKPARGAAAVTFTPIQLASLYDFPAGDGAGQCIAIIELGGGYRAADIQQYFRGLGITTPPKLVDVNVGTGRNAPTGEPNGPDGEVALDIEIAGAIAPAAKIAVYFAPNSDAGFIQAVNAAVTDKTNQPSVISISWGGPEAIWQAQSAQAFNRVLQAAAAQGITVCAASGDSGSGDGLQDGADHVDFPASSPYVLGCGGTQLDALPGQGIRSEVTWNDEASGGGAGGGGVSALFDLPAWQQGLKVARADGTTTPLAKRGVPDVAGDASPQTGYEVSVAGTPAVMGGTSAVAPLWAALIARINAANGASAGWINPVLYKHPGALRDITKGSNGTYAAASGWDACTGLGSPNGAQLATILARKPSS(SEQIDNO:97)；

同源物4(NCBIZP_10028298)

MANHPLNGSERECLKDAQPIGKADPNERLEVTMLVRRRSHDAFEKHISALAAQGASAKHIDHDEFTKHFGADSADLAAVHAFAQKHGLSVVESHEARRAVVLSGTVAQFDAAFGVSLQQYEHDGGTYRGRTGPIHLPDELNGVVDAVMGLDNRPQARPSFRTRAQGNVRWTARAAGASTFTPVQLASLYDFPQGDGQNQCIGIIELGGGYRPADLKTYFASLNMKAPSVTAVSVDHGRNHPTGDPNGPDGEVMLDIEVAGAVAPGAKIVVYFAPNTDAGFIDAIGTAIHDTKNKPSVISISWGGPESAWTQQAMNAFDQAFQSAAALGVTICAASGDNGSGDGVGDGADHVDFPASSPYALGCGGTSLQASGNGIASETVWNDGANGGATGGGVSSFFALPAWQEGLRVTRAGGAHSPLAMRGVPDVAGNADPVTGYEVRVDGHDMVIGGTSAVAPLWAGLIARINAIKGAPVGYINPHLYKDPLALVDITKGNNDDFHATAGWDACTGLGRPDGKKVKDAVS(SEQIDNO:98)；

同源物5(NCBIZP_09078202)

AGRTSYTPLEVAALYNFPSIHCKDQCIGILELGGGYRPADLQTYFNGLGIPQPNITDVSVGGAANRPTGDPNGPDGEVVLDIEVAAAVTPGAKIAVYFADNSDDGFLNAITTAIHDTRNKPSVISISWGKAEIGWTPQAINAMNQAFRDAAALGVTICCASGDDGSTDRVQDGRYHVDFPASSPYVLACGGTRLESSGSTITQEVVWNEGALGGGATGGGVSDVFDRPNWQANANVPTSANPERRIGRGVPDWAGNADPATGYQILVDGTRAVIGGTSAVAPLFAGLIAIINQKLGHSVGFINPILYNLSAQHNVFHDITSGNNDMSGQNGPYEAQPGWDACTGLGSPDGTKLMNAISEAHRLVSVG(SEQIDNO:99)；

同源物6(NCBIYP_003109679)

同源物#6突变株：

同源物9(NCBIYP_005042475)

MTKQPVSGSSDKIHPDDAKCIGDCDPSEQIEVIVMLRRKDEAGFRQMMSRIDAGEAPGQAVSREEFDRRFTASDEDIDKVKAFAKQYGLSVERAETETRSVVLKGTIEQFQKAFDVKLERFQHHNIGEYRGRTGPVNVPDEMHDAVTAVLGLDSKPQARPHFRFRPPFKPLRGAAPASFSPVDLAKLYDFPDGDGAGQCIAIIELGGGYRDSDLSAYFSKLGVKAPTVVPVGVDGGKNAPTGNPNGPDGEVTLDIEIAGAIAPGARIAVYFAPNSDAGFVDAVNRALHDAANKPSVISISWGGPESNWSPQSMSAFNDVLQSAAALGVTVCAASGDGGSADGVGDGADHVDFPASSPYVLGCGGTSLAASGAGIAKEVVWNDGDQGGAGGGGVSGTFALPVWQKGLSVTRNGKHIALAKRGVPDVAGDASPQTGYEVLIDGEDTVVGGTSAVAPLWAALIARINAIDASPAGFVNPKLYKAKTAFRDITEGNNGSFSAAAGWDACTGMGSPDGGKIAAALKPAKPSQSAGQQ(SEQIDNO:102)；

同源物10(NCBIYP_711059)

MGRLQGSYRPSLGTPVGPVPDDQPIDVTVVLRPTAADDFRADPDDVAAVRAFAGRAGLDVAEVDEPARTVRLRGPAAAARTAFDTPLALYDSGGRAIRGREGDLGLPDELDDRVVAVLGLDERPAARPRFQPAASARQGLTALQVARAYDFPAATGEGQTIAIIELGGGFGQADLDTYFGGLDLPTPAVSAVGVQGAANVPGGDPDGADGEVLLDIEVAGAVAPGAAQVVYFAPNTDAGFLAAINAAAAATPRPAAISISWGGPESSWTAQAMRAYDQAFAAARAAGITVLAAAGDAGADDATDRLVADFPAGSPNVIACGGTKLTLDAAGARASEVVWNEAADSATGGGYSATFTRPAWQPAAVGRYRGLPDISGNADPQTGYRVVVDGQPTVVGGTSAVAPLLAGLVARLAQLTGAPVADLAAVAYANPAAFTDITAGDNQGYPARSGWDPASGLGSPVGTKLLTAVGGPTPPPTTPPPTTPPPTTPPPTIPPPTTPPTQTVDAADRALWSAVATWAGGTHTGANARAAKAVRAWAQAKSLA(SEQIDNO:103)；

同源物12(NCBIYP_003658449)

MTQPRYTPLPGSEREAPLLAARSNATAARASRAQTASATVVLRRRSELPEALVLDQQFISSDELAARYGADPVDIEKVRSVLERFKVSVVEVDAASRRVKVEGAVADIERAFNIALHSASGTDPHSGRGFEYRYRTGVLSVPAELGGIVTAVLGLDNRRQAETRLRVVPAAALGSSYTPVQLGEIYNFPQDATGAGQRIAIIELGGGYTPAGLRRYFASLGVVPPKVAAVSVDGAQNAPGPDPGADGEVQLDVEVAGALAPGAHVLVYFAPNTDQGFLDAVSQAAHATPPPTAISISWGASEDSWTASARDALNQALRDAAALGVTVTAAAGDSGSSDGVPDRRAHVDFPASSPYVLATGGTSLRADPATGVVQSETVWNDSQGSTGGGVSDVFPRPAWQAHVDVPHAGRGVPDVSAVADPATGYQVLVDNQPAVIGGTSAVAPLWAALVARLAESLGRPLGLLQPLVYPRTPGSTAYPGFRDITIGNNGAYKAGKGWDAATGLGVPDGTELLAHLRGLNGSE(SEQIDNO:104)；

同源物13(NCBIYP_004348568)

MARHLHAGSEPKVITESKCIGACDPAERIHVTVMLRREGEQALDALVDKLASGDPAAKPVSREDFAKRFGARADDIQHTEAFAKRHQLTVERVDPVQSVVELAGTIAQFENAFGVKLEKYEHHAIGSFRARTGAIALPDELHDAVTAVLGLDTRPQAHPHFRFRPPFQPARSGAGTSYTPLQLASIYNFPEGDGAGQCIALVELGGGYRAADIRQYFEQLGVKPPKLVDVSVNGGRNAPTDDPNGPDGEVALDIEVAGAIAPGATIAVYFAGNSDAGFIQSVNQAIHDSTNRPSVVSISWGGPEASWTQQSITAFNNVLKTAASLGVTVCAASGDSGSSDGLQDGSNHVDFPASSPYVLACGGTTLDAQAGQGIRREVVWNDEAASGGAGGGGVSAVFPAPSYQKGLSAKATGGGSTPLSQRGVPDVAGDASPTTGYIISIAGTTAVLGGTSAVAPLWAALIARINANGKSPVGWANPKLYAQPGAFHDITQGNNGAFAASEGWDACTGLGSPDGAKVAAALQGASGGSQQGRATGA(SEQIDNO:105)；

同源物14(NCBIYP_001861188)

HMTKHPLPGSERVLAPGSKVVAQCDPSETIEVVVVLRRKNEQQFAQMMKTIEAGAAGARPLTREELEQRFGALPEDIAKLKAFAAQHGLSVVREDASARTVVLSGRIEQFQQAFDVQLQHYEHQSMGRFRGRTGAISVPDELHGVVTAVLGLDDRPQARPHFRIRPPFQPARAQSASSFTPLQLASLYRFPQGDGSGQCIGIVELGGGYRTADLDSYFSSLGVGSPKVVAVGVDQSGNQPTGDPNGPDGEVTLDIEIAGALAPAATIAVYFTTNSDAGFIDAVSQAVHDRTNQPSVISISWGAPESMWTAQSMKALNDVLQSAAAIGVTVCAASGDSGSSDGVGDGRDHVDFPASSPYVLACGGTSLQGSGRTVAHEVVWNDGSNGGATGGGVSGAFPVPAWQEGLSTSAAQGGQRALTGRGVPDVAGDASPLTGYDVIVDGNNTVIGGTSAVAPLWAALIARINGAKGAPVGFVNPKLYKASACNDITQGNNGSYAATTGWDACTGLGSPDGVKVAAAL(SEQIDNO:106)；

同源物15(NCBIYP_002754884)

MSPIASRRSALPLSERPAPENARALAAVEPDRTMTVSVLVRRKKPLVLADLEGKKLTHREFERRYGASEKDFATIAKFAAGHGLAVDHHASSLARRTVVLRGTARQMQQAFGVTLHDYEDSETQQRYHSFTGAITVPAAHARIIESVLGLDARPIAKPHFRVRKRSAAATGAVSFNPPQVASLYSFPTGVDGSGETIGILELGGGYETSDIQQYFSGLGIQPPTVVAVSVDGAVNAPGNPNGADGEVALDIQVAGSIAPGAKLAVYFAPNTEQGFVDAITTAVHDTANKPSVLSISWGGPESSWPQAAAQSLNNACESAAALGVTITVASGDNGSTDGVQDGQNHVDFPASSPYVLACGGTYLAAVNNGVPQESVWDDLASGGGATGGGVSALFPLPAWQTGANVPGGSMRGVPDVAGDASPESGYNVLVDGQPQVVGGTSAVAPLWAALIALVNQQKGEAAGFVNAALYQNPSAFHDITQGSNGAYAAAPGWDPCTGLGSPMGTAIAKILA(SEQIDNO:107)；

同源物16(NCBIYP_003387700)

MSAFDQLVPLPGSEKTVPDAAPSQTLDPNEVLTVTIRIRRKRTLASLVSTTAPVTEVVSRSEYASRFGADPAIVKQVEAFASAYDLSLVEQSLARRSVLLRGTVAQMEQAFGVSLANYQLADGTVFRGRTGVVNVPSELVEHIEGVFGLDNRPQARAHFQVYKPEKGTKVAPRAGGISYTPPQLARLYNFPTGVTGKGQCIAIIELGGGFRTADIKTYFGGLGLKPPTVVAVSVDGGHNAPSTADSADGEVMLDIDVAGGVAPGAKIVVYFAPNTDQGFLDAITTAMHDTKNKPSVISISWGAAESNWTPQALTSFNQAFQAAAALGITVCAAAGDTGSDDSVGDGKAHVDFPASSPFVLACGGTKLTATDNVIASEVVWHESKTSATGGGVSDVFDLPDYQQKSHVPPSVNDKTRIGRGVPDVAAVADPVTGYAVRVDGSNLVFGGTSAVAPLMAGLIALINQQRGKAVGFIHPLIYANPSAFRDITQGNNTTTTGNKGYAATTGWDACTGLGVADGKKLASVLTATPVA(SEQIDNO:108)；

同源物17(NCBIYP_004216463)

MAATPRFASQPRVTLPGSQKHPLTTDTEVPPPAPVKAAATKLSATPFTVTVIVKRKNPLNLKQVLKPAGRLTHAAFAKAHGPSPDGVKLVKAFAKEFGLTVAPAPGQGRRALYLTGTAAAMQTAFGVTFATKIMEGTKYRVREGDICLPKELIGHVDAVLGLDNRPQAKPHFRHHKPAATSVSYTPVQVGQLYGFPSGAKATGQTIGLIELGGGFRAADITAYFKTLGQTAPKVTAVLVDKAKNTPTTSSSADGEVMLDIEVAAAVAPGANIAVYFAPNTDQGFIDAISQAVHDTVNKPSVISISWGGPESTWTAQSLAALDAACQSAAALGITITVAAGDDGSTDGVKGTVNHVDFPASSPHVLGCGGTKLLGSGTTITSEVVWNELTANEGATGGGVSNVFPLPTWQAKSNVPKPTVAAGGRGVPDVSGNADPSTGYTVRVDGSTFPIGGTSAVAPLWAGLIALCNAQNKTTAGFINPALYAAAAAKSFRDITSGNNGGFKAGPGWDACTGLGSPIGTAIAKTLAPATKSTSKTAVKNAPEIRFRPHKKAPTKTAAKTPALRRLK(SEQIDNO:109)；

同源物19(NCBIYP_005056054)

MPTSSRFASQSRVPLPGSERKPFVPAGAPKAAKTPKVSTAVKTVPATGRIRVSLIVPPKQPLDTKRLGKLDARLSRAQFAARHGADPASVRLVKAFAKEFGLTVEPITQPGRCTVQLSGTCAAMRKAFAISLVEHTTEQGKFRLREGEISLPAELEGHVLAVLGLDNRPQAKPHFRIAKPRATNVSYTPVQVAQMYGFPAGATATGQTIGIIELGGGYRAADLTAYFKTLGLPAPTVTAVPIDGGKNTPGNANGADGEVMLDIEVCAAVAQGAKIAVYFTTNTDQGFIDAITTAVHDSTNKPSVISISWGGPESSWTEQSMTALDAACQAAAAVGVTITVAAGDNGSSDGASGDNVDFPASSPHVLACGGTKLVGSGSTITSEVVWDETSNDEGATGGGVSTVFALPTWQKNANVPSPTTSAGGRGVPDVSGDADPSTGYTIRVDSETTVIGGTSAVAPLWAGLIALANAQNKVAAGFVNPALYAAGAKKAFRDITQGNNGSFSAGPGWDACTGLGSPVGNLVIQAVAPKSTTTKKAKKGKTK(SEQIDNO:110)；和

同源物26(NCBIYP_004030750)

MHSYLKQQSHMQSYLEQENHMRSYLEMRKKPYFDDLANIRPGGLTPAQVCQAYQFAKVQPVRPVKLGIVSLAGQYLSSDMSKAFTGYGLPTPVVSTAGSQVLGDLWSNVENMMDIEIAGAAWAYATGTAATLLMQFEPNNETGIPNAINALVAAGCEVISISWGAPANLQTMEAITARKEACKQAAVQNVHVFAASGDESLNDGTNSRTPDDPCCDPNVWGVGGTRLVLQADGSIAQESAWGDGNAADKGGGGGFDSREPLPDYQVGVVHSEHRGSPDSSANADPGTGYAIVANGQWLIGGGTSASAPLTAGYVAAILSTLPGPISQSVLQRKLYTAHKTAFRDILLGSNGAPARPGWEEATGLGSINGPGLAAALQS(SEQIDNO:111)。

在一个实施例中，所述一种或多种多肽包括包含了选自由SEQIDNOs:74、75、77、78、82、88、98、105、111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列的一种或多种多肽，或者由选自由SEQIDNOs:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成的一种或多种多肽。在进一步的实施例中，所述一种或多种多肽包括包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成的多肽：

同源物4突变株

MANHPLNGSERECLKDAQPIGKADPNERLEVTMLVRRRSHDAFEKHISALAAQGASAKHIDHDEFTKHFGADSADLAAVHAFAQKHGLSVVESHEARRAVVLSGTVAQFDAAFGVSLQQYEHDGGTYRGRTGPIHLPDELNGVVDAVMGLDNRPQARPSFRTRAQGNVRWTARAAGASTFTPVQLASLYDFPQGDGQNQCIGIIELGGGYRPADLKTYFASLNMKAPSVTAVSVDHGRNHPTGDPNGPDGEVMLDIEVAGAVAPGAKIVVYFAPNTDAGFIDAIGTAIHDTKNKPSVISISWSGPESAWTQQAMNAFDQAFQSAAALGVTICAASGDNGSGGGVGDGADHVHFPASSPYALGCGGTSLQASGNGIASETVWNDGANGGATGGGVSSFFALPAWQEGLRVTRAGGAHSPLAMRGVPDVAGNADPVTGYEVRVDGHDMVIGGTSAVAPLWAGLIARINAIKGAPVGYINPHLYKDPLALVDITKGNNDDFHATAGWDACTGLGRPDGKKVKDAVS(SEQIDNO:89)，或者该序列的经加工的版本。

所述方法包括施用所述的一种或多种多肽以及任意其他的合适的活性剂来治疗口炎性腹泻。在各个非限制性的实施例中，所述方法进一步包括给受试者施用一定量的一种或多种其他多肽，所述多肽包括选自由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：

(A)与SEQIDNO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，其中：

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基278是Ser，残基78是Glu，残基82是Asp；

(B)与SEQIDNO:1的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，其中：

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基467是Ser，残基267是Glu，残基271是Asp。

所述一种或多种其他多肽已有公开用于治疗口炎性腹泻(参见WO2013/023151)。所述其他多肽或者是Kumamolisin-As(SEQIDNO:67)的经加工的版本，或者是Kumamolisin-As(SEQIDNO:33)的经加工的版本，或者是它们的经修饰的版本，其已知为丝氨酸羧肽酶的sedolisin家族的一员，利用关键的经加工形式的催化三联体Ser²⁷⁸-Glu⁷⁸-Asp⁸²来水解其底物(预加工形式的Ser⁴⁶⁷-Glu²⁶⁷-Asp²⁷¹)。其最佳活性是在pH～4.0时。虽然Kumamolisin-As的天然底物还是未知的，但其先前已经表现出在酸性条件下能降解胶原蛋白。另外，这种酶已被证明是热稳定的，理想温度是在60℃，但在37℃仍表现出较高的活性。

所述其他多肽可以包括在SEQIDNO:67(野生型经加工的Kumamolisin-As)的一个或多个残基处的一种或多种氨基酸变化，所述残基选自由残基73、102、103、104、130、165、168、169、172和179(编号基于野生型经加工的Kumamolisin-As氨基酸序列)组成的组。在非限制性的实施例中，与野生型经加工的Kumamolisin-As氨基酸序列(SEQIDNO:67)相关的所述一种或多种变化可以选自包括以下变化的组：

在各个非限制性的实施例中，与野生型经加工的Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少N102D。在另一个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少N102D和D169N或D169G。在另一个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少N102D、D169G和D179H。在另一个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少S73K、D104T、N102D、G130S、D169G和D179H。

所述其他多肽可以包括在SEQIDNO:33(野生型预加工的Kumamolisin-As)的一个或多个残基处的一种或多种氨基酸变化，所述残基选自由残基119、262、291、292、293、319、354、357、358、361和368(编号基于野生型预加工的Kumamolisin-As氨基酸序列)组成的组。在非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以选自包括以下变化的组：

在各个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少N291D。在另一个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少N291D和358N或358G。在另一个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少N291D、358G和368H。在另一个非限制性的实施例中，与野生型Kumamolisin-As氨基酸序列相关的所述一种或多种变化可以包括至少V119D、S262K、D293T、N291D、G319S、D358G和D368H。

在本申请中使用的，“至少75％相同”含义为所述多肽在其整个氨基酸序列长度上与由SEQIDNO:1或35定义的多肽存在25％或更少的不同之处(包括任意的氨基酸替换、删除、添加或者插入)。

在不同的进一步的实施例中，所述一种或多种其他多肽包括包括至少75％与SEQIDNOS:2-33或36-67，或者作为替换2-32或36-66中的任一种相同的氨基酸序列，或由至少75％与SEQIDNOS:2-33或36-67，或者作为替换2-32或36-66中的任一种相同的氨基酸序列组成。与野生型Kumamolisin-As相比，所述各种由SEQIDNOS代表的多肽的各具体多肽实例在pH为4时具有提高的抗寡肽PQPQLP(SEQIDNO:34)(代表麦醇溶蛋白的底物)蛋白酶活性。在各优选的实施例中，一种或多种其他多肽包括至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与与SEQIDNOS:36-66中的任一种相符的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者由至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与与SEQIDNOS:36-66中的任一种相符的氨基酸序列相同的氨基酸序列组成。在不同的进一步的实施例中，所述一种或多种其他多肽包括包括与SEQIDNOS:2-33或36-67，或者作为替换2-32或36-66中的任一种相符的氨基酸序列，或由与SEQIDNOS:2-33或36-67，或者作为替换2-32或36-66中的任一种相符的氨基酸序列组成。

在一实施例中，所述一种或多种其他多肽包括包含如下示出的氨基酸序列(KumaMax^TM)的多肽，或者由包含如下示出的氨基酸序列(KumaMax^TM)的多肽组成：

MSDMEKPWKEGEEARAVLQGHARAQAPQAVDKGPVAGDERMAVTVVLRRQRAGELAAHVERQAAIAPHAREHLKREAFAASHGASLDDFAELRRFADAHGLALDRANVAAGTAVLSGPDDAINRAFGVELRHFDHPDGSYRSYLGEVTVPASIAPMIEAVLGLDTRPVARPHFRMQRRAEGGFEARSQAAAPTAYTPLDVAQAYQFPEGLDGQGQCIAIIELGGGYDEASLAQYFASLGVPAPQVVSVSVDGASNQPTGDPKGPDGEVELDIEVAGALAPGAKFAVYFAPDTTAGFLDAITTAIHDPTLKPSVVSISWSGPEDSWTSAAIAAMNRAFLDAAALGVTVLAAAGDSGSTGGEQDGLYHVHFPAASPYVLACGGTRLVASGGRIAQETVWNDGPDGGATGGGVSRIFPLPAWQEHANVPPSANPGASSGRGVPDLAGNADPATGYEVVIDGEATVIGGTSAVAPLFAALVARINQKLGKAVGYLNPTLYQLPADVFHDITEGNNDIANRAQIYQAGPGWDPCTGLGSPIGVRLLQALLPSASQPQP(SEQIDNO：90)，或者该序列的经加工的版本。

在一个实施例中，所述方法包括施用同源物4或全长突变株同源物4(SEQIDNOs:75、89和/或98)或其经加工的版本，以及本申请公开的一种或多种其他多肽，包括但不限于KumaMa^TMx(SEQIDNO:90)或其经加工的版本。如下面示出的实例所述，与Kumamolisin多肽相比，同源物4(SEQIDNO:98)具有增强的抗γ-麦醇溶蛋白肽(氨基酸序列IQPQQPAQL(SEQIDNO:92))活性。因此，施用同源物4(SEQIDNO:98)或其经加工的版本以及一种或多种Kumamolisin多肽(比如KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或其经加工的版本)能提供改进的针对麸质消化的治疗。在进一步的实施例中，所述同源物4多肽包括全长同源物4突变株(SEQIDNO:89)或其经加工的版本，或者由全长同源物4突变株(SEQIDNO:89)或其经加工的版本组成，其中下述各实例表明：其能显著提高抗胃部麸质降解产物的活性，所述胃部麸质降解产物已被明确指出与口炎性腹泻病相关，所述麸质降解产物为：所述33mer肽(LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQIDNO:72))和所述26mer肽(FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ(SEQIDNO:73))。

在另一个实施例中，所述方法包括施用同源物1(SEQIDNO:74)、同源物6(SEQIDNO:77)，和/或同源物6突变株(SEQIDNO:78)，或其经加工的版本，以及本申请公开的一种或多种其他多肽，包括但不限于KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或其经加工的版本。在下述经证明的实例中，同源物1(SEQIDNO:74)在pH达到5时活性最佳，同源物6突变株被证明其最佳活性时的pH水平低于其他同源物以及其他Kumamolisin相关的多肽。因此，同源物1(SEQIDNO:74)、同源物6(SEQIDNO:77)，和/或同源物6突变株(SEQIDNO:78)，或其经加工的版本能够在合适的pH环境中单独使用，或者与一种或多种其他多肽组合使用以扩大所述一种或多种其他多肽的pH范围，用于例如更精确的模拟胃部的pH。

在进一步的实施例中，所述方法包括施用同源物26(SEQIDNO:88或111)或其经加工的版本，以及本申请公开的一种或多种其他多肽，包括但不限于KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或其经加工的版本。如下面示出的实例所述，同源物26(SEQIDNO:111)在切断所述33mer麦醇溶蛋白肽上具有极强的活性，因此其能单独或与所述一种或多种其他多肽组合使用来治疗口炎性腹泻，包括但不限于KumaMax^TM(SEQIDNO:90)。

口炎性腹泻(也称为乳糜泻或麸质不耐症)是一种极常见的疾病，该病是在小麦、大麦、黑麦产品中发现的被称为“麸质”的食用蛋白质在遗传学上易感染个体的小肠中引起的免疫反应。由此导致的炎症会造成小肠绒毛的退化，阻碍营养物的吸收。其症状会在儿童早期或人生的后期出现，严重程度分布广泛，从腹泻、疲劳、体重减轻、腹痛、胃气胀、气体过剩、消化不良、便秘、腹胀、恶心/呕吐、贫血、容易瘀伤、抑郁、焦虑、儿童生长迟缓、脱发、皮肤炎、月经不规则、口溃疡、关节疼痛、鼻出血、癫痫发作、手部或足部麻刺或发麻、青春期延迟、牙釉质缺陷到神经症状，比如共济失调或感觉异常(paresthesia)。目前对这种伴随终生的疾病尚没有有效的治疗方法，只能从饮食中完全排除麸质。尽管仍有很大一部分口炎性腹泻未被检测出来，但该病在美国和欧洲的患病率据估计占人口的0.5-1.0％。

本申请中使用的“治疗口炎性腹泻”是指实现下述中的一个或多个：(a)减轻口炎性腹泻的严重程度；(b)限制或预防口炎性腹泻典型症状的发展；(c)阻止口炎性腹泻典型症状的恶化；(d)限制或预防先前已经患有该病的患者出现口炎性腹泻的反复；(e)限制或预防先前具有口炎性腹泻的症状的患者出现症状的反复；以及(f)限制有发展成口炎性腹泻风险或者尚未出现出口炎性腹泻临床表现风险的对象发展成口炎性腹泻。

依据本发明方法所述待治疗的对象可以是任何患有口炎性腹泻的对象，包括人类受试者。所述对象可以是已经患有一些症状的，或者是没有出现什么症状的。

在一个实施例中，所述对象可以是HLA-DQ2血清型；在另一实施例中，所述对象可以是HLA-DQA血清型。具有增强的抗γ-麦醇溶蛋白(同源物1、4、5和9(SEQIDNOs:74、75、76、79、89、98、99和102)的多肽在治疗HLA-DQ8血清型的患者时尤其有效。具有增强的抗本申请所述的麸质降解产物α2-麦醇溶蛋白和α9-麦醇溶蛋白和/或33-mer、26-mer(同源物4突变株(SEQIDNO:89)和同源物13及26(SEQIDNOs:82、88、105和111))的多肽在治疗HLA-DQ2血清型的患者时尤其有效。

本申请中使用的“有效量”是指能有效治疗口炎性腹泻的多肽的用量。所述多肽通常制成药物组合物，比如那些上文中公开的，且能够通过合适的途径给药，包括口服的、经肠外途径给药、通过雾化吸入或局部施用含常规药学上可接受的载体、辅剂和赋形剂的单位剂型制剂。在优选的实施例中，所述药物组合物和制剂是口服给药的，比如采用片剂、丸剂、锭剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液或糖浆。

可以调整给药方案以提供最佳的预期效果(例如治疗效果或预防效果)。合适的剂量范围可以是，例如，0.1ug/kg-100mg/kg体重；作为替换，可以是0.5ug/kg-50mg/kg；1ug/kg-25mg/kg，或5ug/kg-10mg/kg体重。所述多肽可以通过快速灌注方式送药，或可以多次给药(例如，2、3、4、5或更多次)，这由主治医师决定。

同源物2

MQRGTKEGLNMARHLQADREPRIVPESKCLGQCDPAERIHVTIMLRRQEEGQLDALVHQLATGDARAKPVSRDAFAQRFSANPDDIRKTEDFAHRHQLTVDRVDPVESVVVLSGT(I/V/D)AQFEAAFSVKLERFEHRSIGQYRGRSGPIVLPDDIGDAVTAVLGLDSRPQARPHFRFRPPFKPARGAAAVTFTPIQLASLYDFPAGDGAGQCIAIIELGGGYRAADIQQYFRGLGITTPPKLVDVNVGTGRNAPTGEP(N/S/K/G)GPDGEVALDIEIAGAIAPAAKIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIQAVNAAVTDKTNQPSVISISW(G/S)GPEAIWQAQSAQAFNRVLQAAAAQGITVCAASGD(S/N)GS(G/T/A)(D/N/G)GL(Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYVLGCGGTQLDALPGQGIRSEVTWNDEASGGGAGGGGVSALFDLPAWQQGLKVARADGTTTPLAKRGVPDVAGDASPQTGYEVSVAGTPAVMGGTSAVAPLWAALIARINAANGASAGWINPVLYKHPGALRDITKGSNGTYAAASGWDACTGLGSPNGAQLATILARKPSS(SEQIDNO:95)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基116是V或D；(ii)AA残基255是S、K或G；(iii)AA残基284是D；(iv)AA残基285是T；(v)AA残基286是A、T或N；(vi)AA残基312是S；(vii)AA残基347是N；(viii)AA残基350是T或A；(ix)AA残基351是N或G；(x)AA残基354是D；和(xi)AA残基361是S或H；

同源物4

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基106是D；(ii)AA残基246是S、K或G；(iii)AA残基275是D；(iv)AA残基276是S；(v)AA残基277是A、T或N；(vi)AA残基303是S；(vii)AA残基338是S；(viii)AA残基341是T或A；(ix)AA残基342是N或G；(x)AA残基345是Q或D；和(xi)AA残基352是S或H；

同源物5

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基120是D；(ii)AA残基259是S、K或G；(iii)AA残基288是D；(iv)AA残基289是T；(v)AA残基290是A、T或N；(vi)AA残基316是S；(vii)AA残基351是S或N；(viii)AA残基354是A；(ix)AA残基355是N或G；(x)AA残基358是D；和(xi)AA残基365是S或H；

同源物#6突变株

同源物9

MTKQPVSGSSDKIHPDDAKCIGDCDPSEQIEVIVMLRRKDEAGFRQMMSRIDAGEAPGQAVSREEFDRRFTASDEDIDKVKAFAKQYGLSVERAETETRSVVLKGT(I/V/D)EQFQKAFDVKLERFQHHNIGEYRGRTGPVNVPDEMHDAVTAVLGLDSKPQARPHFRFRPPFKPLRGAAPASFSPVDLAKLYDFPDGDGAGQCIAIIELGGGYRDSDLSAYFSKLGVKAPTVVPVGVDGGKNAPTGNP(N/S/K/G)GPDGEVTLDIEIAGAIAPGARIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFVDAVNRALHDAANKPSVISISW(G/S)GPESNWSPQSMSAFNDVLQSAAALGVTVCAASGD(G/S/N)GS(A/T)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYVLGCGGTSLAASGAGIAKEVVWNDGDQGGAGGGGVSGTFALPVWQKGLSVTRNGKHIALAKRGVPDVAGDASPQTGYEVLIDGEDTVVGGTSAVAPLWAALIARINAIDASPAGFVNPKLYKAKTAFRDITEGNNGSFSAAAGWDACTGMGSPDGGKIAAALKPAKPSQSAGQQ(SEQIDNO:79)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基107是V或D；(ii)AA残基245是S、K或G；(iii)AA残基274是D；(iv)AA残基275是T；(v)AA残基276是A、T或N；(vi)AA残基302是S；(vii)AA残基337是S或N；(viii)AA残基340是T或A；(ix)AA残基341是N或G；(x)AA残基344是Q或D；和(xi)AA残基351是S或H；

同源物10

MGRLQGSYRPSLGTPVGPVPDDQPIDVTVVLRPTAADDFRADPDDVAAVRAFAGRAGLDVAEVDEPARTVRLRGP(A/V/D)AAARTAFDTPLALYDSGGRAIRGREGDLGLPDELDDRVVAVLGLDERPAARPRFQPAASARQGLTALQVARAYDFPAATGEGQTIAIIELGGGFGQADLDTYFGGLDLPTPAVSAVGVQGAANVPGGDP(/S/K/G)DGADGEVLLDIEVAGAVAPGAAQVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)AGFLAAINAAAAATPRPAAISISWG(G/S)PESSWTAQAMRAYDQAFAAARAAGITVLAAAGD(A/S/N)GA(D/T/A)(D/S/N/G)(A/Q/D)TDRLVA(D/S/H)FPAGSPNVIACGGTKLTLDAAGARASEVVWNEAADSATGGGYSATFTRPAWQPAAVGRYRGLPDISGNADPQTGYRVVVDGQPTVVGGTSAVAPLLAGLVARLAQLTGAPVADLAAVAYANPAAFTDITAGDNQGYPARSGWDPASGLGSPVGTKLLTAVGGPTPPPTTPPPTTPPPTTPPPTIPPPTTPPTQTVDAADRALWSAVATWAGGTHTGANARAAKAVRAWAQAKSLA(SEQIDNO:80)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基76是V或D；(ii)AA残基206是S、K或G；(iii)AA残基235是D；(iv)AA残基236是S；(v)AA残基237是A、T或N；(vi)AA残基262是S；(vii)AA残基297是S或N；(viii)AA残基300是T或A；(ix)AA残基301是N或G；(x)AA残基302是Q或D；和(xi)AA残基309是S或H；

同源物12

MTQPRYTPLPGSEREAPLLAARSNATAARASRAQTASATVVLRRRSELPEALVLDQQFISSDELAARYGADPVDIEKVRSVLERFKVSVVEVDAASRRVKVEGA(V/D)ADIERAFNIALHSASGTDPHSGRGFEYRYRTGVLSVPAELGGIVTAVLGLDNRRQAETRLRVVPAAALGSSYTPVQLGEIYNFPQDATGAGQRIAIIELGGGYTPAGLRRYFASLGVVPPKVAAVSVDGAQNAPGPDP(G/S/K/G)ADGEVQLDVEVAGALAPGAHVLVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFLDAVSQAAHATPPPTAISISW(G/S)ASEDSWTASARDALNQALRDAAALGVTVTAAAGD(S/N)GS(S/T/A)(D/N/G)GV(P/Q/D)DRRAHV(D/S/H)FPASSPYVLATGGTSLRADPATGVVQSETVWNDSQGSTGGGVSDVFPRPAWQAHVDVPHAGRGVPDVSAVADPATGYQVLVDNQPAVIGGTSAVAPLWAALVARLAESLGRPLGLLQPLVYPRTPGSTAYPGFRDITIGNNGAYKAGKGWDAATGLGVPDGTELLAHLRGLNGSE(SEQIDNO:81)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基105是D；(ii)AA残基244是S或K；(iii)AA残基272是D；(iv)AA残基273是S；(v)AA残基274是A、T或N；(vi)AA残基299是S；(vii)AA残基334是N；(viii)AA残基337是T或A；(ix)AA残基338是N或G；(x)AA残基341是Q或D；和(xi)AA残基348是S或H；

同源物13

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基106是V或D；(ii)AA残基244是S、K或G；(iii)AA残基273是D；(iv)AA残基274是T；(v)AA残基275是A、T或N；(vi)AA残基301是S；(vii)AA残基336是N；(viii)AA残基339是T或A；(ix)AA残基340是N或G；(x)AA残基343是D；和(viii)AA残基350是S或H；

同源物14

MTKHPLPGSERVLAPGSKVVAQCDPSETIEVVVVLRRKNEQQFAQMMKTIEAGAAGARPLTREELEQRFGALPEDIAKLKAFAAQHGLSVVREDASARTVVLSGR(I/V/D)EQFQQAFDVQLQHYEHQSMGRFRGRTGAISVPDELHGVVTAVLGLDDRPQARPHFRIRPPFQPARAQSASSFTPLQLASLYRFPQGDGSGQCIGIVELGGGYRTADLDSYFSSLGVGSPKVVAVGVDQSGNQPTGDP(N/S/K/G)GPDGEVTLDIEIAGALAPAATIAVYFTT(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIDAVSQAVHDRTNQPSVISISW(G/S)APESMWTAQSMKALNDVLQSAAAIGVTVCAASGD(S/N)GS(S/T/A)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGRDHV(D/S/H)FPASSPYVLACGGTSLQGSGRTVAHEVVWNDGSNGGATGGGVSGAFPVPAWQEGLSTSAAQGGQRALTGRGVPDVAGDASPLTGYDVIVDGNNTVIGGTSAVAPLWAALIARINGAKGAPVGFVNPKLYKASACNDITQGNNGSYAATTGWDACTGLGSPDGVKVAAAL(SEQIDNO:83)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基107是V或D；(ii)AA残基245是S、K或G；(iii)AA残基274是D；(iv)AA残基275是T；(v)AA残基276是A、T或N；(vi)AA残基302是S；(vii)AA残基337是N；(viii)AA残基340是T或A；(ix)AA残基341是N或G；(x)AA残基344是Q或D；和(xi)AA残基351是S或H；

同源物15

MSPIASRRSALPLSERPAPENARALAAVEPDRTMTVSVLVRRKKPLVLADLEGKKLTHREFERRYGASEKDFATIAKFAAGHGLAVDHHASSLARRTVVLRGT(A/V/D)RQMQQAFGVTLHDYEDSETQQRYHSFTGAITVPAAHARIIESVLGLDARPIAKPHFRVRKRSAAATGAVSFNPPQVASLYSFPTGVDGSGETIGILELGGGYETSDIQQYFSGLGIQPPTVVAVSVDGAVNAPGNP(N/S/K/G)GADGEVALDIQVAGSIAPGAKLAVYFAP(N/D)(T/S)(E/D/A/T/N)QGFVDAITTAVHDTANKPSVLSISW(G/S)GPESSWPQAAAQSLNNACESAAALGVTITVASGD(N/S)GS(T/A)(D/N/G)GV(Q/D)DGQNHV(D/S/H)FPASSPYVLACGGTYLAAVNNGVPQESVWDDLASGGGATGGGVSALFPLPAWQTGANVPGGSMRGVPDVAGDASPESGYNVLVDGQPQVVGGTSAVAPLWAALIALVNQQKGEAAGFVNAALYQNPSAFHDITQGSNGAYAAAPGWDPCTGLGSPMGTAIAKILA(SEQIDNO:84)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基104是V或D；(ii)AA残基241是S、K或G；(iii)AA残基270是D；(iv)AA残基271是S；(v)AA残基272是D、A、T或N；(vi)AA残基398是S；(vii)AA残基33是S；(viii)AA残基336是A；(ix)AA残基337是N或G；(x)AA残基340是D；和(xi)AA残基347是S或H；

同源物16

MSAFDQLVPLPGSEKTVPDAAPSQTLDPNEVLTVTIRIRRKRTLASLVSTTAPVTEVVSRSEYASRFGADPAIVKQVEAFASAYDLSLVEQSLARRSVLLRGT(V/D)AQMEQAFGVSLANYQLADGTVFRGRTGVVNVPSELVEHIEGVFGLDNRPQARAHFQVYKPEKGTKVAPRAGGISYTPPQLARLYNFPTGVTGKGQCIAIIELGGGFRTADIKTYFGGLGLKPPTVVAVSVDGGHNAPSTA(D/S/K/G)SADGEVMLDIDVAGGVAPGAKIVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFLDAITTAMHDTKNKPSVISISW(G/S)AAESNWTPQALTSFNQAFQAAAALGITVCAAAGD(T/S/N)GS(D/T/A)(D/N/G)SV(G/Q/D)DGKAHV(D/S/H)FPASSPFVLACGGTKLTATDNVIASEVVWHESKTSATGGGVSDVFDLPDYQQKSHVPPSVNDKTRIGRGVPDVAAVADPVTGYAVRVDGSNLVFGGTSAVAPLMAGLIALINQQRGKAVGFIHPLIYANPSAFRDITQGNNTTTTGNKGYAATTGWDACTGLGVADGKKLASVLTATPVA(SEQIDNO:85)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基104是D；(ii)AA残基245是S、K或G；(iii)AA残基274是D；(iv)AA残基275是S；(v)AA残基276是A、T或N；(vi)AA残基302是S；(vii)AA残基337是S或N；(viii)AA残基340是T或A；(ix)AA残基341是N或G；(x)AA残基344是Q或D；和(xi)AA残基351是S或H；

同源物17

MAATPRFASQPRVTLPGSQKHPLTTDTEVPPPAPVKAAATKLSATPFTVTVIVKRKNPLNLKQVLKPAGRLTHAAFAKAHGPSPDGVKLVKAFAKEFGLTVAPAPGQGRRALYLTGT(A/V/D)AAMQTAFGVTFATKIMEGTKYRVREGDICLPKELIGHVDAVLGLDNRPQAKPHFRHHKPAATSVSYTPVQVGQLYGFPSGAKATGQTIGLIELGGGFRAADITAYFKTLGQTAPKVTAVLVDKAKNTPTTS(S/K/G)SADGEVMLDIEVAAAVAPGANIAVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFIDAISQAVHDTVNKPSVISISW(G/S)GPESTWTAQSLAALDAACQSAAALGITITVAAGD(D/S/N)GS(T/A)(D/N/G)GV(K/Q/D)GTVNHV(D/S/H)FPASSPHVLGCGGTKLLGSGTTITSEVVWNELTANEGATGGGVSNVFPLPTWQAKSNVPKPTVAAGGRGVPDVSGNADPSTGYTVRVDGSTFPIGGTSAVAPLWAGLIALCNAQNKTTAGFINPALYAAAAAKSFRDITSGNNGGFKAGPGWDACTGLGSPIGTAIAKTLAPATKSTSKTAVKNAPEIRFRPHKKAPTKTAAKTPALRRLK(SEQIDNO:86)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基118是V或D；(ii)AA残基250是K或G；(iii)AA残基279是D；(iv)AA残基280是S；(v)AA残基281是A、T或N；(vi)AA残基307是S；(vii)AA残基342是S或N；(viii)AA残基345是A；(ix)AA残基346是N或G；(x)AA残基349是Q或D；和(xi)AA残基356是S或H；

同源物19

MPTSSRFASQSRVPLPGSERKPFVPAGAPKAAKTPKVSTAVKTVPATGRIRVSLIVPPKQPLDTKRLGKLDARLSRAQFAARHGADPASVRLVKAFAKEFGLTVEPITQPGRCTVQLSGT(C/V/D)AAMRKAFAISLVEHTTEQGKFRLREGEISLPAELEGHVLAVLGLDNRPQAKPHFRIAKPRATNVSYTPVQVAQMYGFPAGATATGQTIGIIELGGGYRAADLTAYFKTLGLPAPTVTAVPIDGGKNTPGNA(N/S/K/G)GADGEVMLDIEVCAAVAQGAKIAVYFTT(N/D)(T/S)(D/A/T/N)QGFIDAITTAVHDSTNKPSVISISW(G//S)GPESSWTEQSMTALDAACQAAAAVGVTITVAAGD(N/S)GS(S/T/S)(D/N/G)GA(S/Q/D)GDNV(D/S/H)FPASSPHVLACGGTKLVGSGSTITSEVVWDETSNDEGATGGGVSTVFALPTWQKNANVPSPTTSAGGRGVPDVSGDADPSTGYTIRVDSETTVIGGTSAVAPLWAGLIALANAQNKVAAGFVNPALYAAGAKKAFRDITQGNNGSFSAGPGWDACTGLGSPVGNLVIQAVAPKSTTTKKAKKGKTK(SEQIDNO:87)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基121是V或D；(ii)AA残基253是S、K或G；(iii)AA残基282是D；(iv)AA残基283是S；(v)AA残基284是A、T或N；(vi)AA残基310是S；(vii)AA残基345是S；(viii)AA残基348是T或A；(ix)AA残基349是N或G；(x)AA残基352是Q或D；和(xi)AA残基357是S或H；和

同源物26

MHSYLKQQSHMQSYLEQENHMRSYLEMRKKPYFDDLANIRPGGLTPAQVCQAYQFAKVQPVRPVKLGIVSLAGQYLSSDMSKAFTGYGLPTPVVSTAGSQVLGDLWSNVE(N/S/K/G)MMDIEIAGAAWAYATGTAATLLMQFEP(N/D)(N/T/S)(E/D/A/T/N)TGIPNAINALVAAGCEVISISW(G/S)APANLQTMEAITARKEACKQAAVQNVHVFAASGD(E/S/N)SL(N/T/A)(D/N/G)(G/Q/D)TNSRTP(D/S/H)DPCCDPNVWGVGGTRLVLQADGSIAQESAWGDGNAADKGGGGGFDSREPLPDYQVGVVHSEHRGSPDSSANADPGTGYAIVANGQWLIGGGTSASAPLTAGYVAAILSTLPGPISQSVLQRKLYTAHKTAFRDILLGSNGAPARPGWEEATGLGSINGPGLAAALQS(SEQIDNO:88)，

其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或所有十个为真：(i)AA残基111是S、K或G；(ii)AA残基139是D；(iii)AA残基140是T或S；(iv)AA残基141是D、A、T或N；(v)AA残基164是S；(vi)AA残基199是S或N；(vii)AA残基202是T或A；(viii)AA残基203是N或G；(ix)AA残基204是Q或D；和(x)AA残基211是S或H。

所述多肽可以是各列举的多肽的经加工的版本；本申请请求保护的多肽包括各列举的多肽的任意这种经加工的版本。所述多肽经加工的版本按上述定义。

在一个实施例中，所述分离的多肽包括选自同源物4、同源物6突变株、同源物13和26或其经加工的版本的多肽的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述分离的多肽包括选自同源物4突变株全长序列的氨基酸序列：

本申请中公开的多肽经鉴定与在以“麦醇溶蛋白”而知名的富含羟脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)组分的麸质中的Kumamolisin相关的多肽具有类似的、改进的或互补的活性，所述“麦醇溶蛋白”被认为是造成绝大部分口炎性腹泻患者的大部分免疫反应的元凶。发明人测试的很多其他Kumamolisin同源物的这种麦醇溶蛋白水解活性很小或没有。因此，所述多肽能够用于治疗口炎性腹泻。本发明这一方面的多肽能在各种pH值下降解麦醇溶蛋白。这种降解在以下实例中公开的条件下发生。

如本申请通篇使用的，术语“多肽”按其最广义的含义理解是指亚基氨基酸(subunitaminoacid)的序列，不论是自然产生的或是源于合成的。本发明的多肽包括L-氨基酸、D-氨基酸(其在体内抗L-氨基酸特异性蛋白酶)，或D-氨基酸和L-氨基酸的组合物。这里描述的多肽可以是化学合成的或重组表达的。所述多肽可以连接其他化合物以促使其在体内具有延长的半衰期，比如通过聚乙二醇化、羟乙基淀粉化(HESylation)、PAS化(PASylation)或糖基化。这种连接可以是按本领域技术人员理解的共价的或是非共价的。所述多肽可以连接到任意其他合适的接头上，包括但不限于任意的能用于纯化或检测的接头(比如FLAG或组氨酸标签(Histag))。

在又一方面，本发明提供了组合物，包括：

(a)一种或多种多肽，包括选自由SEQIDNOs:74-78、80-88、95、97-99和102-111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列；和

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基278是Ser，残基78是Glu，残基82是Asp；

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基467是Ser，残基267是Glu，残基271是Asp。

所述一种或多种其他多肽可以是任意上述描述的多肽。例如，所述一种或多种其他多肽包括可以包括至少75％、80％、85％、90％、95％或100％与SEQIDNOS:2-33或36-67，或者作为替换2-32或36-66中的任一种相同的氨基酸序列，或由至少75％、80％、85％、90％、95％或100％与SEQIDNOS:2-33或36-67，或者作为替换2-32或36-66中的任一种相同的氨基酸序列组成。在另一实施例中，所述一种或多种其他多肽包括KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或者该序列的经加工的版本，或者由KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或者该序列的经加工的版本组成。

在一个实施例中，所述组合物包括同源物4(SEQIDNO:75或98)或全长突变株同源物4(SEQIDNO:89)或其经加工的版本，以及本申请公开的一种或多种其他多肽，包括但不限于KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或其经加工的版本。在另一个实施例中，所述组合物包括SEQIDNO:74、SEQIDNO:77和/或SEQIDNO:78(同源物1、同源物6和/或同源物6突变株)或它们经加工的版本，以及本申请公开的一种或多种其他多肽，包括但不限于KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或其经加工的版本。在进一步的实施例中，所述方法包括施用SEQIDNO:88和/或111(同源物26)或其经加工的版本，以及本申请公开的一种或多种其他多肽，包括但不限于KumaMax^TM(SEQIDNO:90)或其经加工的版本。

在另一方面，本发明提供了编码本发明任意方面或实施例中的多肽的分离的核酸。所述分离的核酸序列可以包括RNA或DNA。本申请中使用的“分离的核酸”是指那些已经从基因组或cDNA序列中它们正常的周围核酸序列中移出。这种分离的核酸序列可以包括用于促进表达和/或纯化编码蛋白质的其他序列，包括但不限于polyA序列、修饰的Kozak序列以及编码了表位附加标签、输出信号、分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本申请的教导，那些能用于编码本发明的多肽的核酸序列对于那些本领域的技术人员来说是显而易见的。

在进一步的方面，本发明提供了核酸表达载体，包括有效连接(operativelylinked)至一合适的控制序列的本发明任意实施例的分离的核酸。“重组表达载体”包括将一核酸编码区或基因有效连接至任意能影响基因产物表达的控制序列的载体。有效连接至本发明的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子表达的核酸序列。所述控制序列不需要与所述核酸序列连接起来，只要它们能引导所述核酸序列的表达。因此，例如，间插的未转译但已经转录的序列可以存在于启动子序列和核酸序列之间，所述启动子序列仍被认为“有效连接”(operablylinked)至所述编码序列。其他这类控制序列包括但不限于多聚腺苷化信号、终止信号和核糖体结合位点。这类表达载体可以是本领域公知的任意类型，包括但不限于质粒载体和病毒表达载体。所述用于驱动公开的哺乳动物系统中的核酸序列的控制序列可以是组成型序列(由各种启动子(包括但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF)中任意的启动子驱动)或诱导型序列(由若干诱导型启动子(包括但不限于四环素敏感型、蜕皮素敏感型、激素敏感型)中任意的启动子驱动)。本领域中构建用于转染前核细胞的表达载体也是公知的，因此能够采用标准技术实现。(参见，例如，Sambrook、Fritsch和Maniatis：MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989；GeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton,N.J.)，以及theAmbion1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。所述表达载体必须能在宿主生物体中或者作为游离基因或者通过整合基因复制成宿主染色体DNA。在优选的实施例中，所述表达载体包括质粒。但是，本发明旨在包括能提供等同功能(比如，病毒载体)的其他表达载体。

在另一方面，本发明提供了包括本发明的核酸表达载体的重组宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核的或真核的。所述细胞能够瞬时或稳定转染或转导。可以采用本领域中已知的任何技术实现这种将表达载体转染和转导成原核和真核细胞，包括但不限于标准细菌转化法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法或脂质体介导转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、聚阳离子介导转染法或病毒介导转染法。(参见，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook,etal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,2^ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,NY)。用于生产本发明的多肽的方法是本发明的另一部分内容。所述方法包括步骤：(a)在有助于所述多肽表达的条件下培养根据本发明这一方面内容的宿主；和(b)任选的，回收所述经表达的多肽。所述经表达的多肽可以从无细胞抽提液、细胞沉淀中回收，或从培养基中回收。纯化重组表达的多肽的方法对于本领域技术人员来说也是公知的。

在又一方面，本发明提供了药物组合物，包括多肽、核酸、核酸表达载体、重组宿主细胞或本发明的任意方面或实施例中的组合物，与药学上可接受的载体。本发明的药物组合物能用于，例如，本发明下面描述的方法中。除了包括本发明的多肽、核酸等，所述药物组合物可以包括(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)填充剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。

在一些实施例中，所述药物组合物中的缓冲剂是Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或乙酸缓冲液。所述药物组合物还可以包括冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施例中，所述药物组合物包括防腐剂，例如苯扎氯铵、苯乙铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸和它们的各种混合物。在其他实施例中，所述药物组合物包括填充剂，例如甘氨酸。在其他实施例中，所述药物组合物包括表面活性剂，例如，聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三月桂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、失水山梨醇三油酸酯或它们的组合。所述所述药物组合物还可以包括张力调节剂，例如，能使所述制剂与人体血液基本等张或等渗压的化合物。示例性的张力调节剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露醇、葡萄糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其他实施例中，所述药物组合物额外的还包括稳定剂，例如，当与目标蛋白质结合能大体上防止或减少冻干的或液体形式的目标蛋白质的化学和/或物理不稳定性。示例性的稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。

本发明的所述多肽、核酸等可以是所述药物组合物中的唯一活性剂，或者所述组合物可以进一步包括一种或多种适用于目标用途的其他活性剂。

本申请描述的所述药物组合物主要包括本申请描述的化合物的组合和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种药物组合物基本不含药学上不能接受的组分，即含有的药学上不能接受的组分低于在该申请提交的时期美国法规要求允许的值。在这方面的一些实施例中，若该化合物能溶于水或在水中悬浮，该组合物还任选地包括其他药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在其他实施例中，本申请描述的药物组合物是固体药物组合物(例如片剂、胶囊等)。

这些组合物能采用药学领域公知的方法进行制备，并能通过任何适宜的途径给药。在优选的实施例中，所述药物组合物和制剂设计用于口服给药。常规药物载体、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂及类似物质是必要的或适合的。

所述药物组合物可以是任意合适的形式，包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(固体或在液体介质中)、含例如活性化合物重量高达10％的软膏剂、软明胶胶囊和硬明胶胶囊、无菌注射液和无菌包装粉。

实例

口炎性腹泻是困扰大约1％的人口(1，2)的自身免疫性紊乱症。该病的特征是出现对麸质(小麦粉中的主要蛋白质)和大麦及黑麦中的相关蛋白质的炎性反应(2)。麸质是由糖蛋白类麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的不均匀混合物组成的(3)。消化时，部分α-麦醇溶蛋白被胃蛋白酶和肠蛋白酶降解成寡肽，由于这些寡肽具有异常高的脯氨酸和谷氨酰胺含量，难以进行进一步的蛋白质水解。由不完全的蛋白质水解生成的致免疫寡肽以所述PQ基序富集(4，5)，这会在患有口炎性腹泻的人的肠道中引起炎症和损伤。目前针对这种病的唯一治疗方法是完全从饮食中排除麸质，但由于在现代食物产品中普遍存在这种蛋白质，因而很难实现。

口服酶疗法(OET)(利用口服蛋白酶在致免疫肽引发炎症前将其水解)是目前开发的一种用于治疗麸质不耐症的治疗方法。为此，已经考虑使用的有几种不同的蛋白酶，因为它们或者特异性于切断脯氨酸残基，或者特异性于切断谷氨酰胺残基。但是，这些酶常被证明具有阻碍它们在OET中用于麸质降解的特征。这些肽中的大部分在中性pH下具有最佳的催化活性；但是，人类胃中的pH范围是2-4。所以这些酶在它们到达pH中性的小肠中时是活性最好的，但这对于有效预防口炎性腹泻就太迟了，因为这里是麸质源性病状发展的位置。另外，这些酶中的若干被证明在人类胃中的这种较低的pH下是不稳定的，容易被消化蛋白酶水解，或者在其纯化过程中需要扩大的复性过程，所有这些特征都阻碍了它们在临床上的应用。

用于利用OET治疗麸质不耐症的理想的蛋白酶应当具有以下特性：在较低pH下具有最佳的活性、容易纯化、在人类胃中的条件下是稳定的并且对在麸质源性致免疫寡肽中发现的氨基酸基序有较高特异性。我们预先鉴定出一种在酸性条件下具有较高活性的蛋白酶，来自嗜酸菌Alicyclobacillussendaiensis的Kumamolisin-As(KumaWT)，并且利用计算机建模工具朝所需的寡肽特异性方向改变它的结构。与野生型KumaWT相比，一示例性的计算机设计的酶(命名为KumaMax^TM)具有增加了超过100倍的蛋白质水解活性以及在底物中多800倍的开关(switch)是对靶向PQ基序特异性的。另外，KumaMax^TM被证明对普通的胃蛋白酶具有抗性，并且在E.Coli中具有极高的产率，且不需要进行复性。前述设计的蛋白质进行了抗PQLP(SEQIDNO:68)肽催化活性评价；示例性的结果列于表2中。

表2：

表2.与野生型Kumamolysin-As相比，所有纯化的、按顺序排列的突变株的PQ基序的水解活性的倍数变化。这些是在纯蛋白质检测中与野生型Kumamolysin相比所有经纯化、按顺序排列并进行检测的突变株的倍数变化。该检测在pH为4下进行，酶的最终浓度是0.0125mg/mL，底物浓度是5μM。

在该研究中，发明人测试了大量自各种生物体获得的Kumamolisin同源物，以测定其降解麦醇溶蛋白的活性。它们都具有存在于Kumamolisin-As中的催化三联体(在Kumamolisin-As未处理形式中的Ser⁴⁶⁷-Glu²⁶⁷-Asp²⁷¹)。为了评估这些同源物对于目标麸质的相应能力，经纯化的同源物与带有分布在麦醇溶蛋白上代表免疫原区的纯化肽(这是对口炎性腹泻患者来说麸质上有问题的部分)的蛋白质一起温育。

评估了在模拟实验的胃酸条件下各同源物切断麦醇溶蛋白荧光类似物——结合了荧光基团和淬灭基团的六胜肽(QPQLPY(SEQIDNO:91))的能力。可以通过测量随时间变化的荧光信号计算出降解速率。将该活性与Kumamolisin的活性(下面以KWT表示的)进行对比。Kumamolisin具有一些切断这些麦醇溶蛋白底物的活性。示例性的结果在图1中示出。可以看出，在这些条件下，只有一部分测试的同源物(1、2、4、8和9)具有与Kumamolisin相当或比Kumamolisin更好的活性。

在进一步的研究中，改变了pH水平，并在不同的pH水平下测试了各同源物的活性。该数据在图2中示出。大部分测试的同源物在Kumamolisin(下文以“WT”表示)和KumaMax^TM(以“Max”表示)两者的pH范围中被证明具有活性。有趣地是，与Kumamolisin相比其中两种同源物具有扩展的pH范围。同源物1在pH达到5时活性最佳，同源物6经证明最佳活性在pH水平低于其他同源物及Kumamolisin/KumaMax的值，这解释了为什么在pH＝4的条件下进行的荧光实验中未观察到这种同源物有活性。这表明可以使用同源物1和6，例如，扩展Kumamolisin相关多肽的pH范围，以便更准确的模拟胃部的pH条件。

我们进一步测试了这些同源物切断与口炎性腹泻病有关的不同的非荧光标记肽的能力。结果列于表3中，+和-表示同源物切断所示的肽的能力的可见指示。-<+/-<++/-<+<++<+++<++++。数字表示在80分钟温育后被同源物降解的肽的％(因此数字越小，同源物越有效)；(未测出(undetected))表示80分钟后所述肽低于检测限。

可以看出，Kumamolisin和KumaMax^TM具有差不多低水平的抗γ-麦醇溶蛋白肽的活性，而同源物4的抗α-麦醇溶蛋白肽的活性增加，这表明同源物4单独使用或与Kumamolisin相关多肽一起组合治疗能有效治疗麸质消化问题。

表3：

由于这些Kumamolisin同源物的序列一致性百分比较低，如同为了制出KumaMax我们对Kumamolisin进行的处理，我们在各同源物中制造了相同的突变。我们测试了这些同源物对于两种肽(胃中麸质降解产物并且与口炎性腹泻明确有关联)的活性：33mer肽((LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQIDNO:72))和26mer肽(FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ(SEQIDNO:73))。尤其是33mer肽与口炎性腹泻强烈相关。另外，各同源物的KumaMax^TM突变启发我们在Kumamolisin背景上单独制造了这些3活性位点突变(注意，KumaMax^TM含有来自Kumamolisin的全部7个突变，但只有3个在活性位点中)。仅含有这些活性位点突变的这种突变株在下文中称为K3突变株。数据列于表4和图3中。我们发现在经证明具有抗这两种非常重要的肽的活性的几种同源物中，有趣的是，在同源物4(SEQIDNO:75)上KumaMax^TM(SEQIDNO:90)突变抗两种肽的活性增强；事实上，同源物4突变株(SEQIDNO:89)是在如下所示的实验中经测试最好的酶总体，包括KumaMax^TM(SEQIDNO:90)。这也表明K3突变株也能与KumaMax^TM(SEQIDNO:90)组合，产生更强的治疗效果。(NA＝没有活性)。

表4

同源物	33mer	26mer
			KumaMax	0.1％	26％29 -->
K3突变株	26％	5％
			KumaWT	18％	NA
同源物#1	46％	NA
			同源物#1Max	NA	NA
同源物#2	31％	NA
			同源物#2Max	29％	NA
同源物#4	38％	NA
			同源物#4Max	10％	19％
同源物#5	NA	NA
			同源物#5Max	NA	NA
同源物#9	NA	52％
			同源物#9Max	NA	60％
同源物#10	NA	NA
			同源物#10Max	NA	NA

进一步的研究采用其他Kumamolisin的同源物进行。这些同源物中的一部分(同源物13和26)经证明具有较高的抗33mer肽的活性；参见图4。特别的，野生型的同源物26在切断33mer肽上具有与KumaMax^TM相当的超强活性。

然后在60分钟的温育后，我们通过HPLC观察了消化33mer的情况；在多于一个位置降解33mer表明具有明显的治疗优势。野生型Kumamolysin仅在一个位置降解了33mer(WT样)，而KumaMax^TM在多个位置降解了33mer(Max样)。数据在表5中示出。

表5

数据的总体统计结果是几种同源物(包括同源物4(SEQIDNO:75)和同源物4突变株(SEQIDNO:89)、13和26)能够作为治疗剂用于治疗口炎性腹泻。同源物26(SEQIDNOL88)几乎与KumaMax^TM(SEQIDNO:90)同样有效并且这是未经任何设计的，同源物4经证明在带有构建到的KumaMax^TM的突变时具有增强的活性。此外，这些同源物(特别是同源物6(包括同源物6突变株)和同源物1)的pH分布表明这些同源物(单独或组合使用)能够扩大在人胃中治疗效力的pH范围。

方法

蛋白质表达和纯化

包含在pET29b质粒中的编码每种目标蛋白质的基因转化成EscherichiacoliBL21(DE3)细胞。挑选单个菌落，接种注入含有50μg/μL卡那霉素(TB+Kan)的TerrificBroth^TM中，在37℃温育过夜。将500uL的过夜培养物加入500mL自诱导培养基(5g胰酶解胨，2.5g酵母膏，465mLddH₂O)中，在37℃剧烈振荡4小时，然后加入自诱导组分(500uLMgSO₄，500uL1000x痕量金属，25mL20xNPS，10mL20x5052，500uL50mg/mLKan)。然后在离心前在18℃振荡培养物30小时。将细胞团块在10mL1xPBS中重悬浮，然后利用5mL裂解缓冲液(50mMHEPES，500mMNaCl，1mMbME，2mg/mL溶菌酶，0.2mg/mLDNase，ddH₂O)超声裂解并进行离心。然后将蛋白质过1mLTALON钴亲和柱纯化。采用20mL漂洗缓冲液(10mM咪唑、50mMHEPES、500mMNaCl、1mMbME、ddH₂O)洗涤KumaMax、KumaWT和SCPep三次，然后在15mL稀释缓冲液(200mM咪唑、50mMHEPES、500mMNaCl、1mMbME)中进行稀释。EP-B2需要在柱上进行重折叠，因此在裂解后，细胞团块在10mLEP-B2缓冲液中进行重悬浮，其中EP-B2缓冲液与漂洗缓冲液的区别仅在于其是在盐酸胍而不是ddH₂O中稀释，以实现EP-B2包涵体的变性。沉淀重悬浮液，上清液(含变性的EP-B2)上样到柱上利用0.8μm过滤器进行过滤。采用20mLEP-B2缓冲液洗涤EP-B2一次，再用20mL漂洗缓冲液洗涤两次以在柱上进行蛋白质重折叠。利用15ml稀释缓冲液稀释蛋白质。所有蛋白质从15mL浓缩至～500uL，然后在1L透析缓冲液(20％丙三醇、50mMHEPES、500mMNaCl、1mMbME)中透析一次。利用分光光度法计算蛋白质浓度，对于KumaWT和所有KumaWT变体，消光系数是53,985M^-1cm^-1，对于SCPep，消光系数是152,290M^-1cm^-1，对于EP-B2，消光系数是58,245M^-1cm^-1。

纯化酶分析

将在活性筛选中在FQ底物上表现出最佳活性的Kumamolisin-As变体按顺序排列，并进行小规模纯化。向50mLTB+Kan加入500uL的TB+Kan过夜培养物，并在37℃下生长直到达到0.5-0.8的光密度。添加IPTG至0.5mM，将所述培养物在22℃表达16-24小时。细胞进行离心分离，在500uL漂洗缓冲液(1xPBS、5mM咪唑、ddH₂O)中重悬浮，转移到2mL离心管中，并在1mL裂解缓冲液(1xPBS、5mM咪唑、2xBugBuster^TM、2mg/mL溶菌酶、0.2mg/mLDNase、ddH₂O)中进行裂解。离心后，上清液移入保鲜管中。将带有200uLTALON钴树脂的柱子放入离心管中，将上清液倒在柱子上并摇晃20分钟，再离心并倒掉流穿物(flow-through)。蛋白质用500uL漂洗缓冲液洗涤三次，倒掉洗涤之间的流穿物。用200uL稀释缓冲液(1xPBS、200mM咪唑、ddH₂O)稀释酶，利用分光光度法计算浓度，消光系数为53,985M^-1cm^-1。

在该分析中，Kumamolisin-As突变株在pH为4的100mM醋酸钠缓冲液中温育15分钟。将酶加入5μM底物中，这样最终蛋白质浓度是0.0125mg/mL。每隔30秒测量荧光强度，测量1小时。

动力学表征

麸质降解的酶变异倾向性通过水解作为底物的荧光淬灭的α-麦醇溶蛋白六胜肽类似物QXL520-PQPQLP-K(5-FAM)-NH2(FQ)(SEQIDNO:69)进行测量。每种酶在100mMpH为4的醋酸钠缓冲液中室温温育15分钟。15分钟后，加入50uL荧光底物，其最终浓度分布为100、50、25、12.5、6.25和0μM肽，对于底物浓度的所有变化保持0.05μMKumaMax^TM、0.5μMKumaWT、0.5μMSCPep和0.5μMEP-B2的浓度。立刻将滴定板放在分光光度计上读取1小时，使用455nm的激发波长并读取485nm的发射波长。

还测试了各酶对不同的二肽基序的特异性，使用了水解时释放p-硝基苯胺(pNA)的各种显色底物：[Suc-APQ-pNA]、[Suc-AQP-pNA]、[Suc-APE-pNA]和[Suc-APR-pNA]。同样，每种酶在100mMpH为4的醋酸钠缓冲液中室温温育15分钟。15分钟后，向酶温育中加入20uL底物，使底物的最终浓度分布为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625和0μM，所有测试的酶最终浓度是0.5μM。立刻将滴定板放在分光光度计上读取1小时，在385nm处模拟反应的吸光情况。

用于荧光肽的标准曲线采用在pH为4的缓冲液中混合不同浓度的底物和产物。底物浓度是100、50、25、12.5、6.25和0μM，产物浓度是20、5、1.25、0.3125、0.078125、0μM。

用于吸收肽(absorbentpeptide)的标准曲线采用在pH为4的缓冲液中稀释的100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0.1953125、0.09765625和0μM的产物浓度。

蛋白酶稳定性

在消化蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的存在下测定酶稳定性。在与每种消化蛋白酶的原生pH环境相匹配的缓冲液中温育KumaWT、KumaMax^TM、SCPep和EP-B2。使用pH为3.5的100mM醋酸钠预温育各种酶进行胃蛋白酶消化分析，使用pH为7.5的透析缓冲液进行胰蛋白酶(参见“ProteinExpressionandPurification”(蛋白质表达和纯化)消化分析。每种实验的酶在每种缓冲液中在37℃温育15分钟，浓度为0.2mg/mL。

在合适的缓冲液中预温育后，加入0.1mg/mL消化蛋白酶。反应重复三次，并在37℃温育30分钟。加入SDS，煮沸5分钟，确保消化蛋白酶灭活。利用ImageJ、SDS-PAGE凝胶实现对酶降解的定量。

在没有胃蛋白酶或胰蛋白酶的情况下，在pH为4和7.5时测定蛋白质的自水解速率。每种酶(浓度为0.2mg/mL)在pH为4的100mM醋酸钠缓冲液中和pH为7.5的透析缓冲液中进行温育。在20分钟、40分钟、60分钟的时间点取样。加入SDS，试样煮沸5分钟以确保酶变性并抑制进一步的自水解。同样，联合使用SDS-PAGE凝胶和ImageJ进行酶自水解的定量。

LCMS麦醇溶蛋白降解分析

利用高效液相色谱-质谱测定全长α9-麦醇溶蛋白的酶活性。对于每种酶，向28μL的5μM酶中添加7μL的pH为4的1M醋酸钠缓冲液，并在37℃温育并排的独立试管15分钟。接着以27μL透析缓冲液为对照，将27μL的每种酶混合物加入每个麦醇溶蛋白试管中。再次在37℃下进行温育，在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟和50分钟时取出5μL样品。每个时间点的样品在95μL的80％乙腈和1％甲酸以及大约33μM亮肽素中进行淬灭。在HPLC上分析各样品，比较随着时间不同的蛋白酶的麦醇溶蛋白降解。

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Claims

1.用于治疗口炎性腹泻的方法，包括给患有口炎性腹泻的患者施用有效量的用于治疗口炎性腹泻的一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包括选自由SEQIDNOS:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其经加工的版本组成的组中多肽的氨基酸序列，或由选自由SEQIDNOS:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种多肽包括包含了选自由SEQIDNOs:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列的一种或多种多肽，或者由选自由SEQIDNOs:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成的一种或多种多肽。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种多肽包括含有SEQIDNO:89的氨基酸序列的多肽。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括给受试者施用一定量的一种或多种其他多肽，所述多肽包括选自由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基278是Ser，残基78是Glu，残基82是Asp；

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基467是Ser，残基267是Glu，残基271是Asp。

5.根据权利要求4所述的方法，其中一种或多种其他多肽包括与SEQIDNO:1或SEQIDNO:35的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中一种或多种其他多肽包括与SEQIDNO:1或SEQIDNO:35的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其中一种或多种其他多肽包括SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:35的氨基酸序列。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中一种或多种其他多肽包括SEQIDNO:2-33或36-67中的任一种的氨基酸序列。

9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中一种或多种其他多肽包括SEQIDNO:90的氨基酸序列。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中一种或多种多肽包括SEQIDNO:75、SEQIDNO:89和/或SEQIDNO:98，或其经加工的版本。

11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其中一种或多种多肽包括SEQIDNO:74、77和/或78，或其经加工的版本。

12.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其中一种或多种多肽包括SEQIDNO:88和/或SEQIDNO:111，或其经加工的版本。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述多肽和其他多肽(当存在时)是口服给药的。

14.一种分离的多肽，选自由包括选自下述组或其经加工的版本的氨基酸序列的多肽组成的组：

(d)SEQIDNO：78；

(o)SEQIDNO：89。

15.根据权利要求14所述的分离的多肽，选自由下述组或其经加工的版本组成的组：

(i)SEQIDNO：75，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基106是D；(ii)AA残基246是S、K或G；(iii)AA残基275是D；(iv)AA残基276是S；(v)AA残基277是A、T或N；(vi)AA残基303是S；(vii)AA残基338是S；(viii)AA残基341是T或A；(ix)AA残基342是N或G；(x)AA残基345是Q或D；和(xi)AA残基352是S或H；

(ii)SEQIDNO:78；

(iii)SEQIDNO:82，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有十一个为真：(i)AA残基106是V或D；(ii)AA残基244是S、K或G；(iii)AA残基273是D；(iv)AA残基274是T；(v)AA残基275是A、T或N；(vi)AA残基301是S；(vii)AA残基336是N；(viii)AA残基339是T或A；(ix)AA残基340是N或G；(x)AA残基343是D；和(viii)AA残基350是S或H；

(iv)SEQIDNO:88，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或所有十个为真：(i)AA残基111是S、K或G；(ii)AA残基139是D；(iii)AA残基140是T或S；(iv)AA残基141是D、A、T或N；(v)AA残基164是S；(vi)AA残基199是S或N；(vii)AA残基202是T或A；(viii)AA残基203是N或G；(ix)AA残基204是Q或D；和(x)AA残基211是S或H；和

(v)SEQIDNO:89。

16.根据权利要求14或15所述的分离的多肽，包括SEQIDNO:89或其经加工的版本的氨基酸序列。

17.根据权利要求14所述的分离的多肽，包括SEQIDNO:78或其经加工的版本的氨基酸序列。

18.一种编码权利要求14-17中任一项的多肽的核酸。

19.一种核酸表达载体，包括权利要求18的分离的核酸。

20.一种重组宿主细胞，包括权利要求19的核酸表达载体。

21.一种组合物，包括：

(a)一种或多种多肽，包括选自由SEQIDNOs:74-89、95、97-99和102-111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列；和

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基278是Ser，残基78是Glu，残基82是Asp；

(i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQIDNO:34)肽；和

(ii)残基467是Ser，残基267是Glu，残基271是Asp。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中一种或多种多肽包括SEQIDNO:75、SEQIDNO:89和/或SEQIDNO:98，或其经加工的版本。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中一种或多种多肽包括SEQIDNO:74、77和/或78，或其经加工的版本。

24.根据权利要求21所述的组合物，其中一种或多种多肽包括SEQIDNO:88和/或SEQIDNO:111，或其经加工的版本。

25.根据权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中一种或多种其他多肽包括SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:35的氨基酸序列。

26.根据权利要求21-25中任一项所述的组合物，其中一种或多种其他多肽包括SEQIDNO:2-33或36-67中的任一种的氨基酸序列。

27.根据权利要求21-26中任一项所述的组合物，其中一种或多种其他多肽包括SEQIDNO:90或其经加工的版本的氨基酸序列。

28.一种药物组合物，包括权利要求14-17中任一项的分离的多肽或权利要求21-27任一项的组合物和药学上可接受的载体。

29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物配制用于口服给药。