CN105541983B

CN105541983B - pfHRP-2重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN105541983B
Application number: CN201511034789.3A
Authority: CN
Inventors: 康可人; 袁江海; 吴培钿; 才蕾; 矫丽媛; 王继华
Original assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2035-12-31
Also published as: CN105541983A

Abstract

本发明公开了一种pfHRP‑2重组蛋白及其应用，所述pfHRP‑2重组蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其可用于疟疾pfHRP‑2检测的阳性质控品。本发明所述的pfHRP‑2重组蛋白在分子结构上具有高稳定性，作为阳性质控品使用时，将质控品复溶到原体积，即可使用，可在2～40℃保存1年以上，满足运输及使用过程中对高温环境的要求；复溶后，可在2～30℃保存1个月以上，以确保重复使用。

Description

pfHRP-2重组蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，特别是涉及一种pfHRP-2重组蛋白及其在疟疾pfHRP-2检测试剂盒的阳性质控品中的应用。

背景技术

疟疾是一种由按蚊传播的寄生虫病，以发热、寒战、贫血为特征。疟原虫可分为四种(恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟)。目前全球90多个国家报道了疟疾病例，据估计全球每年发现5亿多临床病例和270多万疟疾所致死亡病例，其中恶性疟所致死亡病例最多。

检测疟疾的方法主要分三种：病理学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。其中病理学诊断(显微镜镜检)是目前公认的金标准，缺点是需要训练有素的检验技术员，敏感性较低，不是所有的实验室都能开展疟原虫镜检工作；分子生物学诊断灵敏度高于病理学诊断，但其缺点是技术复杂，设备和环境要求高、费时，不能在现场应用。

免疫学诊断通过检测高特异性的靶抗原来实现，目前公认的疟疾靶抗原主要有富组氨酸蛋白-2(Plasmodium falciparum Histidine-rich protein 2,pfHRP2)、疟原虫乳酸脱氢酶(Plasmodium Lactate Dehydrogenase,pLDH)。依照标记和检测系统的不同可分为:间接荧光抗体法(Indirect Fluorescent Antibody Test IF-AT)、酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbentassay,ELISA)、免疫层析技术等。其中基于免疫层析技术的胶体金试剂从取血、反应至结果判断，只需10～15min，而且多个样本可同时进行检测，不需特殊仪器，非常适合于疟疾高发的边远山区基层医院、卫生所防保医生和村医应用。

体外诊断试剂校准品(物)、质控品(物)是实现体外诊断试剂临床检测及监督检验结果准确一致的主要工具，也是保证量值传递的实物计量标准，如何确保检测试剂的有效性引起了FDA的关注，在2015年FDA公告中要求将质控品作为疟疾HRP 2胶体金检测试剂的必备组分之一。但就目前而言，在市面上很难购买到胶体金产品的质控品。

常规表达的pfHRP 2重组蛋白需在高碱性的缓冲情况下才可以充分溶解，而高碱的环境并不适合蛋白的活性保持，特别是在蛋白浓度低的情况下，另外高碱性的缓冲环境，并不适合胶体金检测。

疟疾流行区主要位于热带和亚热带地区，例如非洲、东南亚等。这些区域气候炎热，地理位置偏僻，经济落后。美国CTK生物技术公司的质控品采用冻干保存的形式，干粉2～30℃可保存1年，重溶后2～8℃可保存1周，其要求存储温度低于30℃，重溶后需低温保存，不适合高温环境，且重溶后稳定性差，只能保存一周时间。BinaxNOW公司的质控品采用冻干保存的形式，干粉2～8℃保存，重溶后≤-20℃保存，同样不适合高温环境。因此，开发一种能够适合高温环境的疟疾HRP-2胶体金检测的质控品显得尤为重要。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种pfHRP-2重组蛋白及其在疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品中的应用，该阳性质控品适合高温环境，具有高稳定性，用于检定试剂卡的有效性。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种pfHRP-2重组蛋白，其具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了所述pfHRP-2重组蛋白在疟疾pfHRP-2检测中作为阳性质控品的应用。

本发明还提供了一种疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品，其包含上述pfHRP-2重组蛋白。

在其中一些实施例中，所述阳性质控品还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为含有2～5wt％明胶、5～10wt％海藻糖、1～5wt％BSA、0.05～0.2wt％proClean300、0.2～1wt％吐温20的0.01～0.1M PBS。

本发明还提供了一种疟疾pfHRP-2检测试剂盒，其包含上述阳性质控品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的pfHRP-2重组蛋白是借助生物信息学软件，通过序列分析在保证pfHRP-2蛋白常见抗原表位完整的情况下，通过序列优化在改变蛋白的pI的同时，引入亲水序列进一步提高蛋白的亲水性，最终制备得到的重组蛋白在中性以及弱碱性环境下的溶解度提高，进而从分子层面上提高了蛋白的稳定性；

2、本发明的疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品含有高稳定性的pfHRP-2重组蛋白，阳性质控品为冻干制剂，使用时，将质控品用试剂盒中配套样本稀释液复溶到原体积，即可使用，可在2～40℃保存1年以上，满足运输及使用过程中对高温环境的要求；复溶后，可在2～30℃保存1个月以上，以确保重复使用。

附图说明

图1为本发明实施例1中经改造拼接前后的pfHRP-2重组蛋白序列的亲疏水性和抗原性对比图，其中图1A-B为亲疏水性对比，图1C-D为抗原性对比；

图2为本发明实施例1中经改造拼接前后的pfHRP-2重组蛋白序列的结构稳定性对比图；

图3为本发明试验例1中的胶体金标准色板；

图4为本发明试验例1中的特异性C水平的范围。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下实施例对本发明做进一步的阐述。

以下实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。

实施例1 一种pfHRP-2重组蛋白

该实施例的pfHRP-2重组蛋白，具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

该实施例的pfHRP-2重组蛋白的制备方法，包括如下具体步骤：

1、针对疟疾分布特点，选择流行株序列为模板(WHO公布的亚洲、非洲区流行株；Genbank(U69551.1))进行序列改造和拼接；在第22个氨基酸位点和第45位点增加序列HATDAHHAADAHHATDAHHAADA(该序列在抗原性能方面，涵盖了多个高频抗原特异性位点，亲水性能好)，并修饰空间结构序列；

经改造拼接前后的序列的亲疏水性和抗原性分别如图1A-B和图1C-D所示，从图1结果可以看出，插入基团提高了序列亲水性，增强了蛋白溶解性；经改造拼接前后的结构稳定性分别如图2A和图2B所示，从图2结果可以看出，新序列空间结构形成的抗原性位点增多，提高了特异性。

2、经序列改造和拼接后，纯化得到pfHRP-2重组蛋白，其具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

实施例2 一种疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品

该实施例的疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品，包括实施例1所述的pfHRP-2重组蛋白。

该实施例的阳性质控品的制备方法，包括如下步骤：

1、采用冻干保护剂(0.01～0.1M PBS，其中含2～5wt％明胶，5～10wt％海藻糖，1～5wt％BSA，0.05～0.2wt％proClean 300(sigma)，0.2～1wt％吐温20，该冻干保护剂可满足蛋白冻干以及复溶的稳定性要求)将实施例1的pfHRP-2重组蛋白进行溶解，稀释到5～0.5μg/ml，配置成冻干母液；

2、将上述冻干母液分装后进行常规真空冷冻干燥，即得本实施例的用于疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品。

本实施例制备得到的质控品冻干粉可在2～40℃保存1年以上，满足运输及使用过程中对高温环境的要求；复溶后，可在2～30℃保存1个月以上，以确保重复使用。

试验例1 实施例1的pfHRP-2重组蛋白经不同保存冻干体系处理的稳定性试验

按实施例2的相同制备方法，对经过不同保存冻干体系(即冻干保护剂)处理的pfHRP-2重组蛋白制成的质控品进行实时稳定性实验检测。

保存冻干体系为：

1#：0.01～0.1M PBS，其中含1-10mM EDTA，1-5％乳糖，0.02-0.2％NaN3,1-10％甘氨酸，1-10％新生小牛血清

2#：0.01～0.1M TBS，其中含1-10mM EDTA，1-5％乳糖，0.02-0.2％NaN3,1-10％甘氨酸，1-10％新生小牛血清

3#：0.01～0.1M PBS，其中含2～5wt％甘露醇，5～10wt％海藻糖，1～5wt％BSA，0.02-0.2％NaN3，0.2～1wt％吐温20。

4#：0.01～0.1M PBS，其中含2～5wt％明胶，5～10wt％海藻糖，1～5wt％BSA，0.05～0.2wt％proClean 300，0.2～1wt％吐温20。

5#：0.01～0.1M TBS，其中含2～5wt％明胶，5～10wt％海藻糖，1～5wt％BSA，0.05～0.2wt％proClean 300，0.2～1wt％吐温20。

操作方法为：按0.2ml/瓶，用疟疾pfHRP-2胶体金检测(wondfo公司)中配套样本稀释液进行复溶，并按0.5μg/ml终浓度蛋白量直接加样试剂条进行疟疾pfHRP-2的胶体金检测，通过判断质控线T线，结合图3所示的胶体金标准色板进行判断，若最终显色>＝C₂则提示试剂盒合格，若<C₂这表示试剂盒不合格。

以下实验结果中的数字0、1、2、3代表特异性C水平的范围，如图4所示。

1、干粉40℃实验

不同保存体系的质控品按上述操作，每个月对质控品进行一次检测，并记录实验结果；其余样品继续40℃存放，检测结果如表1所示。

表1 质控品在40℃的稳定性结果

从表1结果可知，1#、3#、4#体系质控品随着时间的延长，仍然能被试剂条检测出来，而且特异性很高；其余体系质控品活性下降。

2、冻干粉25℃实验

不同保存体系的质控品按上述操作，每个月对质控品进行一次检测，并记录实验结果；其余样品继续25℃存放，检测结果如表2所示。

表2 质控品在25℃的稳定性结果

从表2结果可知，1#、3#、4#体系质控品随着时间的延长，仍然能被试剂条检测出来，而且特异性很高；其余体系质控品活性下降。

3、冻干粉复溶后4℃实验

不同保存体系的质控品按操作复溶后，每天对质控品进行一次检测，并记录实验结果；其余样品继续室温存放，检测结果如表3所示。

表3 质控品在复溶后4℃的稳定性结果

从表3结果可知，4#体系质控品随着时间的延长，仍然能被试剂条检测出来，而且特异性很高；其余体系质控品活性慢慢下降。

4、冻干粉复溶后30℃实验

不同保存体系的质控品按操作复溶后，每天对质控品进行一次检测，并记录实验结果；其余样品继续30℃存放，检测结果如表4所示。

表4 质控品在复溶后30℃的稳定性结果

从表4结果可知，4#体系质控品随着时间的延长，仍然能被试剂条检测出来，而且特异性很高；其余体系质控品活性慢慢下降。

综合上述四个温度实验结果，选择4#保存体系作为本发明的pfHRP-2重组蛋白的保存冻干体系：0.01～0.1M PBS，其中含2～5wt％明胶，5～10wt％海藻糖，1～5wt％BSA，0.05～0.2wt％proClean 300，0.2～1wt％吐温20。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种pfHRP-2重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的pfHRP-2重组蛋白在疟疾pfHRP-2检测中作为阳性质控品的应用。

3.一种疟疾pfHRP-2检测的阳性质控品，其特征在于，其包含权利要求1所述的pfHRP-2重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的pfHRP-2检测的阳性质控品，其特征在于，所述阳性质控品还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为含有2～5wt％明胶、5～10wt％海藻糖、1～5wt％BSA、0.05～0.2wt％proClean 300、0.2～1wt％吐温20的0.01～0.1M PBS。

5.一种疟疾pfHRP-2检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求3或4所述的阳性质控品。