CN105535985A - 载药tat-cs修饰碳纳米管及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载药TAT-CS修饰碳纳米管及其制备方法和应用，载药TAT-CS修饰碳纳米管由抗肿瘤药物和TAT-CS修饰多壁碳纳米管组成，将多壁碳纳米管溶解在超纯水中，超声分散均匀后，加入抗癌药物，室温震荡过夜，加入TAT-CS溶液，室温震荡，透析，制备TAT-CS修饰的载药碳纳米管。TAT-CS对碳纳米管的修饰进一步提高碳纳米管分散性、生物安全性及细胞摄入率，由此可以提高药物生物利用度,减少药物用量，从而改善抗癌药物毒副作用大，半衰期短等问题，同时通过利用碳纳米管的光热效应进行联合治疗。本发明提供的联合疗法以同一种纳米材料作为载体和光热剂，在同样的治疗效果下，可以通过降低化疗药物的使用剂量大大降低药物对机体正常组织的毒副作用并通过合并热疗来提高治疗效果。

Description

载药TAT-CS修饰碳纳米管及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料、肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于TAT-CS修饰碳纳米管的化疗联合热疗的肿瘤杀伤方法及应用。
背景技术
过去十几年里，尽管肿瘤三大主要治疗手段：手术、放疗和化疗的治疗方法不断进步，但是癌症患者的治愈率仍然较低，并且这些传统治疗方法也存在着诸多问题，尤其是手术、放化疗对中晚期恶性肿瘤的疗效还是很不乐观，避免不了癌细胞的转移和复发，并且通常会严重降低患者的免疫力，形成恶性循环。因此，在对传统治疗方法不断完善的同时，研究者也在不断寻求新的有效的治疗方法或打破传统单一性治疗的局限而采用综合治疗措施，如化疗联合放疗，化疗联合热疗及肿瘤免疫治疗等等。尤其是肿瘤中心部分的肿瘤细胞处于缺氧状态，对放射线不敏感，放疗后不能完全被杀灭，而热疗对于这种类型的肿瘤细胞作用却特别强，可以弥补放疗或化疗的不足，联和应用提高疗效。
利用纳米技术将药物分子与载体材料组装，可解决药物的难溶性问题，提高药物在体内的循环时间，实现药物靶向递送，并可利用载体材料的光、热、pH等敏感特性，实现药物的可控释放，改善药物的功效。因此，使用有效的载体系统转运化疗药物是一种可行的靶向治疗手段，而碳纳米管在构建新型肿瘤靶向治疗体系方面，显示出了极大的应用潜能。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种载药TAT-CS修饰碳纳米管及其制备方法和应用，克服现有技术中肿瘤治疗化疗药物的使用量大，效果不理想的问题。
本发明的技术方案是：一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，由抗肿瘤药物和TAT-CS修饰多壁碳纳米管组成，其中所述TAT为HIV的TAT片段，CS为壳聚糖。
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管的制备方法，将多壁碳纳米管(MWCNTs)溶解在超纯水中，超声分散均匀后，加入抗癌药物，质量比抗癌药物：碳纳米管＝3:1～4:1，室温震荡过夜，加入TAT-CS溶液，质量比TAT-CS：碳纳米管＝4:1，室温震荡，透析，制备TAT-CS修饰的载药碳纳米管。
所述TAT-CS(TAT多肽修饰壳聚糖共聚物)溶液按如下方法合成：TAT多肽具体氨基酸序列为“N”-CYGRKKRRQRRR-“C”，在双官能偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)的作用下，将多肽上的半胱氨酸(-Cys)与低分子量壳聚糖(5000-8000)上的游离氨基(-NH2)共价交联。
所述多壁碳纳米管为原始多壁碳纳米管、羧基化多壁碳纳米管或羟基化多壁碳纳米管，多壁碳纳米管的直径<8nm，长度为0.5-2μm。
所述抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、甲胺喋呤或铂类抗癌药。
所述透析采用透析袋，在PH＝7.4的缓冲液中透析。
所述超声条件为功率60-70W，处理时间20-30min。
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管在化疗联合热疗的肿瘤杀伤中的应用，化学药物的化疗作用和碳纳米管的光热治疗作用结合治疗肿瘤。
将制得的载药碳纳米管局部注射于荷瘤鼠肿瘤内，0.05-0.2mgDOX/鼠，通过808nm激光照射肿瘤部位，功率为0.5-1W/cm2,照射时间为2-8分钟。
所述肿瘤包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌或胰腺癌。
本发明的有益效果为：本发明所采用的壳聚糖是一类具有较好水溶性、生物相容性和生物可降解性的天然高分子多糖类化合物，其具有良好的成膜性、吸附性，透气性和渗透性，可以通过表面吸附作用修饰碳纳米管，在有效提高碳纳米管分散性的同时，还能够降低碳纳米管在正常细胞中的细胞毒性。
本发明通过非共价修饰的方法将水溶性药物和TAT修饰的壳聚糖吸附于多壁碳纳米管的表面，实现了碳纳米管的修饰及药物的负载，既避免了共价连接可能对抗肿瘤药物功能的影响，也防止了对碳纳米管表面结构的破坏从而影响其光致热效应。
本发明通过实验验证了一种载药TAT-CS修饰碳纳米管的化疗联合热疗的肿瘤杀伤的应用，通过释放药物化疗和碳管热疗能够有效对肿瘤细胞起到杀伤作用，治疗肿瘤范围包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等。该研究对降低化疗药物的使用及寻找更有效的肿瘤联合治疗措施具有重要意义。
附图说明
图1为原始多壁碳纳米管和载药碳纳米管的透射电镜图；A为原始多壁碳纳米管B羧基化多壁碳纳米管C为载DOX羧基化多壁碳纳米管D为载Paclitaxel羧基化多壁碳纳米管；
图2为载药碳纳米管在不同PH条件下释放的曲线图；A为羧基化多壁碳纳米管负载阿霉素B为羧基化多壁碳纳米管负载紫杉醇；
图3为载DOX羧基化碳纳米管对细胞相互作用后的共聚焦图像；
图4为肿瘤局部给药后肿瘤组织经激光照射后温度变化图；
图5为肿瘤局部给药后化疗联合热疗抗肿瘤效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做详细说明。
实施例1
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，所述TAT多肽氨基酸序列为“N”-CYGRKKRRQRRR-“C”，所述CS为低分子量壳聚糖(5000-8000)，在双官能偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)的作用下，共价交联为TAT-CS，所述碳纳米管为原始多壁碳纳米管，纯度>98％，管径<8nm，管长0.5-2μm，将该碳纳米管加入超纯水中进行超声30min，浓度为1mg/ml。配置阿霉素(DOX)溶液，浓度为6mg/ml，将碳纳米管溶液与DOX溶液混合，质量比DOX：碳纳米管＝3:1，室温条件震荡过夜。加入TAT-CS溶液，室温震荡16h，透析袋透析过夜，连续透析两次，透析袋截留分子量3500。计算包封率和载药量。
实施例2
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，所述碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管，纯度>98％，-COOH含量为3.86％，管径<8nm，管长0.5-2μm，将该碳纳米管加入超纯水中进行超声30min，浓度为1mg/ml。配置DOX溶液，浓度为6mg/ml，将碳纳米管溶液与阿霉素溶液混合，质量比DOX：碳纳米管＝3:1，室温条件搅拌过夜。加入TAT-CS溶液，室温震荡16h，透析袋透析过夜，连续透析两次，透析袋截留分子量3500。计算包封率和载药量。
实施例3
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，所述碳纳米管为原始多壁碳纳米管，纯度>98％，管径<8nm，管长0.5-2μm，将该碳纳米管加入超纯水中进行超声30min，浓度为1mg/ml。配置紫杉醇(Paclitaxel)溶液，浓度为6mg/ml，将碳纳米管溶液与Paclitaxel溶液混合，质量比Paclitaxel：碳纳米管＝4:1，室温条件搅拌过夜。加入TAT-CS溶液，室温震荡16h，透析袋透析过夜，连续透析两次，透析袋截留分子量3500。计算包封率和载药量。
实施例4
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，所述碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管，纯度>98％，-COOH含量为3.86％，管径<8nm，管长0.5-2μm，将该碳纳米管加入超纯水中进行超声30min，浓度为1mg/ml。配置紫杉醇(Paclitaxel)溶液，浓度为6mg/ml，将碳纳米管溶液与Paclitaxel溶液混合，质量比Paclitaxel：羧基化碳纳米管＝4:1，室温条件搅拌过夜。加入TAT-CS溶液，室温震荡16h，透析袋透析过夜，连续透析两次，透析袋截留分子量3500。计算包封率和载药量。
实施例5
DOX体外释放的测定：将实施例1、2、3、4中制备的载药碳纳米管装入截留分子量为3500的透析袋中，将透析袋转入PH＝5.5和Ph＝7.4的释放介质中，磁力搅拌器中不停搅拌，前十二个小时每个小时取样一次，接下来每十二个小时取样一次，直到72小时；测量各个取样时间的吸光度值，根据标准曲线计算其中所含有的阿霉素的含量，绘制释放曲线。
实施例6
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，通过释放药物化疗和碳管热疗能够有效对肝癌肿瘤细胞起到杀伤作用。所述所述碳纳米管为原始多壁碳纳米管，所述药物为抗肿瘤药物阿霉素。具体将Bel7402细胞接种于24孔板中，接种密度为2×105个细胞/孔，培养基体积为1.5mL，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。将培养基更换成含不同浓度载药碳纳米管的新鲜培养基(DOX浓度为1-10μgmL-1)，实验分为laser照射组和无laser照射组，待加药12h后，吸弃上面培养基，加入新鲜培养基，采用808nm的近红外光，1w/cm2条件下照射细胞1-3min,然后置于37℃分别孵育24h、48h或72h。计算细胞存活率。
本实施例中的原始多壁碳纳米管以羧基化多壁碳纳米管代替，可组成新的实施例。
实施例7
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，通过释放药物化疗和碳管热疗能够有效对肝癌肿瘤细胞起到杀伤作用。所述所述碳纳米管为原始多壁碳纳米管，所述药物为抗肿瘤药物紫杉醇。具体将Bel7402细胞接种于24孔板中，接种密度为2×105个细胞/孔，培养基体积为1.5mL，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。将培养基更换成含不同浓度载药碳纳米管的新鲜培养基(紫杉醇浓度为0.5-8μgmL-1)，实验分为laser照射组和无laser照射组，待加药12h后，吸弃上面培养基，加入新鲜培养基，采用808nm的近红外光，1w/cm2条件下照射细胞1-3min,然后置于37℃分别孵育24h、48h或72h。计算细胞存活率。
本实施例中的原始多壁碳纳米管以羧基化多壁碳纳米管代替，可组成新的实施例。
实施例8
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，通过释放药物化疗和碳管热疗能够有效对乳腺癌肿瘤细胞起到杀伤作用。所述所述碳纳米管为原始多壁碳纳米管，所述药物为抗肿瘤药物阿霉素。具体将MD-MBA-231细胞接种于24孔板中，接种密度为2×105个细胞/孔，培养基体积为1.5mL，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。将培养基更换成含不同浓度载药碳纳米管的新鲜培养基(DOX浓度为1-10μgmL-1)，实验分为laser照射组和无laser照射组，待加药12h后，吸弃上面培养基，加入新鲜培养基，采用808nm的近红外光，1w/cm2条件下照射细胞1-3min,然后置于37℃分别孵育24h、48h或72h。计算细胞存活率。
本实施例中的原始多壁碳纳米管以羧基化多壁碳纳米管代替，可组成新的实施例。
实施例9
一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，通过释放药物化疗和碳管热疗能够有效对乳腺癌肿瘤细胞起到杀伤作用。所述所述碳纳米管为原始多壁碳纳米管，所述药物为抗肿瘤药物紫杉醇。具体将MD-MBA-231细胞接种于24孔板中，接种密度为2×105个细胞/孔，培养基体积为1.5mL，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。将培养基更换成含不同浓度载药碳纳米管的新鲜培养基(紫杉醇浓度为0.5-8μgmL-1)，实验分为laser照射组和无laser照射组，待加药12h后，吸弃上面培养基，加入新鲜培养基，采用808nm的近红外光，1w/cm2条件下照射细胞1-3min,然后置于37℃分别孵育24h、48h或72h。计算细胞存活率。
本实施例中的原始多壁碳纳米管以羧基化多壁碳纳米管代替，可组成新的实施例。
实施例10
裸鼠抗肝癌效应实验：待肿瘤生长至约100mm3，将裸鼠随机分成10组，分别为：游离DOX组、原始多壁碳管负载DOX组、原始多壁碳纳米管+laser组、原始多壁碳管负载DOX+laser组、对照组。分别按照肿瘤局部给药的方式给每组裸鼠打药，对照组注射等量的生理盐水。然后分别于不同时间点注射生物发光底物，观察小鼠肿瘤大小的变化，采用小鼠活体成像系统每天观察小鼠体内阿霉素的代谢情况。
本实施例中的原始多壁碳纳米管以羧基化多壁碳纳米管代替，可组成新的实施例。
本实施例中的阿霉素以紫杉醇代替，可组成新的实施例。
实施例11
裸鼠抗乳腺癌效应实验：待肿瘤生长至约100mm3，将裸鼠随机分成10组，分别为：游离DOX组、原始多壁碳管负载DOX组、原始多壁碳纳米管+laser组、原始多壁碳管负载DOX+laser组、对照组。分别按照肿瘤局部给药的方式给每组裸鼠打药，对照组注射等量的生理盐水。然后分别于不同时间点注射生物发光底物，观察小鼠肿瘤大小的变化，采用小鼠活体成像系统每天观察小鼠体内阿霉素的代谢情况。
本实施例中的原始多壁碳纳米管以羧基化多壁碳纳米管代替，可组成新的实施例。
本实施例中的阿霉素以紫杉醇代替，可组成新的实施例。
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种载药TAT-CS修饰碳纳米管，其特征在于，由抗肿瘤药物和TAT-CS修饰多壁碳纳米管组成，其中所述TAT为HIV的TAT片段，CS为壳聚糖。
2.一种载药TAT-CS修饰碳纳米管的制备方法，其特征在于，将多壁碳纳米管溶解在超纯水中，超声分散均匀后，加入抗癌药物，室温震荡过夜，加入TAT-CS溶液，室温震荡，透析，制备TAT-CS修饰的载药碳纳米管。
3.根据权利要求2所述的载药TAT-CS修饰碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述多壁碳纳米管为原始多壁碳纳米管、羧基化多壁碳纳米管或羟基化多壁碳纳米管，多壁碳纳米管的直径<8nm，长度为0.5-2μm。
4.根据权利要求2所述的载药TAT-CS修饰碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、甲胺喋呤或铂类抗癌药。
5.根据权利要求2所述的载药TAT-CS修饰碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述透析采用透析袋，在PH＝7.4的缓冲液中透析。
6.根据权利要求2所述的载药TAT-CS修饰碳纳米管的制备方法，其特征在于，所述超声条件为功率60-70W，处理时间20-30min。
7.一种载药TAT-CS修饰碳纳米管在化疗联合热疗的肿瘤杀伤中的应用，其特征在于，化学药物的化疗作用和碳纳米管的光热治疗作用结合治疗肿瘤。
8.根据权利要求7所述的载药TAT-CS修饰碳纳米管在化疗联合热疗的肿瘤杀伤中的应用，其特征在于，将权利要求2制得的载药碳纳米管局部注射于荷瘤鼠肿瘤内，0.05-0.2mgDOX/鼠，通过808nm激光照射肿瘤部位，功率为0.5-1W/cm2,照射时间为2-8分钟。
9.根据权利要求7所述的载药TAT-CS修饰碳纳米管在化疗联合热疗的肿瘤杀伤中的应用，其特征在于所述肿瘤包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌或胰腺癌。
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