CN105524908A - 一种与(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白及其应用 - Google Patents

一种与(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明一种与(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白及其应用，属于分子生物学领域。本发明提供的蛋白，是具有如SEQ？ID？NO2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明的实验证明，本发明得到立马豆(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶的cDNA核酸序列及(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶编码蛋白序列，大肠杆菌中表达的(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶蛋白具有FPP合成活性，可应用于化合物的生物合成和通过转基因技术提高水稻、玉米和蔬菜等农作物抗虫性。

Description

一种与(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白，编码其的基因及其应用。
背景技术
植物的间接防御反应是在玉米上首次发现的，这种防御反应的特点是被植食性昆虫取食之后，植物依靠特异性挥发物的释放来吸引昆虫的天敌，从而达到防御植食性昆虫的目的。许多植物在被植食性昆虫取食之后可以提高特异性挥发物释放的量，一些植食性昆虫诱导的挥发物可以吸引植食性昆虫的天敌(捕食性或寄生性)，这些挥发物就成为植物间接防御的媒介(信号)物质，所以植物间接防御研究的核心是植物特异性的挥发性信号物质及其调控机制。相对于已经有一定研究基础的生态方面的研究，植物间接防御反应在分子生物学方面的研究还很薄弱。利用分子生物学技术以及转基因技术研究植物特异性的挥发物可以最大程度的去除背景干扰，容易地找到植食性昆虫诱导后表达量特异性上升的挥发物。目前植物间接防御反应在分子生物学方面的研究主要进行以下两方面：一方面是有多少基因直接参与植食性昆虫诱导后，植物特异性挥发物的生物合成；另一方面是这些基因怎样调控挥发物的合成，产物是什么以及这些产物具有什么样的作用。
植物萜烯(单萜烯、倍半萜烯、双萜烯)类化合物是植物在被植食性昆虫诱导后最常见，最多样的植物挥发物类群。一些特定种类的萜烯化合物在植物间接防御方面的功能，已经通过人工合成标准化合物，从生态学方面进行了研究。在基因水平上，从调控植物萜烯合成酶基因的表达出发，也验证了部分萜烯化合物在植物间接防御方面的功能。所有的萜烯化合物都是由萜烯合成酶调控合成的，萜烯合成酶是合成植物萜烯类挥发物末端合成酶。因此，研究萜烯合成酶以及萜烯合成酶基因对于确定植食性昆虫诱导的植物特异性挥发物具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种与萜烯类化合物合成相关的蛋白及其编码基因。
一种与萜烯类化合物合成相关的蛋白，具有SEQIDNO2所述的氨基酸序列。
所述萜烯类化合物为(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。
上述蛋白的编码基因。
所述编码基因具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列或SEQIDNO1中第60-1820位核苷酸序列。
含有上述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。
上述重组载体为将上述编码基因插入到表达载体中，得到表达所述蛋白的载体。
所述编码基因具有SEQIDNO1所述的序列，该序列插入表达载体pET28a的XhoI和NcoI间。
上述重组菌为将上述的重组载体导入目的菌得到的重组菌，所述目的菌具体为大肠杆菌。
上述蛋白或上述编码基因或上述重组载体或上述的重组菌在合成萜烯类化合物中的应用。
上述应用中，上述萜烯类化合物为(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。
本发明的实验证明，本发明得到的立马豆(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶基因在大肠杆菌中表达具有FPP合成活性，可催化前体化合物法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)合成(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。表明立马豆(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶的编码区序列可应用于化合物的生物合成和通过转基因技术提高水稻、玉米和蔬菜等农作物抗虫性的研究。
本发明得到的立马豆(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶基因具有1)由序列表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者2)将序列表中SEQIDNO2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与萜烯类化合物合成相关蛋白的由1)衍生的蛋白质。上述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQIDNO2所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表2所示的标签的编码序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。
上述编码基因为1)-4)中任一一种:
1)序列表中SEQIDNO1所示的DNA分子；
或2)序列表中SEQIDNO1自5’末端第60-1820位核苷酸所示的DNA分子；
或者3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码与萜烯类化合物合成相关蛋白的DNA分子；
或者4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与萜烯类化合物合成相关蛋白的DNA分子。
附图说明
图1.立马豆car/humu基因的PCR扩增
M：DNA分子量标准(D2000)；P：PCR产物
图2.重组质粒pet28a-car/humu的PCR鉴定
其中M：DNA分子量标准(D2000)；P：PCR产物
图3.pET28a-cary/humu纯化的SDS电泳图
M:蛋白Maker,1-2:pET28a-cary/humu经IPTG诱导后的上清和包涵体3:纯化到的的pET28a-cary/humu蛋白。
图4.融合蛋白car/humu合成酶体外酶活产物的GC-MS分析。
其中A:以FPP底物的18.26min的酶活产物；B:(E)-β-石竹烯标样18.26min的质谱图；C:以FPP为底物的18.74min的酶活产物；D:(E)-a-律草烯标样的18.74min的质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶购自NEB公司，高保真酶pfu、T-easy载体、大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，总RNA的提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，底物FPP(ProductNumber:F6892)和二氯甲烷等其他化学试剂均购自sigma公司，其他化学试剂为国产分析纯，引物和测序均由北京华大基因完成。
实施例一、cary/humu合成酶基因的克隆
1、立马豆总RNA的提取和cDNA的合成
立马豆的总RNA的提取参照天根生化科技有限公司RNAsimple总RNA提取试剂盒中的说明手册提取。琼脂糖凝胶电泳检测并通过NanoDrop测定浓度。cDNA第一链的合成采用TAKATA公司的primerscriptTM1ststrandcDNASynthesisSystem反转录试剂盒，方法参照试剂盒中的说明手册。同时，为了获得基因全长，用SMARTerTMRACEcDNA扩增试剂盒，进行cDNA的合成，方法参照试剂盒中的说明手册。
2、引物设计与基因克隆
根据葡萄的(E)-β-石竹烯合成酶序列(AEP17005.1)，在菜豆基因组网站http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#；！info？alias＝Org_PvulgarisV1.0上进行blast，获得立马豆TPS基因部分保守序列。用primer5.0分别设计5'及3'RACE引物，通过RACE扩增得到全长序列5RACEprimer1:CAGTGGGTCGAGTAAAGGGAGGT；
5RACEprimer2:AAGCCTCCCTTAGACATGGTTTG；
3RACEprimer1:ATAAATGATGCATGCTTAGCTCCTA；
3RACEprimer2:GCAGGAGGCATAATGAAAGATCATA，
引物由北京华大基因公司合成。通过巢氏PCR获得基因全长。
立马豆种子，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。
以立马豆的cDNA为模板，通过RACE扩增，得到1892bp的PCR产物(图1),含59的5'UTR和72的3'UTR序列。目的片段利用TA克隆的方法连接到T-easy载体(购自北京全式金公司)后，构建成T-(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶测序载体，经过测序(见SEQIDNO1)，该1892bp的PCR产物含有的基因编码区位于第60-1820位，将该基因命名为cary/humu合成酶，该基因编码的蛋白命名为cary/humu；该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQIDNO2，共586个氨基酸。经过序列比对，cary/humu合成酶与苜蓿MtTPS3核苷酸的相似性为50％。
cary/humu测序载体为将序列表中的序列1插入T-easy载体得到的载体。
实施例二、cary/humu合成酶在合成萜烯类化合物(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯中的应用
1、载体构建
以cary/humu合成酶测序载体为模板，利用高保真酶TranStartFastPfuDNAPolymerase及引物cary/humuF5'-GCCAGTGTGATGGATATCTGCA-3')/cary/humuR(5'-GCTACGAGCTCGGATCCACTAG-3')，得到1859bp的带有A末端的目的片段(具有序列表中SEQIDNO1的核苷酸)。将上述带有A末端的目的片段参照全式金生物有限公司pEASY-ElExpressionKit说明书与载体pEASY-El连接，得到的连接产物转入普通大肠杆菌后涂于含Amp(50mg/ml)的LB平板上过夜培养。
挑取单克隆利用T7F(5’-TAATACGACTCACTATA-3')及目的基因下游引物NESR进行检测，得到阳性克隆(图2)。将阳性克隆提取质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列1自5’末端第60-1820位核苷酸利用TA克隆的方法插入载体pET28a的XhoI和NcoI酶切位点酶切位点间得到的载体，命名为pET28a-cary/humu。
将pET28a-cary/humu转化BL21(DE3)感受态细胞，转化过程见全式金生物有限公司BL21(DE3)ChemicallyCompetentCell说明书，得到BL21(DE3)/pET28a-cary/humu合成酶,将BL21(DE3)/pET28a-cary/humu利用T7F及目的基因下游引物进行PCR检测,证明pET28a-cary/humu已转入大肠杆菌中。
2、cary/humu合成酶蛋白的诱导表达、分离及纯化
将BL21(DE3)/pET28a-cary/humu在加入lμM的IPTG的LB培养基中培养，条件为16℃180rpm、诱导12h，得到培养产物，将培养产物于4℃,1000rpm离心l0min收集上清液。
将上清液利用AKTAFPLCsystem(Amersham)，HiLoad_16/60_superdex_75_prep_grade(global)分子筛预装柱分离纯化4m1上样环，洗脱流速:lml/min，每lml收集一次；洗脱液50mMNa2HPO4,300mMNaC1,250mMimidazole,NaOH调pH至8.0，经SDS-PAGE检验后获得纯化cary/humu合成酶蛋白(为收集2柱体积的洗脱液)(图3)。
3、cary/humu合成酶蛋白酶活性鉴定
利用蛋白超滤膜离心管，将收集2柱体积的洗脱液(纯化cary/humu合成酶蛋白)用pH为7.0,50mMPBS(通过将39m10.2M的NaH2PO4、与61m10.2M的Na2HPO4、混匀后获得)置换，并将蛋白浓缩4μg/ml。为防止有机溶剂的污染，以下均采用玻璃器皿。按照表1的体系进行反应，体系1mL,37℃,30min，得到反应产物。以水替代纯化cary/humu合成酶蛋白作为对照。
表1为cary/humu合成酶蛋白酶活性鉴定反应体系
反应结束后，每个样品瓶子中加入500μ1的二氯甲烷，涡旋lmin，冰上放置30min,抽提产物。小心吸取上清至新的玻璃瓶中，利用稳定的氮气流(14PSI)吹到只剩2u1(约5min)，加入10μ1的二氯甲烷，待用。
取lμl样品进样，利用气质联用系统GC-MS(HP6890/HP5973,Hewlett-Packard公司)，色谱柱HP-5MS(60m×250μm×0.25μm；Hewlett-Packard公司),GC-MS仪器进行分析。升温程序为:40℃保持1min，以5min5℃的增量升到250℃(1℃/min)，最后250℃保持17min。MS检测范围为40-550,温度为170℃。
GC-MS检测两组的反应产物，结果如图4示(A)(E)-β-石竹烯标样的出峰时间(18.26min)和质谱图；(B)cary/humu合成酶蛋白催化FPP产物的出峰时间(18.26min)和质谱图；(C)(E)-a-律草烯标样的出峰时间(18.74min)和质谱图；(D)cary/humu合成酶蛋白催化FPP产物的出峰时间(18.74min)和质谱图。通过和标样的出峰时间和质谱图对比，说明纯化cary/humu合成酶蛋白可催化法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)合成(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。

Claims (10)

1.一种与萜烯类化合物合成相关的蛋白，具有SEQIDNO2所述的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋的，所述萜烯类化合物为(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。
3.权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列或SEQIDNO1中第60-1820位核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述的编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。
6.权利要求5所述的重组载体，为将权利要求3或4所述的编码基因插入到表达载体中，得到表达所述蛋白的重组载体。
7.根据权利要求6所述的重组载体，所述编码基因具有SEQIDNO1所述的序列，该序列插入表达载体pET28a的XhoI和NcoI间。
8.权利要求5所述的重组菌，为将权利要求6或7所述的重组载体导入目的菌得到的重组菌，所述目的菌具体为大肠杆菌。
9.根据权利要求1或2所述的蛋白或权利要求3或4所述编码基因或权利要求5-8任一重组载体或重组菌在合成萜烯类化合物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述萜烯类化合物为(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。
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