CN105520927A - 丹酚酸b纳米制剂的用途 - Google Patents

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李宏权
刘伟
周曾同
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Abstract

本发明公开了一种丹酚酸B纳米制剂的新用途，可比单纯丹酚酸B更明显抑制头颈肿瘤鳞状细胞癌细胞和口腔黏膜白斑细胞的生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡的用途。具体为丹酚酸B纳米制剂抑制HN13、HN30和Leuk1细胞生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡的用途。这为预防或治疗口腔头颈肿瘤或口腔黏膜白斑病症提供一种新的药物。

Description

丹酚酸B纳米制剂的用途
技术领域
本发明涉及一种丹酚酸B纳米制剂的新用途。
背景技术
丹酚酸B是丹参主要水溶性有效成分之一，又称为丹参酸B。丹酚酸B(SalvianolicacidB，SalB)是一种具有如下结构式所示的的化合物，可从唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根中提取获得，产品外观为棕黄色干燥粉末，味微苦、涩，可溶于水、乙醇或甲醇等溶液
丹酚酸B作为丹参中的主要水溶性成分，在治疗心血管疾病、慢性肝炎、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等方面发挥着重要作用。现代中医药将丹参药物制备成各种剂型药物，如胶囊、滴丸、片剂或注射剂等，用于活血化瘀、理气止痛、因瘀血阻滞经络所致缺血性中风、虚弱无力、拘挛疼痛或运动不遂，口眼歪斜等病症。
发明内容
本发明的目的是提供一种丹酚酸B纳米制剂抑制头颈肿瘤细胞系HN13和HN30及白斑细胞系Leuk1的生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡的用途，为预防或治疗口腔头颈肿瘤或口腔黏膜白斑病症提供一种新的药物。
本发明采用丹酚酸B纳米制剂技术促进细胞对药物的摄取率，所述丹酚酸B纳米制剂如文献QiangPeng,Zhi-RongZhang,XunSun,JiaoZuo,DongZhao,andTaoGong.MechanismsofPhospholipidComplexLoadedNanoparticlesEnhancingtheOralBioavailability[J].MolecularPharmaceutics.2010.VOL.7,NO.2,565–575中公开方法制备获得或其他现有技术公开方法制备获得。
本发明将通过激光共聚焦显微镜观测单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)对Leuk1、HN13和HN30细胞定性摄取的差异。
荧光分光光度计分析研究单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)对Leuk1、HN13和HN30细胞定量摄取的差异。
MTS方法研究比较单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)对Leuk1、HN13和HN30细胞增殖抑制作用的差异。
同时用流式细胞仪来分析比较单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)对Leuk1、HN13和HN30细胞周期阻滞作用的差异及诱导细胞凋亡作用的差异。
附图说明
图1激光共聚焦显微镜观测细胞定性摄取示意图。
图2荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图。
图3MTS方法检测观察药物对细胞增殖抑制作用示意图。
图4流式细胞仪检测分析细胞周期阻滞作用示意图。
图5AnnexinV-PI实验细胞凋亡率示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域公知的或常用的，若未特别指明，本发明实施例中所用的试剂或实验材料均可市售获得。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
本发明实施例中所使用的细胞分别为头颈肿瘤细胞系HN13和HN30细胞和白斑细胞系Leuk1细胞。
实施例1：
细胞培养液成分及含量为：HN13和HN30用DMEM培养液(型号C40306，购于上海源培生物科技股份有限公司)培养，每瓶500ml的培养液加入50ml的胎牛血清(Gibco,USA,26140-079)，并加入青霉素和链霉素浓度均为100units/ml；Leuk1用K-SFM培养液(GIBCO,GrandIsland,NY,USA)培养，使用前加入1支产品包装中的表皮生长因子，避光4℃冰箱保存。
将HN13、HN30和Leuk1细胞接种于有细胞爬片的24孔板中，24h后待细胞贴壁，更换含药物浓度为200μg/ml的单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)的培养液，分别作用HN13、HN30和Leuk1细胞2h，采用激光共聚焦显微镜观测细胞定性摄取的差异。
结果如图1所示：
图A表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养HN13细胞2h，采用激光共聚焦显微镜观测细胞定性摄取示意图；
图B表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养HN30细胞2h，采用激光共聚焦显微镜观测细胞定性摄取示意图；
图C表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养Leuk1细胞2h，采用激光共聚焦显微镜观测细胞定性摄取示意图。
将含SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度为200μg/ml培养液作用于HN13细胞培养2h后，激光共聚焦显微镜直观显示后者胞质中有更明显的荧光团。
实施例2：
将HN13、HN30和Leuk1细胞接种于96孔板中，待24h后细胞贴壁，更换含单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)药物浓度梯度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的培养液，分别作用于HN13、HN30和Leuk1细胞培养中于5min、10min、20min、30min、60min和120min时间点，采用荧光分光光度计分析细胞定量摄取的差异。
结果如图2所示：
图A表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量分别为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的培养液，培养HN13细胞2h时，荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图；
图B表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养HN13细胞5min、10min、20min、30min、60min和120min时，荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图；
图C表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量分别为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的培养液，培养HN30细胞2h时，荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图；
图D表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养HN30细胞5min、10min、20min、30min、60min和120min时，荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图；
图E表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量分别为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的培养液，培养Leuk1细胞2h时，荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图；
图F表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养Leuk1细胞5min、10min、20min、30min、60min和120min时，荧光分光光度计分析细胞定量摄取作用示意图。
含SalB-PLC-NPs药物浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml培养液作用于HN13细胞培养；药物浓度为200μg/ml培养液作用于HN30细胞培养，药物浓度为25μg/ml和200μg/ml培养液作用于Leuk1细胞培养，荧光分光光度计分析显示比含同浓度的SalB-Free药物培养的细胞，前者细胞质中有更强的荧光分光光度值，即定量说明前者细胞摄取了更多的SalB纳米剂型，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001细胞内荧光具有统计学差意义。
实施例3：
设立SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物处理组药物浓度梯度为：25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml；同时设立阴性空白对照组。
将含有上述不同组别及不同药物浓度的细胞培养液，分别加入96孔板中37℃下培养HN13、HN30和Leuk1三种细胞。在细胞培养24h、48h、72h和96h四个时间点通过MTS方法检测观察药物细胞增殖抑制作用的差异。
结果如图3所示：
图A、B表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液及空白对照组，培养HN13细胞在24h、48h、72h和96h四个时间点通过MTS方法检测观察药物对细胞增殖抑制作用的示意图；
图C、D表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为100μg/ml的培养液及空白对照组，培养HN30细胞在24h、48h、72h和96h四个时间点通过MTS方法检测观察药物对细胞增殖抑制作用的示意图；
图E、F表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液及空白对照组，培养Leuk1细胞在24h、48h、72h和96h四个时间点通过MTS方法检测观察药物对细胞增殖抑制作用的示意图。
与阴性对照组相比，SalB-Free和SalB-PLC-NPs抑制细胞增殖均有统计学差异；与SalB-Free组相比，将含SalB-PLC-NPs药物浓度为200μg/ml、100μg/ml的培养液分别培养HN13、HN30细胞时，在48h、96h抑制增殖明显强于SalB-Free组，P＜0.001；含SalB-PLC-NPs药物浓度为200μg/ml的培养液培养Leuk1细胞时，在96h抑制增殖明显强于SalB-Free组的趋势。
实施例4：
将HN13、HN30和Leuk1细胞接种于10cm细胞培养皿中，待24h后细胞贴壁，更换含药物浓度为200μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)或丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)的培养液，分别作用HN13、HN30和Leuk1细胞24h、48h、48h。采用流式细胞仪分析比较单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)对HN13、HN30和Leuk1细胞周期阻滞作用的差异及诱导细胞凋亡作用的差异。
结果如图4所示：
图A、B表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养HN13细胞在24h后流式细胞仪检测分析细胞周期阻滞作用示意图；
图C、D表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为100μg/ml的培养液，培养HN30细胞在48h后流式细胞仪检测分析细胞周期阻滞作用示意图；
图E、F表示SalB-Free和SalB-PLC-NPs药物浓度含量为200μg/ml的培养液，培养Leuk1细胞在48h后流式细胞仪检测分析细胞周期阻滞作用示意图。
含SalB-PLC-NPs药物浓度为200μg/ml、100μg/ml的培养液分别作用HN13和HN30细胞24h、48h后，细胞静止期，对两者周期阻滞比SalB-Free更明显；细胞增殖期，对两者增殖抑制比SalB-Free更明显；含SalB-Free药物浓度为200μg/ml的培养液作用Leuk1细胞48h后，细胞静止期，对其周期阻滞比SalB-PLC-NPs更明显；细胞增殖期，SalB-Free抑制其增殖比SalB-PLC-NPs更明显。
实施例5：
将HN13、HN30和Leuk1细胞接种于6孔板中，待24h后细胞贴壁，更换含药物浓度为200μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)或丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)的培养液，分别作用HN13、HN30和Leuk1细胞24h和48h两个时间点。采用流式细胞仪分析(AnnexinV-PI凋亡实验)比较单纯药物丹酚酸B(SalB-Free)和丹酚酸B纳米制剂(SalB-PLC-NPs)对HN13、HN30和Leuk1诱导细胞凋亡作用的差异。
结果如图5所示(AnnexinV-PI凋亡实验)：
与含SalB-PLC-NPs药物浓度为200μg/ml的培养液相比，含同浓度的SalB-Free的培养液，诱导HN13细胞24h后，早、晚期和总的细胞凋亡率都略明显高；诱导48h后，两者差异不明显。
另外，实验中还发现，含SalB-Free药物浓度为100μg/ml的培养液，诱导HN30细胞24h后，细胞凋亡率与SalB-PLC-NPs没有差异；诱导48h后，与含同浓度的SalB-PLC-NPs药物培养液相比，早期阶段细胞更易凋亡；晚期阶段没有差异。
含SalB-Free药物浓度为200μg/ml的培养液，诱导Leuk1细胞24h后，细胞凋亡率比含同浓度的SalB-PLC-NPs药物培养液更明显；诱导48h后，细胞凋亡率比含同浓度的SalB-PLC-NPs药物培养液更明显。两项结果均与药物抑制实验相符。应当说明的是，虽然本发明以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种丹酚酸B纳米制剂的用途，其特征在于能抑制头颈肿瘤细胞生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于能剂抑制HN13、HN30和Leuk1细胞生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于用于预防或治疗口腔头颈肿瘤或口腔黏膜白斑病症。
4.如权利要求1-3所述的用途，其特征在于纳米制剂药物浓度为25-200μg/ml抑制HN13、HN30和Leuk1细胞生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡。
5.如权利要求1-3所述的用途，其特征在于纳米制剂药物浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或200μg/ml抑制HN13、HN30和Leuk1细胞生长、阻滞细胞增殖周期及促进细胞凋亡。
6.一种具备如权利1-3所述用途的丹酚酸B纳米制剂，其特征在于可用于预防或治疗口腔头颈肿瘤或口腔黏膜白斑病症药物中。
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