CN105519522B - 一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，依次包括：乌桕茎尖剥取、预培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤。本发明具有长期安全、稳定可靠、简单有效的保存乌桕优良种质资源的方法，超低温保存后乌桕茎尖成活率高达40％，茎尖再生率为37.8％的优点。

Description

一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法
技术领域
本发明涉及的是一种低温保存技术领域的方法，具体涉及一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法。
背景技术
乌桕(SapiumsebiferumRoxb.)与油桐、油茶、核桃并列为我国四大木本油料植物。为大戟科(Euphorbiaceae)乌桕属(Sapium)落叶乔木，为我国原生油料树种，在中国已有1400年的栽培史。乌桕种子外被蜡质，可用于制作肥皂、蜡烛和油漆等工业生产的原料；种子含油量高达55％,种仁榨取的液体油可作为制取生物柴油的原料，是一种有前景的生物能源树种。乌桕树姿优美，叶形秀丽，入秋后叶色呈现红、橙、黄、紫等颜色，可作庭院及行道绿化树种。此外，由于乌桕具有较强的适用性，能在各种土质的土壤生长，具有有较强的耐寒、耐旱、耐涝和耐盐碱的能力，为很有前景的荒山滩涂树种。因此，乌桕无论是作为油料用经济作物，景观树种还是荒山滩涂树种，均具有重要的经济和生态价值。
种质资源保存是乌桕育种和保持遗传多样性的重要保证，培育高产、优质和高抗新品种离不开丰富的种质资源，因此开展乌桕种质资源的保存具有重要的意义。
目前有关乌桕种质资源的保存方法的研究较少，主要集中在原地栽培、迁地栽培以及种子库保存，但原地和迁地栽培管理和取材需要大量的人力、物力，且保存的种质资源占地面积大，易受到病虫害和自然条件的影响。由于乌桕为异花授粉植物，种子高度杂合，种子库保存很难保持母本株系的优良特性。随着生物技术的发展，基于利用植物组织培养技术对乌桕种质资源进行保存的研究仅局限于在实验室中对研究材料的保存。一方面保存过程繁琐、费时费力，成本较高；另一方面，随着保存时间的延长和继代次数的增加，保存的材料易受到污染的干扰。
超低温保存技术是20世纪70年代在低温保存的基础上发展起来的一门新兴技术。超低温保存通常以液氮(-196℃)为冷源，生物材料保存在如此低温条件下，活细胞内的代谢活动几乎完全停止，因而可使生物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，且保存过程中细胞的活力及形态发生的全能性不受影响。因其具有操作简单，可保存时间长，占用空间小且不受病虫害的干扰等优点，是目前公认的长期而稳定的保存植物种质资源的理想方法。现已开发出多种超低温保存的方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同品种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同。目前有关利用超低温保存技术对乌桕种质资源进行保存的研究尚未见报道。
发明内容
本发明针对乌桕现有保存技术的不足，提供了一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，为乌桕优良种质资源的保存提供了技术保证。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明涉及一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，依次包括：乌桕茎尖剥取、预培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤。
优选地，所述的乌桕茎尖剥取具体是指：在无菌条件下，从乌桕植株茎段诱导的不定芽丛上剥取带有2-3个叶原基，直径大小约为2-3mm的离体茎尖。
优选地，所述的预培养是指：将剥取的茎尖接种于添加有0.2-0.5M蔗糖的MS固体培养上，于25±2℃的恒温培养室黑暗培养1-5d。
优选地，所述的装载具体是指：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理10-60min；所述的装载液的组成为：MS+2M甘油+0.4M蔗糖。
优选地，所述的玻璃化处理具体是指：将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理1-4h；所述的PVS2溶液的组成为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖。
优选地，所述的小液滴制作具体是指：将PVS2处理后的茎尖转移到铝箔条上,并向每个茎尖滴加8-10μL PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放5-6个茎尖。
优选地，所述的超低温冷冻保存具体是指：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存。
优选地，所述的卸载是指：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进行解冻和洗涤；所述的卸载液的组分为：MS+1.2M蔗糖；所述的卸载和洗涤条件为：室温下洗涤茎尖2-3次，每次洗涤时间5-10min。
优选地，所述的恢复培养具体是指：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；所述的恢复培养基为MS+0.5-2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；所述的恢复培养条件为：25±2℃的恒温培养室黑暗培养7d,最后转至光照强度为40μmolm-2s-2,光照时间为14h的条件下进行植株再生。
与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：
本发明的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存乌桕优良种质资源的方法，超低温保存后乌桕茎尖成活率高达40％，茎尖再生率为37.8％；本发明以不定芽茎尖为超低温保存材料，一方面取材方便，另一方面由于茎尖含有茎尖分生组织，细胞再生能力较强，遗传稳定性高；此外，在利用茎尖对乌桕种质资源进行超低温保存的同时可获得脱病毒植株，是一种很有前景的乌桕植株脱毒新技术。
附图说明
图1用于超低温保存的乌桕丛生芽茎尖
图2包埋于小液滴置于铝箔条上的茎尖
图3超低温保存后恢复培养14d坏死的茎尖
图4超低温保存后恢复培养14d存活的茎尖
图5超低温保存后恢复培养30d诱导出不定芽的茎尖
图6恢复培养后茎尖丛生芽的伸长
图7乌桕超低温保存茎尖诱导丛生芽的生根
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，具体操作如下：
1)、选取于不定芽诱导培养基上诱导30d的乌桕茎段不定芽丛，剥取直径为2～3mm，带有2-3个叶原基的茎尖(图1)；
2)、将剥下的乌桕茎尖接种在0.3M蔗糖的MS固体培养接种，于25±2℃的恒温培养室黑暗预培养2d；
3)、将预培养的离体茎尖转接于装载液MS+2M甘油+0.4M蔗糖中，于室温下装载处理20min；
4)、将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理4h；其中PVS2溶液的组成为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖；
5)、将PVS2处理后的茎尖转移到铝箔条上，并向每个茎尖滴加8～10μL PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放5个茎尖(图2)，或者是4、6个茎尖；
6)、将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接进入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存；
7)、将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于成分为MS+1.2M蔗糖的卸载液中进行解冻和洗涤；其中卸载和洗涤条件为：室温下洗涤茎尖2-3次，每次洗涤时间5-10min；
8)、将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；其中恢复培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；恢复培养条件为：25±2℃的恒温培养室黑暗培养7d，最后转至光照强度为40μmolm-2s-2，光照时间为14h的条件下进行植株再生。恢复培养14d后，成活的茎尖表现为黄绿色或绿色(图3)，而死亡的茎尖表现为白色或褐色(图4)；培养30d后，成活的茎尖开始膨大并进一步诱导出不定芽(图5)；继续培养30d后，不定芽伸长(图6)；然后转接于生根培养基中进行生根，获得健壮的乌桕无菌苗(图7)。
实施例2
一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，具体操作如下：
测试了预培养基中蔗糖浓度和预培养时间对乌桕茎尖超低温保存的影响：仅改变预培养基中的蔗糖浓度和预培养时间，将剥下的乌桕茎尖分别接种在含有0.2,0.3,0.4,0.5M蔗糖的MS固体培养基中，于25±2℃的恒温培养室黑暗预培养1-5d，其余步骤同实施例1。恢复培养30d后统计乌桕茎尖的成活率和再生情况。结果表明预培养基中蔗糖浓度和预培养时间对乌桕茎尖保存后的成活率和再生率均有重要的影响。茎尖的成活率和再生率随着预培养基中的蔗糖浓度和预培养时间的变化呈现先升后降的趋势(表1和表2)。当蔗糖浓度为0.3-0.4M时，预培养时间为2-3d时，茎尖的成活和再生效果较好，成活率和再生率分别高达35.6％和33.3％。
表1 预培养基中蔗糖浓度对乌桕茎尖超低温保存的影响
注：数据为平均数±标准误，每个处理包含20个外植体，每个处理重复三次。其中预培养时间为2d。
表2 预培养时间对乌桕茎尖超低温保存的影响
注：数据为平均数±标准误，每个处理包含20个外植体，每个处理重复三次。其中预培养基中蔗糖的浓度为0.3M。
实施例3
一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，于0℃处理0，1,1.5,2.0，2.5,3,4h，其余步骤同实施例1。恢复培养30d后统计乌桕茎尖的成活率和再生情况。结果表明PVS2处理时间是影响乌桕茎尖超低温保存成活率的关键因素。研究结果表明不经过PVS2处理的乌桕茎尖超低温保存后成活率和再生率均为0％。随着PVS2处理时间的增加，乌桕茎尖超低温保存的成活率和再生率逐渐最高；当PVS2处理时间为90min时,可获得最高的成活率和再生率，分别为40％和37.8％。之后随着PVS2处理时间的增加，茎尖的成活率和再生率逐渐下降(表3)桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，具体操作如下：
测试了玻璃化处理时间即PVS2处理时间对乌桕茎尖超低温保存的影响：仅改变乌桕茎尖玻璃化处理的时间，将加载后的乌桕茎尖分别接种在PVS2溶液中。
表3 PVS2处理时间对乌桕茎尖超低温保存的影响
注：数据为平均数±标准误，每个处理包含20个外植体，每个处理重复三次。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，依次包括：乌桕茎尖剥取、预培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤；
所述的预培养是指：将剥取的茎尖接种于添加有0.2-0.5M蔗糖的MS固体培养上，于25±2℃的恒温培养室黑暗培养1-5d；
所述的装载具体是指：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理10-60min；所述的装载液的组成为：MS+2M甘油+0.4M蔗糖；
所述的玻璃化处理具体是指：将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理1-4h；所述的PVS2溶液的组成为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖；
所述的卸载是指：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进行解冻和洗涤；所述的卸载液的组分为：MS+1.2M蔗糖；所述的卸载和洗涤条件为：室温下洗涤茎尖2-3次，每次洗涤时间5-10min；
所述的恢复培养具体是指：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；所述的恢复培养基为MS+0.5-2.0mg/L6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；所述的恢复培养条件为：25±2℃的恒温培养室黑暗培养7d,最后转至光照强度为40μmolm-2s-2,光照时间为14h的条件下进行植株再生。
2.根据权利要求1所述的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，所述的乌桕茎尖剥取具体是指：在无菌条件下，从乌桕植株茎段诱导的不定芽丛上剥取带有2-3个叶原基，直径大小约为2-3mm的离体茎尖。
3.根据权利要求1所述的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，所述的小液滴制作具体是指：将PVS2处理后的茎尖转移到铝箔条上,并向每个茎尖滴加8-10μLPVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放5-6个茎尖。
4.根据权利要求1所述的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，所述的超低温冷冻保存具体是指：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存。
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