CN105483203A - 一种测定物质抗氧化活性的方法 - Google Patents

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李红玉
马晓燕
郑丽芳
包艳芳
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Abstract

本发明公开了一种测定物质抗氧化活性的方法，及其该抗氧化活性测定方法在药品、食品及其保健品研究方面的应用，属于药品、食品及其保健品研究领域。该方法采用大肠杆菌标准菌株为实验模型，以过氧化氢为自由基引发剂，处理对数生长期的大肠杆菌，使之处于氧化应激状态。外源性引入抗氧化剂，验证抗氧化剂对细菌氧化应激的保护作用。本发明在操作上简单易行，对设备要求不高，成本低廉，具有很高的应用价值。

Description

一种测定物质抗氧化活性的方法
技术领域
本发明涉及一种测定物质抗氧化活性的方法，具体涉及该测定物质抗氧化活性的方法在药品、食品及其保健品研究方面的应用，属于药品、食品及其保健品研究领域。
背景技术
机体自由基过量(氧化应激，Oxidativestress)可以引起生物膜脂质、蛋白质和DNA的氧化性损伤，导致癌症、衰老、动脉硬化以及多种老年慢性疾病。
抗氧化剂能够通过干扰活性氧自由基链锁反应的启动和蔓延，最终阻断自由基反应过程，起到有效减少氧自由基毒害作用。人体通过补充抗氧化剂，调节体内氧化还原平衡，达到预防、治疗与氧化应激相关疾病的目的。因此，种类繁多的各种抗氧化的药物，食品及饮料被广泛开发生产。
目前，体外分析抗氧化活性的方法有以下几类：(1)抗氧化剂与稳定自由基的反应，如：galvinoxyl、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)，ABTS·+(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，2,2’-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacidcationradical；(2)采用竞争反应测定，如：抗氧化能力指数测定法(oxygenradicalabsorbancecapacityORAC)；(3)通过测定物质对金属离子Fe(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)的还原能力，来反映抗氧化能力；(4)测定总抗氧化能力(totalantioxidantcapacityTAC)。
关于药物、食品及其保健品的抗氧化活性测定的体外方法虽然很成熟，但是体外分析中所使用的化学评价结果是否能直接应用于生物体系，始终未能解决。体外分析中所使用的化学体系，与体内试验中的生物体系，两者截然不同。
在这种情形之下，采用传统的体外分析方法，测定的结果并不可靠。
而采用生物标记方法的体内分析结果就较为可靠。但是，体内试验的受试对象是人或者动物，实验成本高、试验周期长，操作麻烦等，并不适合药物的前期筛选。药物的生物利用度和体内代谢也会影响到药物在体内的抗氧化活性，导致检测结果的不准确。
本发明公开了一种测定抗氧化活性的方法，采用体内测定方式，可以使用不同的氧化应激因子，测定单一化合物和混合物，且具有测定结果准确、操作方法简单，测定仪器易得、成本低廉的优点。
发明内容
本发明的目的是提供了一种评价药物、食品及其保健品等的抗氧化能力的方法，具体为一种测定物质抗氧化活性的方法，本发明的另一目的是提供一种测定物质抗氧化活性的方法在药品、食品及其保健品研究方面的应用。
该方法为：以大肠杆菌为模型，供试样品预先与大肠杆菌培养，然后加入氧化剂，继续培养，采用光电比浊法，测定细菌生长情况，供试样品的抗氧化活性与供试样品对细菌氧化应激的保护作用呈正相关性，可采用细菌存活率来反映供试样品抗氧化活性的大小，计算公式如下：
存活率(％)＝(药物组OD/阴性对照组OD)×100％，其中OD为opticaldensity(光密度)的缩写。
其中，所述的大肠杆菌为：处于对数期的大肠杆菌。
其中，所述大肠杆菌为：标准菌株CMCC(B)44102。
其中，所述的氧化剂为过氧化氢，过氧化氢的实验浓度为75mM。
其中，所述的光电比浊法检测OD(光密度)时采用波长为600nm。
其中，所述的采用光电比浊法测定细菌生长情况时的检测时间为供试样品预先与大肠杆菌培养3h。
其中，供试样品为水溶性物质、或脂溶性物质。
其中，所述的水溶性物质在检测前溶解于生理盐水，脂溶性物质在检测前溶解于二甲基亚砜或者乙醇。
本发明还提供一种测定物质抗氧化活性的方法在药品、食品及其保健品抗氧化活性测定方面的应用。
本发明还提供一种测定物质抗氧化活性的方法在研究具有抗氧化活性药物的构效关系方面的应用。
采用本发明的方法，以大肠杆菌为模型，以氧化应激因子，如过氧化氢诱导处于对数生长期大肠杆菌处于氧化状态，采用光电比浊法(OD600)测定大肠杆菌的生长曲线，发现氧化应激损伤后的细菌，表现出短暂的生长休眠期和生长缓慢。发现引入抗氧化剂保护后的细菌，表现出生长休眠期缩短，细菌快速进入生长期。
总之，与未加抗氧化剂的细菌比较，加入抗氧化剂的细菌生长休眠期缩短，细菌快速进入对数生长状态。因此药物的抗氧化活性与药物对细菌氧化应激的保护作用呈正相关性，可采用细菌存活率来反映药物抗氧化活性的大小。计算公式如下：
存活率(％)＝(药物组OD/阴性对照组OD)×100％
同现有的方法相比，本发明具有以下优势：
(1)大肠杆菌，具有抗氧化防御系统，包括各种抗氧化酶基因和内源性抗氧化剂。因此，以大肠杆菌为模型较化学模型更接近体内环境。
(2)与哺乳细胞不同，处于肠道区的微生物它们与高浓度的抗氧化剂直接作用，并且大多数抗氧化剂是以其本身的化学结构存在，并非代谢物存在。因此，采用本发明的方法，对于揭示抗氧化的结构与活性关系，为以天然抗氧化剂为先导的人工抗氧化剂的设计提供了有效的基础数据。
(3)采用本发明的方法，对单一化合物或者混合物，亲水性化合物以及亲脂性化合物均可以进行活性测试。
(4)本发明的方法结果准确、简单易行，对设备要求不高，成本低廉，具有普遍的适用性。
附图说明
图1为过氧化氢对大肠杆菌的氧化应激损伤结果图。
图2为肉桂酸类化合物的结构式。
实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1过氧化氢对大肠杆菌的氧化应激损伤模型的建立
1、实验材料
大肠杆菌CMCC(B)44102，购自广东环凯微生物科技有限公司，广州市萝岗区广州开发区科学城神舟路788号；
过氧化氢(30％H2O2，分析纯，天津市东区红岩试剂厂)。
2、实验方法
大肠杆菌CMCC(B)44102，接种于LB培养基(酵母膏：5g，蛋白胨：10g，NaCl：10g,水：1000ml)，置于摇床中隔夜培养10～11小时，摇床转速为每分钟150转，温度为37℃。在超净台下移取少量处于对数生长期的细菌，用LB培养基稀释至OD600值约为0.2，然后加入氧化应激因子过氧化氢。反应液体积为3mL，过氧化氢的浓度梯度为25mM/L、50mM/L、75mM/L、100mM/L，对照为不加过氧化氢。将反应试管放入摇床，转速为每分钟160转，温度为37℃。每30分钟取样，并用双蒸水1.5倍稀释后，测定OD600。
用过氧化氢诱导对数生长期的大肠杆菌的实验结果如图1所示，过氧化氢诱导使得大肠杆菌处于氧化应激状态，表现为出现短暂生长休眠期，以及生长缓慢。从图中可以看出，不同过氧化氢的浓度对大肠杆菌的生长有不同影响。
和对照相比，25mM过氧化氢实验组的细菌在0.5h内短暂休眠，然后开始缓慢增长；50mM的细菌在1h内短暂休眠，后缓慢增长；75mM组的细菌则在前2h内休眠，后开始增长，在3h时增长速率开始恢复；而100mM的细菌则在4h内都未出现增长势头。如上所述，我们选择75mM为氧化应激诱发剂过氧化氢的实验浓度，3h为测定细菌生长情况时的检测时间。
实施例2阿魏酸对过氧化氢损伤大肠杆菌模型的保护作用
1、实验材料
大肠杆菌CMCC(B)44102，购自广东环凯微生物科技有限公司，广州市萝岗区广州开发区科学城神舟路788号；
过氧化氢(30％H2O2，分析纯，天津市东区红岩试剂厂)；
阿魏酸(FerulicAcid)，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。
2、实验方法
移取对数生长期的大肠杆菌CMCC(B)44102，用LB培养基稀释至OD600值约为0.3，于多孔板中加入阿魏酸与大肠杆菌在室温静置培养30min。所用阿魏酸用乙醇溶液配制，所配的阿魏酸浓度梯度为:40μM、20μM、10μM、5μM。
然后加入过氧化氢，诱导氧化应激。每孔加样体积为200μL，过氧化氢的浓度为75mM。用塑料膜包好多孔板，置于摇床(转速为每分钟160转，温度为37℃)中反应3小时后，使用酶标仪测600nm波长处的OD值。存活率(％)＝(OD药物组/OD阴性对照组)×100。
3、实验结果
表1阿魏酸对过氧化氢损伤大肠杆菌的保护作用
实验组 OD600 存活率(％)
阴性对照组(不加过氧化氢) 0.899±0.005 100
阳性对照组(加过氧化氢75mM) 0.293±0.002 32.6
阿魏酸(40μM/L) 0.785±0.006 87.3
阿魏酸(20μM/L) 0.542±0.004 60.3
阿魏酸(10μM/L) 0.365±0.002 40.6
阿魏酸(5μM/L) 0.301±0.002 33.5
通过该验证实验可以看出(结果如表1)，阿魏酸可以抑制过氧化氢对大肠杆菌的氧化应激损伤，且抑制作用与浓度呈正相关性。并结合阴性对照实验表明：阿魏酸在该实验条件下，对大肠杆菌的生长无任何影响。因此，说明可以利用该模型，通过测定物质对大肠杆菌生长的保护作用，来反映物质的抗氧化能力。
实施例3肉桂酸类化合物对过氧化氢损伤大肠杆菌模型的保护作用
1、实验材料
菌株：
大肠杆菌CMCC(B)44102(甘肃省兰州市食品药品检验所提供)；
供试样品：
(1)咖啡酸：用冷乙醇溶液配制，所配的咖啡酸浓度梯度为:20μM、10μM；
(2)阿魏酸：用乙醇溶液配制，所配的阿魏酸浓度梯度为:20μM、10μM；
(3)对羟基肉桂酸：用生理盐水配制，所配的对羟基肉桂酸浓度梯度为:20μM、10μM；
(4)肉桂酸：用乙醇溶液配制，所配的肉桂酸浓度梯度为:20μM、10μM。
图2为各供试样品即肉桂酸类化合物的结构式。
2、实验方法
移取对数生长期的大肠杆菌CMCC(B)44102，用LB培养基稀释至OD600值约为0.3，于多孔板中加入供试样品与细胞在室温静置培养30min后。
加入过氧化氢，诱导氧化应激。每孔加样体积为200μL，过氧化氢的浓度75mM/L，供试品浓度为：20μM/L和10μM/L。用塑料膜包好多孔板，置于摇床(转速为每分钟160转，温度为37℃)中反应3小时后，使用酶标仪测600nm波长处的OD值。
3、实验结果
表2肉桂酸类化合物对过氧化氢损伤大肠杆菌的保护作用
通过该验证实验可以看出(结果如表2)，肉桂酸类化合物对过氧化氢损伤大肠杆菌具有保护作用，且保护作用与浓度呈正相关性。并结合阴性对照实验表明：供试品在该实验条件下，对大肠杆菌的生长无任何影响。比较四种具有相同肉桂酸母核，但是苯环取代不同的化合物，可以得出抗氧化活性咖啡酸＞阿魏酸＞对羟基肉桂酸＞肉桂酸，与文献报道一致。因此，可以证实可以利用该模型，通过测定物质对大肠杆菌生长的保护作用，来反映物质的抗氧化能力，并且可以利用该模型研究抗氧化活性与结构之间的关系。
由以上实验结果证明，用大肠杆菌为模式生物建立的此方法可以用于供试样品抗氧化活性的评价，可以利用该模型，通过测定化合物对大肠杆菌生长的保护作用，来反映化合物的抗氧化能力。

Claims (10)

1.一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，该方法为：以大肠杆菌为模型，供试样品预先与大肠杆菌培养，然后加入氧化剂，继续培养，采用光电比浊法，测定细菌生长情况，供试样品的抗氧化活性与供试样品对细菌氧化应激的保护作用呈正相关性，可采用细菌存活率来反映供试样品抗氧化活性的大小，计算公式如下：
存活率(％)＝(药物组OD/阴性对照组OD)×100％。
2.根据权利要求1所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为：处于对数期的大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为：标准菌株CMCC(B)44102。
4.根据权利要求1所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的氧化剂为过氧化氢，过氧化氢的实验浓度为75mM。
5.根据权利要求1所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的光电比浊法检测OD时采用的波长为600nm。
6.根据权利要求1所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的采用光电比浊法测定细菌生长情况时的检测时间为供试样品预先与大肠杆菌培养3h。
7.根据权利要求1所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的供试样品为水溶性物质、或脂溶性物质。
8.根据权利要求7所述的一种测定物质抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的水溶性物质在检测前溶解于生理盐水，脂溶性物质在检测前溶解于二甲基亚砜或者乙醇。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种测定物质抗氧化活性的方法在药品、食品及其保健品抗氧化活性测定方面的应用。
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种测定物质抗氧化活性的方法在研究具有抗氧化活性药物的构效关系方面的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112195216A (zh) * 2020-09-23 2021-01-08 南京航空航天大学 一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法

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