CN105481972B - 一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其制备方法和应用。本发明提供的多肽具有SEQ ID NO:1所示第155‑194位氨基酸序列。本发明所述制备方法为通过定点突变获取编码活性多肽的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体转染宿主细胞，诱导表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。本发明还提供了所述多肽在神经细胞蛋白表达调控中的应用以及在调节神经突触结构与功能中的应用。通过本发明所公布的多肽分子可以有针对性的调节蛋白表达，从而影响神经突触功能，本发明可应用于多种神经系统疾病的研究试剂和治疗药物的开发。

Description

一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，特别涉及一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其应用。
背景技术
智力发育迟缓(Mental Retardation,MR或Intellect Disability,ID)是儿童期常见的精神疾病，严重威胁人口素质，给社会医疗卫生和经济造成很大的负担。目前从遗传分析中已经发现了多个致病基因，对于这些分子表达调控和细胞功能的研究帮助我们更好的了解大脑和神经发育的机制，也为我们寻找治疗疾病的方法提供了契机。脆性X综合症(Fragile X syndrome, FXS)又称Martin-Bell综合症，是遗传性智力迟缓的首要病因，这类病人通常还患有孤独症。1992年发现该病主要是由于脆性X智力发育迟缓蛋白 FMR1(Fragile X mental retardation 1)基因突变导致，FMR1基因5’-端非翻译区(5’-UTR)的(CGC)n三核苷酸重复序列发生反常的扩增，导致这部分被过度甲基化修饰，从而关闭基因表达，使得FMRP蛋白量下降。作为一个RNA结合蛋白 ，FMRP通过与下游特定RNA的结合，控制这些基因表达的时间和地点。FMRP能和多聚核糖结合，起到翻译抑制子或增强子的作用，FMRP可以通过与非编码RNA的相互作用调节基因表达。FMRP能和微管网络结合，影响细胞内的物质运输，FMRP是细胞内神经颗粒 (neuronal granule)的组分，介导了mRNA和分子马达的结合，参与mRNA 的转运。FMRP参与了代谢性谷氨酸受体mGluR激活的信号通路。因此FMRP蛋白的表达量高低对于神经细胞的正常功能至关重要，为了对瞬息万变的外界刺激做出及时而准确的反应，神经细胞内也有一套严格的调控系统对FMRP进行精细的调控，从而控制它下游靶向基因的表达和运输。由此可以推断，如果能寻找到调控FMRP表达的方式就可以干预神经细胞的功能，这在神经细胞功能研究和很多神经系统疾病的药物治疗中都有广泛的用途。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其制备方法和应用，该多肽能够调控FMRP表达的方式，以干预神经细胞的功能。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽，其具有SEQ IN NO:1中第155到194位氨基酸所示序列，命名为M3。
本发明还提供了一种编码上述的M3多肽的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第463到582位所示。
本发明还提供了一种具有上述DNA分子的载体。
进一步的，所述载体为pFLAG-CMV2,它含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述载体为pGEX-4T3,它含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述载体为pEGFP-C1,它含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述载体为pUAST-attB,它含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明同时提供了上述的对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：获得可以编码SEQ IN NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子；
步骤二：将步骤一所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达
载体，并转化宿主细胞；
步骤三：诱导重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
进一步的，所述步骤一中，以编码正常人源PQBP1的cDNA为模版，以SEQ ID NO:5所示核苷酸序列为上游引物和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列为下游引物扩增。
本发明还提供了上述多肽在神经系统疾病的药物中的应用。
进一步的，所述的药物为FMRP蛋白表达调控的药物，或者调节神经突触结构与功能的药物。
进一步的，所述的药物为调控神经细胞功能的生化试剂。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种多肽M3,含有M3多肽的融合蛋白可以特异性与FMRP蛋白结合，在细胞内过表达含有M3多肽的融合蛋白可以明显降低FMRP蛋白的表达，从而明显解除FMRP对下游基因翻译的抑制作用，增强下游基因的翻译表达。本发明同时利用果蝇模型，展示该多肽在神经突触发育中的作用，在果蝇幼虫神经肌肉接头过表达含有M3多肽的融合蛋白，显著影响bouton的形态结构。本发明可应用于多种神经系统疾病的研究试剂和治疗药物的开发。
附图说明
图1为重组活性多肽M3及其GST融合表达蛋白的电泳检测图；
图2为重组活性多肽M3及其GST融合蛋白的Western Blot检测；
图3为Western Blot检测活性多肽M3及其FLAG融合蛋白转染神经细胞后在神经细胞中的表达；
图4为Western Blot检测活性多肽M3在转基因果蝇中的表达；
图5为活性多肽和FMRP蛋白的直接相互作用；
图6a-d为在神经细胞中过表达活性多肽M3可以下调FMRP蛋白表达；其中，a为神经细胞SH-SY5Y细胞转染Flag-WT,NC,和M3后用免疫荧光方法检测FMPR蛋白的表达量；b为a图的统计结果；c为神经细胞 SH-SY5Y细胞转染Flag-WT,NC,和M3后用免疫印记方法检测FMPR蛋白的表达量；d为c图的统计结果；
图7为体外泛素化实验中活性多肽融合蛋白可以增加FMRP蛋白的泛素化修饰；
图8为在神经细胞中过表达活性多肽M3可以增加FMRP蛋白的泛素化修饰；
图9a-b为在神经细胞中过表达活性多肽M3可以增加FMRP下游基因的表达；a为神经细胞SH-SY5Y细胞转染EGFP-WT,NC,和M3后用免疫印记方法检测MAP1B蛋白的表达量；b为神经细胞SH-SY5Y细胞转染 Flag-WT,NC,和M3后用免疫荧光方法检测MAP1B蛋白的表达量；
图10a-c为在果蝇神经突触接头过表达活性多肽M3重组蛋白增加卫星 bouton的数目；其中，a图为用针对突触前标记HRP的抗体进行免疫荧光染色，展现bouton的结构，下面一排为放大图；b为针对a中各个基因型中卫星bouton比例的统计结果；c为针对a各个基因型中bouton总数的统计结果。
具体实施方式
本发明的多肽M3是由序列表中SEQ ID NO:1自N末端第155-194位的氨基酸组成的蛋白质，其DNA编码序列为SEQ ID NO:2中自5’末端463-582 位核酸序列。
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
将SEQ ID NO:2所示序列接入细菌表达载体，并在细菌中表达该序列，可以翻译出包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，由此获得所需的多肽序列。
将SEQ ID NO:2所示序列接入哺乳动物表达载体pFLAG-CMV2和 pEGFP-C1，转染哺乳动物细胞，可以翻译表达出包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。
将SEQ ID NO:2所示序列接入果蝇细胞表达载体pUAST-attB，通过显微注射定点插入果蝇基因组，利用UAS-GAL4系统，可在果蝇特定的组织中翻译表达出包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。
本发明的多肽可以用于调节FMRP蛋白表达，通过细胞转染的方法将含有编码M3的载体导入哺乳动物神经细胞中，可以下调FMRP蛋白表达。过表达M3多肽显著增加FMRP蛋白的泛素化水平，促进蛋白质降解。在体外用重组蛋白构建的反应体系中，含有M3多肽的反应组内，FMRP的泛素化水平明显升高。
下面结合具体实施例及附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1：M3多肽及其编码基因的获得。
1.1 首先用Trizol试剂提取人源SH-SY5Y神经瘤细胞的总mRNA，反转录试剂盒(Invitrogen)将mRNA反转录为cDNA,分别以SEQ IN NO:3 所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ IN NO:4所示的核苷酸序列为下游引物，通过PCR获得了编码正常人源PQBP1(GeneID:10084)(简称WT) 序列，通过BamHI和NotI双酶切将cDNA克隆到pFLAG-CMV2表达载体中,并转化大肠杆菌DH5α，随机挑选cDNA克隆进行测序并获得正确构建的载体。
5＇-ATAAGAATGGATCCATGCCGCTGCCCGTTGCGCTGCA-3＇ SEQ IN NO:3
5＇-ATAAGAATGCGGCCGCTCAATCCTGCTGCTTGGTTC-3＇ SEQ IN NO:4
PCR扩增反应体系为：
PCR反应程序为：
1.2 然后以含有WT序列的重组质粒为模板，设计定点突变的引物，设计的引物为：上游引物为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，下游引物为SEQ IN NO:6所示的核苷酸序列；
利用聚合酶链式反应的方法，在原有PQBP1序列的463-464bp位置插入 AG俩个碱基，简称M3；同时以SEQ ID NO:7所示的核苷酸为上游引物， SEQ IN NO:8所示的核苷酸为下游引物，进行定点突变，在同样的位置去除一对AG碱基，以获得的移码突变多肽作为实验对照(简称NC，negative control)。
PCR扩增反应体系为：
PCR反应程序为：
1.3 对定点突变产物进行鉴定，将DpnI酶加入PCR扩增产物中37℃反应1h用以消除模板，反应产物转化于大肠杆菌DH5α，从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，在含氨苄青霉素的LB液体培养中37℃培养12-16小时，提取质粒DNA，测序，获得序列正确的定点突变表达载体FLAG-M3以及 FLAG-NC。
实施例2：含有M3多肽的重组蛋白表达载体的构建。
通过亚克隆获得所需多肽编码区序列并接入大肠杆菌表达载体。选择点突变后的重组质粒FLAG-WT、FLAG-M3和FLAG-NC用BamHI和NotI双酶切,将酶切后的片段插入经BamHI和NotI双酶切的表达载体pGEX-4T3 载体，构建重组表达质粒。其中，M3包含本发明所述的多肽序列，WT、 NC为对照。
实施例3：含有M3多肽的重组蛋白的制备。
在大肠杆菌中表达并纯化了包含该多肽序列的融合蛋白。首先提取测序序列正确的含重组表达载体的pGEX-4T3-M3菌种的质粒，转化大肠杆菌 BL21，IPTG诱导培养转化的大肠杆菌，收集菌体，悬浮于缓冲液(1XPBS， 1％Triton)中，超声波破碎菌体，离心收集上清。所得上清通过GST亲和层析得到融合蛋白,该融合蛋白GST-M3包含目的多肽序列。对照组 GST-WT、GST-NC采用同样的方法，结果见图1，2。
实施例4：应用含有M3多肽的重组蛋白进行FMRP蛋白的结合实验。
采用GST Pull-down的实验方法，将约20μg所获得的融合蛋白固定于谷胱苷肽琼脂糖凝胶4B(GE Healthcare)，与纯化的80-100μg MBP-FMRP融合蛋白或者是人源的SH-SY5Y细胞裂解物(裂解液：50mM Tris-HCl,PH7.4, 150mM Nacl,0.1％SDS,1％Sodiumdeoxycholate,1％Triton X-100,1mM EDTA,1mM PMSF,1mM DTT,Complete ProteaseInhibitor)4℃孵育过夜。反应产物离心，去除上清液，用0.1％的PBST以5000rpm的转速离心清洗谷胱苷肽琼脂糖凝胶上未结合的杂蛋白5min,重复三次。最后一次去除上清液，加入35-40μl 2X SDS，轻弹混匀，沸水煮5-10min，离心后收集上清。 SDS-PAGE分离相互作用蛋白，Western-Blot检测靶蛋白FMRP,结果见图 5。其中，GST-M3包含本发明所述的多肽序列，GST-WT、GST-NC为对照。
实施例5：在神经细胞中转染含编码M3的表达载体下调FMRP的表达。
5.1 将包含该多肽序列的融合蛋白表达在神经细胞中检测FMRP的蛋白表达量
将包含有目的多肽序列的FLAG-M3重组质粒通过X-treme GENE HP DNATransfection Reagent的转染试剂表达于SH-SY5Y细胞中，转染36h后收集细胞并裂解，裂解产物Western-Blot检测靶蛋白FMRP的表达量，结果见图3，6c和d；或者转染36h后对细胞进行免疫荧光染色，同样检测靶蛋白 FMRP的含量，使用Image J软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)进行荧光强度测量。结果见图6a和b。其中，FLAG-WT、FLAG-NC为对照。
5.2 体内泛素化修饰验证
SH-SY5Y细胞在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基37℃、5％CO2 条件下培养,将EGFP-M3重组质粒以及含有FMPR的Myc-FMRP重组质粒通过X-treme GENE HP DNATransfection Reagent(Roche)的转染试剂共同表达于SH-SY5Y细胞中。转染20h后加药处理8h,所用药物为10mM的 MG132，处理完成后收集细胞并裂解，裂解液包含150mM NaCl,20mM Tris-HCl,pH 7.4,1mM EDTA,1％NP40,1mM DTT,1mM PMSF以及 Complete ProteaseInhibitor。取40μl偶联有Myc抗体的琼脂糖凝胶(Sigma) 与细胞裂解物于4℃旋转孵育6-8h，裂解液清洗未结合到凝胶的杂蛋白，重复四次，最后一次移除上清液，加入40μl的2XSDS，轻弹混匀，沸水煮 5-10min，离心后收集上清。SDS-PAGE分离相互作用蛋白，泛素化抗体 Western-Blot检测靶蛋白FMRP的泛素化修饰。结果见图8，其中EGFP-WT 和EGFP-NC采用同样的方法，均为对照组。
5.3 体外泛素化修饰验证
大肠杆菌中分别表达并纯化含有目的多肽序列的GST-M3融合蛋白，含有FMRP的MBP-FMRP融合蛋白，以及含有泛素基团的GST-HA-Ubi融合蛋白，其中GST-HA－Ubi蛋白需要进一步纯化去除GST标签。配制30μl反应体系，包括1.5μgMBP-FMRP,10μg HA-Ubi，6μg GST-M3，1.5μl 20X的反应缓冲液(1M Tris PH7.5,40mM ATP,100mM MgCl2,40mM DTT)，以及少量 SH-SY5Y细胞裂解产物支持反应的进行。反应过程在37℃条件下进行1.5h，加入10μl 4XSDS以终止反应，同样，Western-Blot检测靶蛋白FMRP的泛素化修饰。结果见图7，WT、NC为对照组。
实施例6：在神经细胞中转染含编码M3的表达载体增强FMRP下游基因的表达。
通过X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent的转染试剂将编码多肽序列M3的表达载体表达于SH-SY5Y细胞中，转染36h后收集细胞并裂解，裂解产物Western-Blot检测FMRP下游基因MAP1B的表达量，结果见图9a；或者转染36h后对细胞进行免疫荧光染色，同样检测MAP1B的含量，使用Image J软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)进行荧光强度测量。结果见图9b。其中,WT、NC为对照组。
实施例7：在果蝇神经肌肉接头中过表达M3重组蛋白影响突触结构。
采用胚胎注射的方法制备含有目的多肽序列M3的UAS-Flag-M3重组表达载体的转基因果蝇，表达载体可以在果蝇的3号染色体定点插入。Long GMR-Gal4驱动目的蛋白在果蝇眼中的表达后Western-Blot检测，结果见图 4，确认M3重组蛋白可以成功表达。Ok6-Gal4驱动目的蛋白在果蝇神经肌肉接头(NMJ)处的表达，观察突触前结构，解剖果蝇的3龄幼虫，利用免疫荧光染色的方法,HRP抗体标记NMJ突触前的结构，结果显示包含该多肽序列的融合蛋白会导致NMJ突触前生长异常，出现与dfm1突变体果蝇相似的表型，结果见图10a-c，WT为阴性对照，dfm1为阳性对照。
以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下，对于多肽还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种多肽在制备神经系统疾病的药物中的应用，其特征在于：所述多肽是由序列表中SEQ ID NO:1所示的多肽M3：
SEQ ID NO:1
MPLPVALQTR LAKRGILKHL EPEPEEEIIA EDYDDDPVDY EATRLEGLPP SWYKVFDPSCGLPYYWNADT DLVSWLSPHD PNSVVTKSAK KLRSSNADAE EKLDRSHDKS DRGHDKSDRS HEKLDRGHDKSDRGHDKSDR DRERGYDKVD RERESETGNG IGTAGMTRQT GKRAKNGATI AGRSWLPIPR ARRQ
所述的药物为FMRP蛋白表达调控的药物，或者调节神经突触结构与功能的药物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物为调控神经细胞功能的生化试剂。
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