CN104961832B - 一种具有提高学习记忆能力的多肽tat-836-871及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT‑836‑871及其应用。该多肽TAT‑836‑871为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10‑45位所示的多肽；a3)将a1)或a2)所示的多肽经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学习记忆能力作用的衍生多肽。实验证明，该多肽可提高学习记忆能力。

Description

一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-836-871及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-836-871及其应用。

背景技术

在神经系统中，突触是两个神经元相连并传递信息的部位，突触的形成和功能对神经环路和大脑的高级功能至关重要。当神经冲动传导至轴突末梢，到达突触前，引起突触前递质释放，作用于突触后受体，引起下游细胞内信号通路的激活，完成信号在神经元间的传递。突触的发生、成熟和可塑性对神经环路和神经系统的功能至关重要，其分子机制直接关联于学习记忆等大脑高级功能，并在精神分裂症、孤独症、帕金森氏症和阿尔兹海默症等多种疾病的发病过程中起到关键作用。因此，研究突触功能的关键调节机制对于理解大脑的工作原理以及寻求神经系统相关疾病的治疗手段显得尤为重要。

细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)如神经型钙粘素(N-cadherin)在突触的发育、突触的靶向识别和突触功能的稳定性中发挥了重要作用。神经型钙粘素分布在成熟突触活性带和致密斑周围，一方面通过其胞内段与catenin家族的蛋白形成复合体，连接细胞骨架，另一方面通过自身的各个结构域与突触前后膜上的受体和通道结合，从而调控受体分子的膜表达和功能等。然而，神经型钙粘素的翻译后调控机制却知之甚少。

蛋白激酶D(Protein kinase D,PKD)是一类在进化上高度保守的丝苏氨酸蛋白激酶，它属于钙调蛋白激酶超家族(Calmodulin-dependent protein kinases，CaMKs)。在哺乳动物中，PKD包含三个亚型：PKD1、PKD2和PKD3。PKD1是于1994年最先在人和小鼠中克隆得到的亚型。在神经系统中，PKD1在神经元发育早期调控神经元极性的形成；在神经元发育中期，PKD1参与树突囊泡转运和树突分叉的调控。PKD蛋白在哺乳动物神经系统中的高表达和高活性一直持续至神经系统发育晚期和成年之后。因此，探讨PKD1对突触发育和功能的调节机制和对学习记忆能力的影响，为开发相应的提高记忆能力和治疗AD等神经退行性疾病的药物提供了重要的理论基础和实验依据，已成为神经科学领域的研究热点。

发明内容

本发明所用解决的问题是如何提高学习记忆能力。

为解决上述问题，我们提供了一种具有提高学习记忆能力的多肽，名称为 TAT-836-871，为如下a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；

a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-45位所示的多肽；

a3)a1)或a2)所示的多肽经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高学习记忆能力作用的衍生多肽。

其中，序列表的序列1由45个氨基酸组成，序列表的序列1的第1-9位氨基酸残基组成将待转运分子导入细胞内甚至是细胞核内的区域，该区域可以被具有相同作用的其它序列替换；序列表的序列1的第10-45位氨基酸残基构成可以抑制细胞内PKD1与N-cadherin的第836-871位氨基酸序列结合的区域。

编码所述TAT-836-871的核酸分子也属于本发明的保护范围。

以上任一所述“编码所述TAT-836-871的核酸分子”可为如下1)或2)或3)所示的DNA分子：

1)核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TAT-836-871的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TAT-836-871的DNA分子。

含有编码所述TAT-836-871的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明还保护抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质的应用，可为如下C1)或C2)：

C1)提高学习记忆能力；

C2)制备提高学习记忆能力的产品。

所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。

所述抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质具体可为如下(D1)、(D2)或(D3):

(D1)所述TAT-836-871；

(D2)所述“编码所述TAT-836-871的核酸分子”；

(D3)含有编码所述TAT-836-871的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明还保护一种产品，其活性成分为抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质；所述产品的功能可为如下C1)或C2)：

C1)提高学习记忆能力；

C2)制备提高学习记忆能力的产品。

所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。

所述抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质具体可为如下(D1)、(D2)或(D3):

(D1)所述TAT-836-871；

(D2)所述“编码所述TAT-836-871的核酸分子”；

(D3)含有编码所述TAT-836-871的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

所述产品可为药物。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述转基因细胞系、转基因组织和转基因器官均不包括繁殖材料。

实验证明，本发明提供的TAT-836-871可提高学习记忆能力。给予了TAT-836-871干扰PKD1与N-cadherin结合的大鼠，其在水迷宫训练阶段具有更强的学习记忆能力，具体表现为给予TAT-836-871的大鼠比给予TAT-N-scramble的大鼠第一次穿越目标区域的时间潜伏期缩短，穿越目标区域的次数明显增多，并且，在目标象限的总时间和总路程也有所增加，而两组动物的平均速度和总路程没有差异，结果表明给予TAT-836-871的大鼠对于空间记忆的提取的能力明显增强。

附图说明

图1为体外pull-down实验以及过表达N-cadΔ836-871对PKD1结合能力和细胞膜表面定位的影响。

图2为TAT-836-871及对照肽TAT-N-scramble的氨基酸序列。

图3为皮层神经元中TAT-836-871对PKD1与N-cadherin结合能力的影响。

图4为在体外培养的皮层神经元中TAT-836-871对N-cadherin细胞膜表面定位的影响。

图5为水迷宫行为测试中四个象限和平台的位置情况。

图6为TAT-836-871对学习记忆能力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度扫描。

下述实施例中所用的液体配制方法具体如下：

解剖液：蔗糖7.5g/L，葡萄糖3.0g/L，NaCl6.8g/L，KCl0.4g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.24g/L，KH₂PO₄0.03g/L，HEPES(Sigma公司产品)2.3464g/L；溶剂为水；pH为7.2-7.4。使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，于4℃保存。

DMEM培养液：将高糖DMEM固体培养基(Gibco公司产品)13.5g和NaHCO₃3.7g/L依次溶于水，pH为7.2-7.4，定容至1L。使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，于4℃保存。

神经元完全培养基：向Neurobasal培养基(Gibco公司产品)中加入B27Supplement(Gibco公司产品)2％(体积百分比)和GlutaMAX I(100×)(Gibco公司产品)1％(体积百分比)得到的培养基。

细胞裂解液：Tris-HCl(pH 7.5)50mM，NaCl 250mM，EDTA 10mM，NP-400.5％(体积百分比)，PMSF 1mM，NaF 4mM；溶剂为水。

染色液(100ml)：甲醇45ml、乙酸10ml、考马斯亮蓝0.25g和蒸馏水45ml。

脱色液(100ml)：甲醇45ml、乙酸10ml和蒸馏水45ml。

干胶液(100ml)：乙醇10ml、甘油4ml和蒸馏水86ml。

下述实施例中的小鼠单克隆抗体anti-His tag为北京中杉金桥生物技术公司产品；大鼠的单克隆抗体MNCD2为Developmental Studies Hybridoma Bank公司产品；PKD1抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品；小鼠的单克隆抗体anti-N-cadherin 3B9，为invitrogen公司产品；小鼠的单克隆抗体anti-Human Tfr为Invitrogen公司产品，小鼠的单克隆抗体anti-beta-actin为北京中杉金桥生物技术公司产品。胰酶：Trypsin0.25％，Invitrogen公司产品。

实施例1、多肽TAT-836-871的发现

N-cadherin的氨基酸序列如序列表序列4所示。

一、PKD1与N-cadherin第836-871位氨基酸结合

体外pull-down实验发现，PKD1与N-cadherin的胞内C端相结合(图1中A)。针对N-cadherin胞内C端的不同结构域构建了一系列截短突变体，并最终确定PKD1是通过N-cadherin第836-871位的氨基酸序列进行结合(图1中B)。

将野生型N-cadherin蛋白(在下文中简称N-cadherin或N-cad)第836-871位的氨基酸序列删除，得到N-cadherin的突变体，在下文中简称N-cadΔ836-871。

二、N-cadΔ836-871使N-cadherin在细胞膜表面定位减少

在N2A细胞中过表达N-cadherin和N-cadΔ836-871，然后进行生物素标记细胞膜表面蛋白的实验。结果表明，过表达N-cadΔ836-871使N-cadherin在细胞膜表面定位显著减少(图1中C)，为过表达N-cadherin使N-cadherin在细胞膜表面定位的1/10。

根据PKD1与N-cadherin第836-871位结合的氨基酸序列设计并构建了多肽TAT-836-871(图2)，多肽TAT-836-871的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，编码如 序列表中的序列1第10-45位所示的氨基酸序列。在下文中简称TAT-836-871。

将序列表中序列1第10-45位所示的多肽的氨基酸残基以随机方式重新排列，得到对照肽TAT-N-scramble(图2)，对照肽TAT-N-scramble的氨基酸序列见序列表的序列2。对照肽TAT-N-scramble在下文中简称TAT-N-scramble。

分别合成TAT-836-871和TAT-N-scramble。

实施例2、TAT-836-871的功能

一、孕18天大鼠皮层神经元的制备

用于制备皮层神经元的大鼠品种为SD大鼠。

试验准备：试验前一天在培养皿中加入浓度为1mg/ml的多聚赖氨酸，置于37℃孵箱过夜，试验当天用无菌Milli-Q水洗涤后使用；含10％FBS的DMEM培养基置于37℃孵箱平衡。

1、断颈处死处于孕18天的孕鼠，快速取出胎鼠。

2、在解剖液中将胎鼠快速断头。

3、将胎鼠的头放入盛有解剖液的培养皿中，使用两把小镊撕开头皮和颅骨，取出完整脑组织。

4、将脑组织转移至冰盒上盛有解剖液的培养皿中，在体视镜下分离皮层组织(从背侧开始，用镊子分开左右大脑半球，从内向外翻开皮层，用剪刀垂直剪断海马外缘，使大脑皮层与其它部分分离)。

5、将皮层组织放入培养皿，加入1ml 0.25％的胰酶，于37℃孵箱中消化0.5h。

6、将皮层组织转移至含10％FBS、1％氨苄青霉素和1％卡那霉素的DMEM培养基中，用1ml的移液枪将皮层组织块轻柔的吹散，沉降5分钟，吸取上清至含10％FBS的DMEM培养基中，获得皮层神经元细胞悬液。

7、将皮层神经元细胞悬液加入铺有多聚赖氨酸的培养皿中培养3-4小时，然后改用神经元完全培养基培养，此后每3天进行半换液。

二、TAT-836-871抑制PKD1与N-cadherin的结合

1、分别将TAT-836-871和TAT-N-scramble加入体外培养皮层神经元的培养基中，终浓度为3μM，处理神经元12h。

2、完成步骤1后，分别取皮层神经元提取总蛋白，分别得到TAT-836-871皮层神经元总蛋白溶液和TAT-N-scramble皮层神经元总蛋白溶液。

3、免疫共沉淀

(1)用预冷的pH 7.2PBS缓冲液清洗珠子(protein A-Sepharose CL-4,AmershamPharmacia，CAT#17-5280)3次，2000rpm×2min离心，弃上清；

(2)完成步骤(1)后，40μl珠子与PKD1抗体共同孵育，4℃混悬3h；

(3)完成步骤(2)后，向步骤(2)的悬浮体系中加入步骤2得到的皮层神经元总蛋白溶液(TAT-836-871皮层神经元总蛋白溶液或TAT-N-scramble皮层神经元总蛋白溶液，含500μg皮层神经元总蛋白)，4℃混悬过夜；

(4)完成步骤(3)后，用预冷的0.1％Triton X-100/1×TBS清洗珠子6次，2000rpm×2min离心，去除非特异结合；

(5)完成步骤(4)后，弃上清，加入6×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸，使与珠子结合的蛋白释放；

(6)将步骤(5)得到的上清进行SDS-PAGE和Western blot，采用大鼠的单克隆抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，采用PKD1抗体作为一抗检测PKD1，结果见图3。

对Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度扫描后，根据IP灰度值和IgG灰度值计算结合强度：结合强度＝IP灰度值/IgG灰度值。实验表明(图3)，TAT-836-871能够显著地降低神经元中PKD1与N-cadherin的结合能力，而TAT-N-scramble不能抑制PKD1与N-cadherin结合。

三、TAT-836-871使N-cadherin在细胞膜表面定位的表达量减少

1、分别将TAT-836-871和TAT-N-scramble加入体外培养皮层神经元的培养基中，终浓度为3μM，处理皮层神经元12h。

2、完成步骤1后，取皮层神经元采用EZ link-NHS-LC-biotin标记试剂盒(Pierce公司产品，产品目录号为CAT#21335)和UltraLinkoR Immobilized NeutrAvidinTMProtein Plus(Pierce公司产品，产品目录号为CAT#53151)标记细胞膜表面蛋白，借助生物素纯化细胞膜表面蛋白。

3、完成步骤1后，分别取皮层神经元提取总蛋白，分别得到TAT-836-871皮层神经元总蛋白和TAT-N-scramble皮层神经元总蛋白；

4、分别将细胞膜表面蛋白和皮层神经元总蛋白进行SDS-PAGE和Western blot(采用大鼠的单克隆抗体MNCD2作为一抗检测N-cadherin，细胞膜表面蛋白采用Tfr蛋白为内参)。

Western blot结果见图4中左图。将TAT-N-scramble处理组细胞膜上N-cadherin的含量作为1，计算TAT-836-871处理组细胞膜上N-cadherin的相对含量，结果见图4中右图。

通过生物素标记细胞膜表面蛋白的检测发现TAT-836-871处理体外培养的皮层神经元12h能够使神经元细胞膜表面N-cadherin的表达量显著减少。相对于TAT-N-cadscramble处理，TAT-836-871处理体外培养的皮层神经元12h能够使神经元细胞膜表面N-cadherin的表达量降低至3/5。

四、干扰PKD1对N-cadherin的结合增强大鼠学习记忆能力

本步骤中的大鼠为健康雄性SD大鼠，体重为90-100g。

为了验证PKD1对N-cadherin的结合是否直接影响了大鼠的学习记忆，对大鼠进行了海马依赖的学习记忆能力测试，即水迷宫行为学测试。

对大鼠双侧海马的CA1区域进行核团定位埋管(坐标：AP:+3.6mm，L(R):±2mm，DV:2.9mm)，待其恢复5天之后进行给药和水迷宫的行为测试。每天对大鼠进行训练之前12h双侧海马注射干扰肽TAT-N-scramble或TAT-836-871，并训练大鼠找到位于第三象限的水下平台，连续5天。注射要求为：双侧海马注射TAT-836-871(或TAT-N-scramble)的体积均为0.5μl，TAT-836-871(或TAT-N-scramble)的浓度为20μg/μl，注射速度为0.2μl/min。在第六天将平台撤除并对大鼠的记忆能力进行测试。

水迷宫行为测定的实验步骤如下：

1)在一个直径150cm深60cm的黑色圆缸里注入32cm深的水，水温恒定在22±1℃，水面分为四个象限，一个直径为12cm的平台置于第三象限，位于水下1cm处(见图5，图5中Ⅰ为第一象限，Ⅱ为第二象限，Ⅲ为第三象限，Ⅳ为第三象限，A为平台)。实验的第一天，同一只大鼠分别在四个不同象限入水寻找水下平台。大鼠寻找平台的时间上限为120s，如果120s大鼠未找到平台，则需指引到平台上，每只大鼠在平台上的时间为30s，以方便其进行空间学习和记忆。每只大鼠从不同象限入水的时间间隔为20min。水迷宫上方安置一摄像头监视大鼠寻到水下平台的时间。

2)重复步骤1连续5天，每天大鼠从不同象限入水的顺序均有所改动，记录大鼠的逃避潜伏期。

3)实验第六天，撤掉水下平台，将大鼠从第一象限放入水迷宫，记录该大鼠第一次穿越水下平台区域的时间、穿过水下平台区域的次数以及在第三象限的时间和路程。

结果见图6。给予了TAT-836-871干扰PKD1与N-cadherin结合的大鼠，其在水迷宫训练阶段表现为能更快找到隐藏在水下的平台(图6中A)，表明给予TAT-836-871的大鼠具有更强的学习记忆能力。在第6天撤除水下平台的测试实验中，给予TAT-836-871的大鼠比给予TAT-N-scramble的大鼠在第一次穿越目标区域的时间潜伏期短，穿越目标区域的次数明显增多，并且，在目标象限的总时间和总路程也有所增加(图6中B)，表明给予TAT-836-871的大鼠对于空间记忆的提取的能力明显增强。但分别给予TAT-836-871和TAT-N-scramble的两组大鼠的游泳速度和总路程并无差异(图6中C)。

Claims (8)

1.一种多肽，为如下a1)或a2)：

a1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；

a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-45位所示的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

5.抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质的应用，为如下C1)或C2)：

C1)提高学习记忆能力；

C2)制备提高学习记忆能力的产品；

所述应用为非疾病诊断治疗的应用；

所述抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质为如下(D1)、(D2)或(D3)：

(D1)权利要求1所述的多肽；

(D2)权利要求2或3所述核酸分子；

(D3)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述N-cadherin蛋白如序列表序列4所示。

7.一种产品，其活性成分为抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质；所述产品的功能为如下C1)或C2)：

C1)提高学习记忆能力；

C2)制备提高学习记忆能力的产品；

所述抑制PKD1与N-cadherin蛋白结合的物质为如下(D1)、(D2)或(D3)：

(D1)权利要求1所述的多肽；

(D2)权利要求2或3所述核酸分子；

(D3)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于：所述N-cadherin蛋白如序列表序列4所示。