CN105479751B - 一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统与方法。该系统包括基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置和生物三维打印设备，可视化装置包括光源、低相干干涉模块、样品扫描模块、干涉信号探测模块、计算机。该方法采用OCT技术实现三维生物打印水凝胶支架的定量结构表征，并基于定量结构表征结果反馈支架设计和打印，通过迭代降低设计与打印的差异性，来提高支架三维制造的稳定性和可控性。本发明系统同时满足三维生物打印水凝胶优化控制对高分辨和大范围三维快速扫描的要求，基于OCT技术实现对支架整体的无损非侵入快速成像，通过基于自动选择目标区域的算法定量分析支架整体和空间局域化形态特征信息。

Description

一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统与方法

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，涉及一种三维打印水凝胶支架的优化控制系统与方法。

背景技术

作为组织工程的重要组成部分，支架为细胞生长提供了必要的空间和环境，其化学组成和物理结构能够影响细胞的活动，如细胞的粘附、迁移、增殖和分化等。水凝胶具有良好的生物相容性、可降解性、亲水性以及包裹细胞的强大能力，这使得水凝胶被广泛应用于构建组织工程支架。另一方面，在一些特殊应用场合，如功能性组织器官制造，对支架的多孔形态提出特别严格的限制，支架的内部结构需要特殊定制以获得期望的几何、机械及液体传输特性，而这些特性对支架局部或整体变化(如特征尺寸和形状，体积比等)高度敏感，因而支架的制备需要一种精确制造技术，可以提高支架参数的可控性和可重复性。

三维生物打印(three-dimensional Bio-printing,3D Bio-printing)技术可以无毒且方便地按照预先设计几何结构制备出完全连通的三维结构，已成为制造可以细胞接种或细胞封装的生物支架的良好工具。水凝胶和3D Bio-printing技术的结合为开发可细胞接种/封装的组织工程支架提供了一种设计关联的可控解决方案。3D FD和3D bio-plotting技术均属于生物三维打印技术，曾成功用于制造具有可复制形态特性的多孔水凝胶结构。如Wang XH等人基于3D纤维沉积(fibre deposition,FD)的3D Bio-printing技术成功的制造出可控孔形和孔尺寸分布的多孔水凝胶/肝细胞复合结构，且打印结构具有良好可复制性。然而，水凝胶特有的溶胀特性及其组成成分不同，引起打印后的结构形态参数与设计值出现明显差异。如刘丰等人发现明胶/海藻酸钠复合材料在成形过程中会有流涎、过度堆积和孔的融合等现象。此外，Shim JH等人基于3D生物绘制(bio-plotting)技术制备水凝胶支架，发现单一成分水凝胶打印出的支架机械性能较差，会出现支架支撑的局部断裂。上述研究证实了打印出的结构与设计的结构在形态参数上存在显著差异，这些差异严重影响了水凝胶支架的实际应用，因此研究如何制造出与预期形态参数尽量匹配的定制结构具有重要意义。

本发明的目的是提出一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统和方法，该系统可实现三维生物打印水凝胶支架的定量结构表征，并基于定量结构表征结果反馈支架设计和打印，通过迭代降低设计与打印支架间的差异性，包括形态和机械特性差异，来提高水凝胶支架三维制造的稳定性和可控性。为此，提出一种包括设计、打印、全面形态定量表征的两次闭环反馈控制方法，第一次闭环称之为“实验”组，用来评价水凝胶三维打印过程的内在可控性。“实验”组完成后，设计与打印的形态差异作为第二次闭环(即“生产”组)的输入，并反馈控制“生产”组的设计与打印，以获得预期的结构制造。该方法的关键在于定量表征三维打印的水凝胶结构参数，包括支架孔径、支撑直径、孔隙率、连通性、通道直径、通道长度及方向等参数。

现有多孔支架的结构表征方法主要有液体置换法、扫描电镜法以及基于三维成像的分析评价方法。液体置换法是将支架完全浸没液体中，基于浸没时物体和置换液体的体积相等原理来评估支架的孔隙率，但是这种方法很难找到合适的溶剂来置换而不影响生物材料，且这种方法会使支架结构因为压力而形变，同时也不能检测支架孔径、孔连通性。扫描电镜法可以直观定性地评估支架的孔贯通性，也可获得截面的表面积。但是为了监测支架的内部结构，需要进行物理切片，这样则会对支架造成不必要的损伤，对测量结果也造成影响。

基于三维成像的分析评价方法具有无损非侵入的特点，常用来检测和定量评价组织工程支架。如应用显微计算层析术(micro-computed tomography,micro-CT)对骨组织工程支架成像。磁共振成像(magmetic resonance imaging,MRI)技术用于检测组织工程支架移植前的结构和成分，并监测间充质干细胞分化形成组织。超声弹性成像(Ultrasoundelastography)可用于描述大块工程组织内的弹性粒子分布。但是，这些成像技术用于水凝胶支架成像仍然存在问题。水凝胶的高含水量特点导致micro-CT对水凝胶成像时对比度过低，且X射线的高离子性可能损伤细胞。MRI和超声弹性成像的分辨率有限。此外，共焦显微术、多光子显微术(Multiphoton microscopy,MPM)等光学成像方法也用于对组织工程支架成像，其分辨率高，可以达到亚微米级，缺点在于成像深度有限，如共焦显微术对高散射样品的成像深部近似100μm，MPM的穿透深度也限制在400～500μm。因而，需要发展能够高分辨穿透深度适合的理想成像方法来非接触的分析组织工程支架结构。

光学相干层析成像(optical coherence tomography，OCT)技术是能够克服上述各种技术缺陷最有前景的一种解决方案，因为其能够实时非侵入的获取样品结构的横断面图像，成像分辨率可以达到1～15μm，对高散射样品的成像深度达到数毫米，能够提供样品三维高分辨图像。近年来，OCT应用于传统组织工程技术制造的支架和组织的研究正逐步开展。如S.M.Rey等人将细胞与凝胶混合，用OCT技术检测了细胞在凝胶材料中的三维和四维迁移。C.W.Chen等人利用OCT对粒子盐析法制备的水凝胶多孔结构进行定量评价。这些研究验证了OCT用于水凝胶支架评价的可行性，但必须指出传统的组织工程技术是过程依赖性的，无法对水凝胶结构进行局部定位控制制造，也无法按照预定义的结构进行可重复性制造，所以，以往支架的结构表征更多关注全局性的统计结构特征，而非与空间位置关联的局域化结构特征，且无须对整个支架成像。3D Bio-printing技术可以预定义水凝胶支架孔的形状和尺寸、内部通道结构，要将OCT技术应用于反馈控制三维打印水凝胶支架结构可控性优化必须解决几个关键技术问题：

(1)实现快速大范围三维扫描，以提供三维生物打印水凝胶支架的全局成像。常规的OCT横向成像范围在2mm*2mm～10mm*10mm之间，而三维打印水凝胶支架的横向大小一般超过10mm*10mm，因而必须提高OCT的横向成像范围。

(2)发展自动的图像处理与分析算法，可以自动选择相互隔离的感兴趣目标区域(region-of-interest，ROI)。一个支架的三维OCT图像采集就有大量数据，且OCT原始图像具有大量斑点噪声，人工处理易出错，必须发展自动图像处理算法对原始OCT图像进行预处理，降低斑点噪声提高图像质量，以方便分割出实体结构和孔隙、通道。此外，自动选择相互隔离的ROI，定量分析ROI的形态参数，可以为三维生物打印水凝胶支架的定位制造提供有效的局域化信息反馈。

有鉴于此，本发明针对三维生物打印水凝胶支架结构可控性优化对结构精确表征的需求，提出一种适合三维生物打印水凝胶支架定量表征的OCT系统和方法。该系统能够实现对三维生物打印水凝胶支架整体的无损非侵入快速成像，且能够根据采集的三维OCT数据进行自动图像处理，降低斑点噪声，提高图像质量，自动分割出实体结构和孔隙、通道，自动选择相互隔离的ROI，定量分析ROI的形态参数，包括其直径、面积、形状因子等参数，并可以给出支架整体的孔隙率、连通性及表面积等形态参数。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，以克服现有三维生物打印水凝胶支架结构精度控制不够的缺陷，提出了一种基于OCT技术的三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统。

本发明的技术方案如下：

一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统，包括基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置和打印参数可控的三维生物打印设备。

所述的基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置包括光源、低相干干涉模块、样品扫描模块、干涉信号探测模块、计算机；光源发出的光经光纤进入低相干干涉模块，低相干干涉模块发出的探测光经光纤进入样品扫描模块，样品扫描模块将光聚焦到放置在样品台的三维生物打印水凝胶支架上，支架产生的后向散射光原路返回至低相干干涉模块，低相干干涉模块产生干涉光谱信号经光纤送入干涉信号探测模块。

计算机负责整个OCT装置的时序控制、图像采集处理和分析。时序控制包括光源触发、二维高速扫描振镜扫描时序、二维电机运动时序以及干涉光谱信号采集时序。图像采集处理分析分为图像采集、图像处理及图像定量分析。其中图像采集从干涉信号探测模块获取的干涉光谱信号进行A/D转换，转换后的数字信号存到缓存中，通过算法重建显示出二维横断面图像和三维图像。图像处理主要是进行量化前的预处理，因为生物三维打印水凝胶支架是按照横截面层层堆积的，所以图像处理首先将重建的三维OCT图像进行切片重组，转换到横截面，再对每个横截面进行自动的背景去噪、增强优化(对比度，亮度调整)、图像分割、图像形态学处理(开闭运算)、区域轮廓提取等操作。图像分析根据图像处理分割出的支架实体结构、孔隙、通道等自动选择相互隔离的感兴趣目标区域(ROI)，并进行自动标记和分类，基于形态操作算法对相互隔离的ROI进行量化分析，定量分析ROI的形态参数，包括其直径、面积、形状因子等参数，并给出支架整体的孔隙率、连通性及表面积等形态参数。

基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置可以选用扫频OCT成像系统，也可以选用谱域OCT成像系统，但无论哪一种系统，其样品扫描模块都需要对待表征的三维生物打印水凝胶支架进行整体的横截面快速扫描。

所述的扫频OCT成像系统采用宽带扫频光源，干涉信号探测模块采用光电平衡探测器。其中宽带扫频光源的扫频范围要求在80nm～220nm,推荐在100nm～140nm，以确保轴向成像分辨率和系统谱宽匹配的平衡。

所述的谱域OCT成像系统采用宽带连续光源，干涉信号探测模块采用高速线阵光谱探测器。

所述的样品扫描模块包括高速物镜前扫描模块、二维电机运动模块、样品台，其中高速物镜前扫描模块实现小范围高分辨的快速二维扫描，二维电机运动模块实现大范围的二维扫描。扫描执行时，高速物镜前扫描模块从初始点开始快速完成一个较小矩形区域扫描,然后利用二维电机运动模块在整个检测区域运动，从而实现整个检测区域内所有待检测支架的整体扫描。

所述样品扫描模块的组合为以下两种之一，即：一种高速物镜前扫描模块通过夹持装置直接安装在二维电机运动模块上，两者组合为一个整体探头，而样品台独立，仅负责Z轴方向运动实现扫描光束聚焦调节；一种高速物镜前扫描模块与二维电机运动模块分离，二维电机运动模块与样品台整合，样品台需方便支架专用培养皿的固定和更换，且负责Z轴方向运动实现扫描光束聚焦调节。

所述的高速物镜前扫描模块包括光纤准直器、二维高速扫描振镜、扫描物镜。

低相干干涉模块发出的探测光由光纤进入高速物镜前扫描模块的光纤准直器，二维高速扫描振镜输出的光经扫描物镜进行聚焦后进入放置在样品台的三维生物打印水凝胶支架。

所述打印参数可控的三维生物打印设备主要包括打印主机、控制模块、打印喷头、X/Y/Z三轴运动模块、打印成型平台。打印主机负责配置打印参数、编辑打印模型、运行分层算法、发送加工指令并监控打印状态，控制模块负责接收加工指令，负责控制喷头的初始自动定位(Initial Automatic Location,IAL)，初始出丝直径测量(Measurement of strutsize，MSS)，驱动的气动压力(Pneumatic Pressure，P)，温度(Temperature，T)及X/Y/Z三维运动(Movement，M)。

本发明的另一个目的是提供基于上述系统的一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制方法，该方法采用OCT技术实现三维生物打印水凝胶支架的定量结构表征，并基于定量结构表征结果反馈支架设计和打印，通过迭代降低设计与打印支架的差异性，来提高水凝胶支架三维制造的稳定性和可控性，该方法包括设计、打印、全面形态定量表征的两次闭环反馈控制方法，第一次闭环称为设计组，采用计算机软件设计支架，用来评价水凝胶三维生物打印过程的内在可控性；第二次闭环称为生产组，采用设计与实际打印的形态差异作为输入，并反馈控制生产组的设计与打印，以获得预期的结构制造。该方法的关键在于定量表征三维生物打印的水凝胶结构参数，包括支架孔径、支撑直径、孔隙率、孔隙表面积、连通性、通道直径、通道长度及方向等形态参数。

该方法具体包括如下：

(1)第一次闭环采用计算机软件设计支架，用来评价水凝胶三维打印过程的内在可控性：

通过计算机软件设计同一几何结构，某支架形态参数作为变量的一组支架，并采用三维生物打印技术打印出支架，并记录下不同支架的各形态参数作为设计值。

所述的支架形态参数为能够表征支架特征结构和功能的参数，包括但不限于支架整体的孔隙尺寸(PS)、实体支撑尺寸(StS)、孔隙率(VP)、孔隙体积(PV)、孔隙表面积(PSA)；

(2)第二次闭环采用设计与实际打印的形态差异作为输入，反馈控制支架的设计与打印，以获得预期的支架结构，用以定量评价水凝胶三维打印过程的内在可控性：

对依据上一步设计三维生物打印得到的支架整体进行扫描成像，得到支架的三维OCT图像，然后对其进行图像处理和定量分析，得到打印支架各形态参数的打印实际值；比较该支架各形态参数的设计值与打印实际值间的差异，分析打印支架各形态参数的打印实际值与作为变量的某形态参数设计值之间的定量关联性，建立打印支架各形态参数打印实际值与作为变量的某形态参数设计值的经验公式，定量评价水凝胶三维打印过程的内在可控性；最后使用经验公式调整设计和生产间支架形态参数的差异。

所述的对依据设计值三维生物打印得到的支架整体进行扫描成像具体是首先通过高速物镜前扫描模块获取支架局部的高分辨三维OCT图像，并利用二维电机运动模块在整个检测区域运动，从而实现整个检测区域内所有待检测支架的整体扫描(其中检测区域内设有一个待检测支架或多个待检测支架)。然后利用特征点匹配算法三维拼接成支架的整体三维OCT图像。

所述的图像处理和定量分析是指利用切面重组算法从上述整体三维OCT图像中提取正前面(en face)序列图，并对en face序列图经过增强优化、背景去噪、图像分割、形态开闭操作等图像处理，提取出每层图像中的孔结构，通过公式(1)、(2)计算出PS和StS；最后再将此孔结构进行三维重建，然后根据图像分割出的支架实体结构、孔隙、通道等自动选择相互隔离的感兴趣目标区域(ROI)，进行自动标记和分类，且基于形态操作算法对相互隔离的ROI进行量化分析，定量分析ROI的形态参数，包括其直径、面积、形状因子等参数，并通过公式(3)、(4)、(5)计算得到支架整体的孔隙率(VP)、孔隙体积(PV)及孔隙表面积(PSA)。

所述的增强优化是指对en face图像调整图像对比度、亮度和γ值，以增强孔隙区域与支撑部分的对比度；

所述的背景去噪是指对增强优化后的图像通过图像降噪算法滤出背景散斑噪声，以提高成像支架特征结构的解析度，方便后续的自动识别与处理；根据水凝胶支架OCT图像特点，可以优先选用中值滤波算法；

所述的图像分割是指对背景去噪后的图像经基于阈值的图像分割算法，得到孔和实体的二值化图像，孔隙区域的像素值I＝1，其他支撑部分则是I＝0，或者根据需要将孔隙区域的像素值设定为I＝0，其他支撑部分则是I＝1；其中孔隙区域中孔隙和通道的识别可以基于智能模式识别算法进行自动分类和标记。

所述的形态开闭是指图像分割二值化后的图像由于可看到某些孔区域内存在黑点，故需要进行形态闭操作，是以平滑目标物边界而不改变其面积，填充目标内的细小空洞即可。

孔隙尺寸(PS)是指支架相邻支撑部分间距，可表示为：

公式(1)

其中b代表孔隙边界，s代表孔隙骨架。

实体支撑尺寸(StS)是指相邻孔隙I，J边缘间的最短距离，可表示为：

公式(2)

孔隙率(VP)是指支架内部的孔隙体积(V_pore)占支架总体积(V_total)的百分率，可表示为：

公式(3)

其中孔隙体积(V_pore)和总体积(V_total)都是通过对三维重建后的OCT图像进行量化分析得到，以像素数量的形式呈现。

孔隙表面积(PSA)是指孔隙部分的像素表面积值之和，可表示为：

公式(4)

其中g(x_i,y_j,z_k)代表坐标为x_i,y_j,z_k的像素表面积。

孔隙体积(PV)是指孔隙部分的像素体积值之和，可表示为：

公式(5)

其中I(x_i,y_j,z_k)代表坐标为x_i,y_j,z_k的像素体积。

本发明的有益效果如下：

本发明提出一种水凝胶支架三维生物打印的优化控制系统，该系统基于OCT技术能够实现三维生物打印水凝胶支架的整体和局域化的高分辨定量表征，并通过定量表征结果反馈指导水凝胶支架三维生物打印的精准控制，可以提高水凝胶支架精准制造的可重复性和可控性，便于大批量定制结构一致的水凝胶支架。

本发明提出一种适合水凝胶支架定量可视化的OCT系统，该系统能够同时满足水凝胶成像对高分辨和大范围三维快速扫描的要求。

本发明提出一种适用于水凝胶支架在线监测的方法，该方法基于OCT技术实现对三维生物打印水凝胶支架整体的无损非侵入快速成像，通过基于自动选择目标区域的算法定量分析支架整体和空间局域化形态特征信息。生物三维打印水凝胶支架内部结构形态的定量精准表征有利于研究支架结构与细胞动力学特征间的关联性，为制备功能组织奠定理论和技术基础。

提出一种三维生物打印水凝胶支架的精准控制方法，该方法通过实时在线定量表征打印好支架的整体和空间局域化结构形态信息反馈支架设计与打印，依据迭代降低设计与打印支架的差异性，包括形态和机械特性差异，来提高水凝胶支架三维制造的稳定性和可控性。

附图说明

图1是基于OCT的三维生物打印水凝胶支架的优化控制流程图；

图2为三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统原理框图；

图3是支架设计示例图；

图4是打印参数可控的三维生物打印设备的组成图；

图5是基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化系统原理示意图；

图6是三维生物打印水凝胶支架快速扫描模块的组合1原理示意图；

图7是三维生物打印水凝胶支架快速扫描模块的组合2原理示意图；

图8是三维生物打印水凝胶支架定量可视化系统的样品扫描示意图；

图9是第一次三维生物打印水凝胶支架的显微图像和OCT图像展示；

图10是基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化系统的图像预处理流程图；

图11是三维生物打印预设孔径的水凝胶支架的优化控制结果展示。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明：

本发明给出基于OCT的三维生物打印水凝胶支架的精准控制流程图，如图1所示，基于计算机辅助设计技术设计待打印支架的几何结构，采用三维生物打印设备制造出水凝胶支架，利用OCT系统定量表征实际水凝胶支架的形态参数；比较设计与制造间的偏差，分析偏差与设计值的关联性，总结经验函数；根据经验函数反馈指导水凝胶支架的设计与打印，重复以上步骤直到打印出与设计一致的水凝胶支架。图2给出三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统原理框图。

图3给出一种组织工程上常用的一种可有效实现细胞接种/封装的生物支架的结构设计图，其中d2表示支架的孔隙尺寸(Pore Size，PS)，po300代表设计的PS为300μm。d1表示支架的实体支撑尺寸(Strut Size,StS)，d3表示支架的层厚，两者均设定为210μm。支架的外形均为立方体，尺寸设为10mm×10mm，高4mm。可以采用SolidWorks软件设计出六种不同孔隙尺寸的方形孔型支架，按照其尺寸的不同分别定义为po300，po400，po500，po600，po700，po800。

表1展示了实施例中用于3类不同评价实验的6种预设几何结构，实验包括OCT图像分析实验、重复性实验和迭代分析实验。其中OCT图像分析实验是对6种不同尺寸的支架分别随机选择5个打印出的样本测试；重复性实验是指对单一po700支架在5个不同时间点制备，比较各定量参数间的统计差异；迭代分析实验是指选取po300，po700两种尺寸来验证迭代分析方法是否能显著降低设计和制备间的不一致。

表1 六种预设几何结构用于3类不同评价实验

本发明三维生物打印水凝胶支架的优化控制系统，包括基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置和打印参数可控的三维生物打印设备。

图4给出打印参数可控的三维生物打印机的组成图，主要包括打印主机1、中心控制模块2、打印喷头3、X/Y/Z三轴运动模块4、打印成型平台5、独立温控系统6。打印主机1负责配置打印参数、编辑打印模型、运行分层算法、发送加工指令并监控打印状态，中心控制模块2负责接收加工指令，并对X/Y/Z三轴运动模块4进行运动控制，和对打印喷头3进行挤出气压的调节/开闭，独立温控系统6负责调控打印喷头3和打印成型平台5的温度。

上述的基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化系统，如图5所示，其主要由光源7、低相干干涉模块8、样品扫描模块9、干涉信号探测模块10、计算机11。其光源7发出的光经第一光纤12进入低相干干涉模块8，低相干干涉模块8发出的探测光由第二光纤13进入样品扫描模块9，样品扫描模块9通过聚焦进入放置在样品台的三维生物打印水凝胶支架，支架产生的后向散射光原路返回至低相干干涉模块8，低相干干涉模块8产生干涉光谱信号经第三光纤14送入干涉信号探测模块9。计算机11负责整个OCT装置的时序控制、图像采集处理及分析，然后将处理分析后的信息反馈至打印设备，时序控制包括光源触发、二维高速振镜扫描时序、二维电机运动时序以及干涉光谱信号采集时序。图像采集处理分析分为图像采集、图像处理及图像定量分析。其中图像采集将获取的干涉光谱信号进行A/D转换，转换后的数字信号存到缓存中，通过算法重建显示出二维横断面图像和三维图像。

所述的样品扫描模块3的组合为以下两种之一，即：一种高速扫描模块15通过夹持装置直接安装在二维电机运动模块16上，两者组合为一个整体探头，而样品台独立，仅负责Z轴方向运动实现扫描光束聚焦调节；一种高速扫描模块与二维电机运动模块分离，二维电机运动模块与样品台整合，样品台需方便支架专用培养皿的固定和更换，且负责Z轴方向运动实现扫描光束聚焦调节。样品扫描模块3的第一种组合的原理示意图如6所示。第二种组合的原理示意图如图7所示。其中所述的高速扫描模块由光纤准直器17、二维高速扫描振镜18、扫描物镜19组成。低相干干涉模块8发出的探测光由第二光纤13进入高速扫描模块15的光纤准直器17，二维扫描振镜18输出的光经扫描物镜19进行聚焦后进入放置在样品台20的三维生物打印水凝胶支架，支架产生的后向散射光经原路返回至低相干干涉模块8，后续处理如图10所示。

系统的样品扫描和数据采集是同步进行的，在高速扫描模块15中，二维扫描振镜的扫描范围为毫米量级，扫描方式示意图如图8所示，其中图(a)表示OCT系统如何实现三维扫描，对于扫频OCT成像系统，通过扫频光源的波长扫描和傅立叶变换来实现z轴即轴向扫描；对于谱域OCT成像系统，通过光谱仪探测阵列的波长编码和傅立叶变换来实现z轴即轴向扫描。轴向扫描的同时，通过样品扫描模块的某一方向的时序控制实现x方向的扫描，构成一个二维横断面图像(XZ)，然后通过样品扫描模块另一方向的时序控制实现y轴的扫描，从而构成一个三维扫描，图(b)表示OCT三维扫描投影到xoy平面上的扫描示意图。图(c)表示如何通过二维高速物镜前扫描模块15和二维电动运动模块16实现大范围的XY平面扫描，每次二维扫描振镜扫描结束，会触发二维电机沿X方向移动一段距离，该距离在数值上比二维振扫描镜在X方向上扫描的最大范围略小(推荐小5到10um)，当二维电机停止后，再立即触发二维扫描振镜进行下一次高速扫描，依照此方式交替进行直到扫描至样品沿X轴的另一边缘，然后步进电机回到扫描行的初始点并沿Y轴方向移动一段略小于二维振扫描镜在Y方向上扫描的最大范围(推荐小5到10um)的距离。扫描的行和列数由被扫描样品的边长和二维扫描振镜在X和Y方向扫描的最大范围决定。

采用上述本发明系统进行支架打印的优化控制方法包括如下步骤：

(1)水凝胶支架的设计：

采用SolidWorks软件或其他的计算机辅助生物设计软件，设计同一几何结构，孔隙尺寸作为变量的一组支架，标注支架的主要几何形态参数，按照其尺寸的不同分别定义其型号，并根据OCT图像分析实验、特殊设计限制实验来进行支架型号分组。

(2)生物三维打印水凝胶支架

选择并制备好水凝胶生物墨水，测试水凝胶生物墨水的粘弹性，基于生物三维打印技术，根据水凝胶生物墨水的粘弹性，采用打印参数可控的生物三维打印设备，按照经验打印参数制造出上述设计支架模型，且每种支架模型至少制造5个样本。

(3)生物三维打印水凝胶支架的定量表征

基于光学相干层析扫描的生物三维打印水凝胶支架定量可视化装置，在不接触样本的情况下实现对三维打印水凝胶支架整体的扫描成像，获取所有已制造且需要定量表征的水凝胶支架的三维OCT图像，对获取的OCT图像进行图像处理和定量分析，获取支架的形态参数，包括但不限于支架的孔隙尺寸、支撑尺寸、孔隙表面积、孔隙体积、孔隙率等形态参数。

(4)支架设计与制造结果的对比分析

比较支架设计与实际制造结果间的差异，分析实际制造的水凝胶支架的形态参数与预设的孔隙尺寸之间的定量关联性，建立实际制造水凝胶支架形态参数与预设孔隙尺寸的经验公式，包括但不限于实际制造支架的孔隙尺寸、支撑尺寸、孔隙表面积、孔隙体积、孔隙率等形态参数，定量评价水凝胶三维打印过程的内在可控性。

(5)依据设计限制反馈控制三维打印水凝胶支架

以上一步分析的设计与打印的形态差异反馈指导设计限制组水凝胶支架的生物三维打印，根据建立的经验公式设置新的设计限制条件，优化打印设备的打印参数，以获得预期的结构制造。

图9给出第一次生物三维打印水凝胶支架的宏观图像、显微图像和OCT图像展示。

由于OCT采集到的是一系列XZ横断面图像，但生物三维打印水凝胶支架一般沿着XY方向离散堆积的，为了定量评估采集到的OCT数据并分析支架微结构，首先需要通过体绘制算法将大范围矩阵扫描模块中的每个子模块(即振镜扫描模块完成一次扫描)采集到的XZ横断面OCT图像生成三维OCT图像，然后再利用特征点匹配算法将生成的三维子模块一行行一列列的进行三维拼接，从而得到支架的整体三维OCT图片，接着再利用切面重组算法从整体三维OCT图像中提取正前面(en face)XY方向序列图，并对en face序列图经过增强优化、背景去噪、图像分割、形态开闭操作等处理提取出每层图像中的孔结构以便计算出PS和StS，最后再将此孔结构进行三维重建以方便后续基于体图像的分析。图像处理流程如图10(a)所示，图10(b)为流程效果图。其中图A为OCT采集到的XZ横断面图像，通过体绘制三维重建得到图B，提取正前面(en face)XY方向序列图图C，图D代表原始的en face图像，通过第一步的增强优化，调整图像对比度、亮度和γ值以增强孔隙区域与支撑部分的对比度，从而生成如图E，对图E采用5×5中值滤波器进行低通滤波，以减少背景散斑噪声，获得图像F；图F经强度阈值分割得到孔和实体的二值化图像，图G中孔隙区域的像素值I＝1，其他支撑部分则是I＝0。可以看到图G中某些孔区域内存在黑点，我们对图H进行形态闭操作，以平滑目标物边界而不改变其面积，填充目标内的细小空洞，得到图I。其中PS和StS通过图像处理后的二维en face图像定量分析测量，而孔隙率(Volume Porosity，VP)、孔隙表面积(PoreSurface Area，PSA)和孔隙体积(Pore Volume，PV)是在重建的三维图像上量化分析得出。

孔隙尺寸(PS)是指支架相邻支撑部分间距，可表示为：

其中b代表孔隙边界，s代表孔隙骨架。

实体支撑尺寸(StS)是指相邻孔隙I，J边缘间的最短距离，可表示为：

孔隙率(VP)是指支架内部的孔隙体积(V_pore)占支架总体积(V_total)的百分率，可表示为：

其中孔隙体积(V_pore)和总体积(V_total)都是通过对三维重建后的OCT图像进行量化分析得到，以像素数量的形式呈现。

孔隙表面积(PSA)是指孔隙部分的像素表面积值之和，可表示为：

其中g(x_i,y_j,z_k)代表坐标为x_i,y_j,z_k的像素表面积。

孔隙体积(PV)是指孔隙部分的像素体积值之和，可表示为：

其中I(x_i,y_j,z_k)代表坐标为x_i,y_j,z_k的像素体积。

所述的定量分析都是基于多个样本(n＝5)的测量，针对得出的测量结果使用方差分析法做统计分析，当数据差异性为p<0.05时认为有效。

基于采集的OCT图像，定量分析平均孔隙尺寸(PS)、平均实体支撑尺寸(StS)、平均孔隙率(VP)、平均孔隙表面积(PSA)、平均孔隙体积(PV)这五个量化参数设计值与实测形态参数间的差异。其中所有定量表征结果都是基于对已选的6个设计几何结构重复打印5次的样品的测量。通过对比分析可以看出六种支架的实际PS值都小于预设值，而实际StS值则相对稳定，基本保持在250μm左右，但大于预设尺寸(210μm)。此外，还可看出StS值比预设值大，而实际PS、VP、PSA、PV值都偏小，表明StS的量化差异引起了其他四个形态参数的差异。分析StS增加，从而引起其他形态特性不匹配的原因主要包括以下几点：

(1)打印喷头针孔内直径定义了支架的支撑尺寸，但支架交联过程以及水凝胶固有的平衡溶胀效应都会导致实际支撑尺寸的增加。另一方面，水凝胶材料的粘弹性，打印时的XY方向行进速度、喷头推动气压、喷头及打印平台温度等打印参数的设置也会影响最终的出丝直径。

(2)支撑结构以90°构建，而以同一角度构建支架结构会导致支撑厚度的增加和支撑形状的波浪化。

(3)海藻酸钠与明胶的配比不同也会影响最后水凝胶材料的机械强度，水凝胶材料机械强度低会引起孔的坍塌。

上述步骤完成三维生物打印设备在设定打印参数下打印出的实际结构与设计值的偏差原因分析，之后，需要测试时间因素是否会对打印支架的孔隙尺寸造成影响，两者结合是为了分析生物三维打印设备打印水凝胶支架是否具有批内和批间重复控制的可能性。可以设计基于OCT成像分析技术的对比实验来验证打印过程是否具有批间重复控制的可能，实验可以选定同一尺寸(如po700)，在五个时间点打印，然后测量每个时间点的孔隙尺寸，统计最小值与最大值间的差异，若测试结果显示两批次间最大差值小于20μm，可以认为打印支架的孔隙尺寸相对时间变化来讲是精确可控的，从而排除了时间因素对打印支架结构参数的影响。

进一步分析打印出支架的PS、VP、PSA、PV相对设计PS的相关性，将打印出支架的PS、VP、PSA、PV通过多项式拟合的方式表示为各个参量与设计的PS的关联函数，若所打印支架的PS、VP、PSA、PV与设计的PS可以表示为一阶线性拟合函数，则打印水凝胶支架的实际形态结构参数与设计的PS有较好的线性关系，可以利用总结出的经验相关函数作为再次打印的输入函数来反馈调整支架的设计。利用经验相关函数反馈指导生物三维打印水凝胶支架再次制备预设孔径为300μm和700μm的多孔结构，制备出的支架的OCT图像和量化对比结果如图11所示。从图11(a)可以看出后者图像(XZ面、YZ面)水凝胶灰色区域的横截面柱高度一致且无粘连，具体表现在支架上为支架表面较平滑且保持了正方形的孔隙形状。同时对比前后volren图，分析得经改进后打印出的支架孔隙部分和实体支撑部分的形状与预设的形状一致，且没有出现相邻孔隙的粘连或堵塞。量化参数对比分析结果图11(b)表明相比第一次支架打印，改进后所打支架的预设值和测量值间的差异明显缩小，变化范围保持在1％—2％区间，充分证明了该方法能有效地降低水凝胶支架平均孔隙尺寸的不一致。

本发明公开了一种三维打印水凝胶支架的优化控制系统与方法。基于光学相干层析扫描的生物三维打印水凝胶支架定量可视化系统可以定量表征生物三维打印水凝胶支架的整体和局域的形态结构特征，可以为支架优化设计、生物三维打印过程定量控制提供有力工具。本发明公开的一种三维打印水凝胶支架的优化控制系统与方法为改进生物3D打印技术、精准控制生物3D打印过程奠定了理论和技术基础，对推动具有功能的人工组织器官的制造具有重要意义。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种三维生物打印水凝胶支架的优化控制方法，基于打印参数可控的三维生物打印设备和基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置集成设备，其特征在于该方法采用光学相干层析扫描成像技术定量表征三维打印水凝胶支架的形态参数，同时对照初时设计与实际打印间的形态差异，获得初时设计与实际打印之间的量化关联性，并基于该量化关联性反馈指导打印参数设置，通过两次闭环反馈制造出与设计形态参数尽量匹配的支架结构；

其中两次闭环反馈具体如下：

(1)第一次闭环采用计算机软件设计支架，用来评价水凝胶三维打印过程的内在可控性：

通过计算机软件设计同一几何结构，某支架形态参数作为变量的一组支架，并采用生物三维打印技术打印出支架，并记录下不同支架的各形态参数作为设计值；

所述的支架形态参数为能够表征支架特征结构和功能的参数，包括但不限于支架整体的孔隙尺寸PS、实体支撑尺寸StS、孔隙率VP、孔隙体积PV、孔隙表面积PSA；

(2)第二次闭环采用设计与实际打印的形态差异作为输入，反馈控制支架的设计与打印，以获得预期的支架结构，用以定量评价水凝胶三维打印过程的内在可控性：

对依据上一步设计生物三维打印得到的支架整体进行扫描成像，得到支架的三维OCT图像，然后对其进行图像处理和定量分析，得到打印支架各形态参数的打印实际值；比较该支架各形态参数的设计值与打印实际值间的差异，分析打印支架各形态参数的打印实际值与作为变量的某形态参数设计值之间的定量关联性，建立打印支架各形态参数打印实际值与作为变量的某形态参数设计值的经验公式，定量评价水凝胶三维打印过程的内在可控性；最后使用经验公式调整设计和生产间支架形态参数的差异；

所述的对依据设计值生物三维打印得到的支架整体进行扫描成像具体是首先通过高速物镜前扫描模块获取支架局部的高分辨三维OCT图像，并利用二维电机运动模块在整个检测区域运动，从而实现整个检测区域内所有待检测支架的整体扫描，然后利用特征点匹配算法三维拼接成支架的整体三维OCT图像；

高速物镜前扫描模块、二维电机运动模块和样品台有两种组合方式，一种是高速物镜前扫描模块通过夹持装置直接安装在二维电机运动模块上，两者组合为一个整体探头，而样品台独立，仅负责Z轴方向运动实现扫描光束聚焦调节；一种是高速物镜前扫描模块与二维电机运动模块分离，二维电机运动模块与样品台整合，样品台需方便支架专用培养皿的固定和更换，且负责Z轴方向运动实现扫描光束聚焦调节；

采用的基于光学相干层析扫描的三维生物打印水凝胶支架定量可视化装置集成设备的成像范围为10mm×10mm×10mm；

所述的图像处理和定量分析是指利用切面重组算法从上述整体三维OCT图像中提取正前面序列图，并对en face序列图经过增强优化、背景去噪、图像分割、形态开闭操作图像处理，提取出每层图像中的孔结构，通过公式(1)、(2)计算出孔隙尺寸PS和实体支撑尺寸StS；最后再将此孔结构进行三维重建，然后根据图像分割出的支架实体结构、孔隙、通道自动选择相互隔离的感兴趣目标区域，并基于智能模式识别算法进行自动标记和分类，且基于形态操作算法对相互隔离的ROI进行量化分析，定量分析ROI的形态参数，包括其直径、面积、形状因子参数，并通过公式(3)、(4)、(5)计算得到支架整体的孔隙率VP、孔隙体积PV及孔隙表面积PSA；

孔隙尺寸PS是指支架相邻支撑部分间距，可表示为：

其中b代表孔隙边界，s代表孔隙骨架；

实体支撑尺寸StS是指相邻孔隙I，J边缘间的最短距离，可表示为：

孔隙率VP是指支架内部的孔隙体积V_pore占支架总体积V_total的百分率，可表示为：

其中孔隙体积V_pore和总体积V_total都是通过对三维重建后的OCT图像进行量化分析得到，以像素数量的形式呈现；

孔隙表面积PSA是指孔隙部分的像素表面积值之和，可表示为：

其中g(x_i,y_j,z_k)代表坐标为x_i,y_j,z_k的像素表面积；

孔隙体积PV是指孔隙部分的像素体积值之和，可表示为：

其中I(x_i,y_j,z_k)代表坐标为x_i,y_j,z_k的像素体积。