CN105473742A - miR-34活性的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地基于以下发现：miR-34不依赖于p53。已发现miR-34在不依赖TP53的肿瘤抑制途径中起作用。具体地，发现癌细胞生长的miR-34诱导的抑制在p53正常的和p53缺陷的细胞中是相同的。因此，miR-34在不与p53耦合的肿瘤抑制过程中具有更主要的作用。在不存在p53的情况下，不同于某些其他的miRNA，miR-34足以诱导已知由p53调控的基因的上调，该基因包括但不限于p21CIP1/WAF1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且诱导HDAC1的下调。因此，这些生物标志物可用作miR-34活性的生物标志物。本发明还基于以下发现：这些生物标志物中的一些对于对miR-34活性的治疗响应是不可或缺的，因此是miR-34活性的先决生物标志物。

Description

miR-34活性的生物标志物
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年6月24日的USSN61/838,847和提交于2013年8月28日的USSN61/870,997的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文。
美国政府的权利
本发明是在国立卫生研究院第1R43CA134071和1R43CA137939号基金支持下进行的工作中作出的。美国政府可拥有本发明的权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并且通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于6月23日，被命名为“112172-242SequenceListingTEXT”并且为30,360字节。
技术领域
本发明总体上涉及癌症疗法，并且更具体地，其涉及在疾病治疗、诊断、预后和/或疾病进展的评估中涉及诸如miR-34的microRNA(miRNA)分子的方法和组合物。
背景技术
microRNA-34(miR-34)是一种强肿瘤抑制物，其在许多实体和血液癌症类型中显示功能的丧失(Lodygin等人,CellCycle7(16):2591-600(2008)；Gallardo等人,Carcinogenesis30(11):1903-9(2009)；Chim等人,Carcinogenesis31:745-750(2010))。可能是通过阻抑控制增殖、衰老、凋亡和转移的过多的癌基因，microRNA-34抑制广泛范围的癌细胞(Hermeking,CellDeathDiffer17(2):193-9(2010)；Bader,FrontGenet3(120)(2012))。miR-34可能还干扰癌干细胞的生长(Ji等人,PLoSOne,4(8):e6816(2009)；Liu等人,NatMed17(2):211-5(2011))，这为开发miR-34疗法提供了强大的基本原理。miR-34的治疗应用的证据已经在肺、肝、前列腺和淋巴瘤的鼠肿瘤模型中产生，它们显示出响应于负载有合成miR-34模拟物的纳米颗粒的全身递送的强烈肿瘤抑制(Bader,FrontGenet3(120)(2012)；Liu等人,NatMed17(2):211-5(2011)；Trang等人,MolTher19(6):1116-22(2011)；Wiggins等人,CancerRes70(14):5923-30(2010)；Craig等人,Leukemia(2012))。基于miR-34的疗法目前处于I期临床试验中。
近来的报道已经增加了对miR-34的作用的更深入的了解，所述报道证明了肿瘤抑制物TP53(p53)转录诱导了全部三个miR-34家族成员miR-34a/b/c的表达(Bommer等人,CurrBiol,17(15):1298307(2007)；Chang等人,MolCell26(5):74552(2007)；He等人,Nature447(7148):11304(2007)；RaverShapira等人,MolCell26(5):73143(2007)；Tarasov等人,CellCycle6(13):158693(2007))。TP53还提高了miR-215、miR-192和miR-194的内源性水平，这三种均具有在培养中抑制癌细胞生长的能力(Braun等人,CancerRes68(24):10094-104(2008)；Georges等人,CancerRes68(24):10105-12(2008)；Pichiorri等人,CancerCell18(4):367-81(2011))。尽管miR-215和miR-192在单独的基因组基因座上编码，但它们共享相同的种子序列(90.5％的总体序列同源性)并因此可被总称为miR-215/192。对于一些miRNA，TP53与miRNA之间的正调控是相互的——miR-215/192通过阻抑MDM2(也被称为HDM2)来刺激TP53活性，MDM2是通过蛋白酶体降解来负调控TP53稳定性的泛蛋白连接酶(Pichiorri等人,CancerCell18(4):367-81(2011)；Momand等人,Cell69(7):1237-45(1992)；Oliner等人,Nature358(6831):80-3(1992))。类似于miR-215/192，通过阻抑使TP53失活的NAD依赖性脱乙酰酶SIRT1(沉默信息调控因子1)、编码负调控TP53反式激活的MDM2样蛋白质的MDM4和编码与TP53DNA结合位点的子集结合的转录因子的YY1，miR-34a在对TP53的正反馈回路中起作用(Yamakuchi等人,ProcNatlAcadSciUSA105(36):13421-6(2008)；Mandke等人,PLoSOne7(8):e42034(2012))。因此，TP53对于miR-34诱导的表型可能是功能性需求。
鉴于TP53在癌症中的高突变率，该先决条件实质上将限制基于miR-34的疗法应用于具有完整TP53的患者。尽管可用数据支持了TP53增强miR-215/192的抑制活性的观点(Pichiorri等人,CancerCell18(4):367-81(2011))，但在miR-34诱导的肿瘤抑制中对于TP53的需求是有争议的，并且TP53的实际贡献是未知的。
因此，尽管microRNA在多种癌症的诊断和治疗中的应用已经取得了重大进展，但特定的microRNA疗法可能在某些亚群中没有效果或效果不大。在某些亚群中需要更好的解决方案，例如，在TP53缺陷的细胞或癌症类型中。预测患者是否对特定疗法有反应或快速确定该患者是否对特定疗法发生反应的能力可减少与癌症治疗相关的时间和成本，同时提供更好的结果。
发明内容
本发明至少部分地基于以下发现：miR-34的功能不依赖于p53。已发现miR-34在不依赖于TP53的肿瘤抑制途径中起作用。具体地，发现癌细胞生长的miR-34诱导的抑制在p53正常的和p53缺陷的细胞中是相同的。因此，miR-34在未与p53耦合的肿瘤抑制过程中具有更主要的作用。在不存在p53的情况下，不同于某些其他的miRNA，miR-34足以诱导已知被p53调控的基因的上调，该基因包括但不限于p21WAF1/CIP1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且诱导HDAC1的下调。因此，本发明认为这些生物标志物可用作miR-34活性的生物标志物。在各种实施方案中，先决生物标志物是DNA、mRNA或蛋白质(或其组合)。在先决生物标志物是DNA时，它可以是非沉默的和没有任何失活突变的基因的DNA。本发明还基于以下发现：这些生物标志物中的某些对于对miR-34活性的治疗响应是不可或缺的，因此是miR-34活性的先决生物标志物。
治疗方法
在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法。提供了两类总的治疗方法。第一组方法包括筛选步骤，该筛选步骤采用miR-34活性的一种或多种先决生物标志物来确定miR-34疗法对于受试者是否为合适的治疗方法。第二组方法包括测定在受试者中miR-34活性的生物标志物的相对水平以确定受试者对通过miR-34治疗剂治疗的响应。
在一些实施方案中，第一组提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：
(a)针对存在或不存在miR-34活性的至少一种先决生物标志物筛选受试者；
(b)如果确定存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用miR-34治疗剂；以及
(c)如果不存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用供替代的疗法，
从而治疗该受试者。所述至少一种先决生物标志物可选自p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2和HDAC1。在一些方面，所述至少一种先决生物标志物包括p21CIP1/WAF1，而在一些方面，筛选受试者所针对的唯一的先决生物标志物为p21CIP1/WAF1。例如，所述至少一种先决生物标志物可选自p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且所述至少一种先决生物标志物的存在包括等于或高于参考水平的表达水平或活性水平。在另一实例中，所述至少一种先决生物标志物是HDAC1，并且所述至少一种先决生物标志物的存在包括等于或低于参考水平的表达水平或活性水平。
在一些实施方案中，第二组提供了确定用miR-34治疗剂治疗的受试者对癌症疗法的响应的方法，所述方法包括：
(a)测定该受试者中miR-34活性的至少一种生物标志物的第一水平；
(b)向该受试者施用miR-34治疗剂；
(c)测定该受试者中该生物标志物的第二水平；
(d)如果相对于第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效，则进一步向该受试者施用miR-34治疗剂；以及
(e)如果相对于第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效不足，则向该受试者施用供替代的疗法，
从而确定该受试者对癌症疗法的响应并提供合适的治疗。该生物标志物可选自p21CIP1/WAF1、p53、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2和HDAC1。在一些方面，步骤(b)和(d)中的miR-34治疗剂是相同的。
受试者可患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。在一些方面，已经确定受试者具有p21CIP1/WAF1阳性癌细胞。例如，可确定受试者具有p21CIP1/WAF1阳性癌细胞和p53缺陷的癌细胞。例如，可确定受试者具有含有p21CIP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因和杂合失活的(-/-)p53基因的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有含有p21CIP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因且缺乏功能性p53蛋白质的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有功能性p21CIP1/WAF1蛋白质和非功能性或缺失p53蛋白质。受试者可患有血液系统恶性肿瘤，例如，白血病(急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)或其他白血病)；淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(全部四种亚型)、滤泡性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(全部亚型))；骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)；或骨髓发育不良综合征。
miR-34治疗剂可包括miR-34并且还可任选包括miR-215和miR-192中的至少一种。miR-34可以是miR-34a、b或c，或miR-449a、b或c。施用miR-34治疗剂之后细胞增殖的水平可能下降。施用miR-34治疗剂之后肿瘤大小或进展可能下降或减慢。
在一些方面，供替代的疗法可以是非miR-34的microRNA疗法或非microRNA疗法。例如，供替代的疗法可选自中断的疗法、化学疗法、放射疗法、手术、姑息疗法、miR-215和miR-192。供替代的疗法可以是非miR-34的microRNA疗法和非microRNA疗法的任何组合。例如，供替代的疗法可包括miR-215和miR-192中的至少一种。
附图说明
图1显示TP53和miR-34的共同的和各自的肿瘤抑制途径。
图2A-2E显示在同基因癌细胞系中诱导TP53基因之后的内源性mRNA和miRNA水平。TP53的mNRA水平相对于TP53+/-细胞(SW48、HCT116、RKO)或TP53-/-细胞(MCF10A；表达＝1)中的水平进行归一化。来自DLD-1细胞的数据相对于DLD-1-/SIL细胞进行归一化。全部其他数据相对于TP53缺陷的细胞中的表达水平(-/-；相对表达＝1)进行归一化。显示了平均值和标准差。n，未检测；*，由于不存在于参考细胞中，数据相对于标准化的PCR阈值进行归一化。
图3A-3D显示了在同基因癌细胞系中miR-34a对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
图4A-4D显示了在同基因癌细胞系中miR-34c对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
图5A-5D显示了在同基因癌细胞系中miR-215对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
图6A-6D显示了在同基因癌细胞系中miR-192对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
图7A显示了在同基因RKO细胞中miR-34a对癌细胞增殖的抑制。通过来确定细胞增殖。显示了平均值和标准差。
图7B显示了在同基因RKO细胞中miR-34c对癌细胞增殖的抑制。通过来确定细胞增殖。显示了平均值和标准差。
图8A和8B显示了在用miR-34a或miR-215转染的同基因SW48细胞中在miR-34a/TP53轴中起作用的靶基因的内源性表达水平。图8A显示了SIRT1、MDM4、BCL2、MET和p53的水平而图8B显示了PUMA、p21和MDM2的水平。数值相对于模拟转染的细胞中的数值(＝1)进行归一化。显示了一式两份实验的平均值和标准差。n，未检测到。
图9A和9B显示了p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2mRNA在用miR-34a转染的同基因细胞系中的内源性水平。全部的值相对于模拟转染的细胞中的值(＝1)进行归一化。显示了平均值。
图10显示了在HDAC1转录物的3’UTR中的miR-34a结合位点。显示了miR-34a与野生型(wt)和突变的(mut)HDAC13’UTR序列的碱基配对。小写字母，miR-34a残基；大写字母，mRNA残基；突出显示的碱基推测参与碱基配对；粗体，miRNA种子序列；加下划线的，突变的残基。
图11显示了在用miR-34a转染的同基因SW48细胞中的HDAC1mRNA水平。值相对于模拟转染的细胞中的值进行归一化。
图12A显示了与HDAC13’UTR融合的萤光素酶转录物在用miR-34a或miR-215转染的SW48结直肠癌细胞和H1299肺癌细胞中的表达。相对光单位相对于miR-215转染的细胞中的相对光单位(100％)进行归一化。P值由双尾Studentt-检验获得，n.s.，统计学上不显著的。
图12B显示了相对于各自正常邻近组织归一化的、在来自NSCLC患者的一组14个肿瘤中HDAC1mRNA与miR-34水平之间的相关性。通过qRT-PCR来确定内源性表达水平。通过Pearson法生成相关系数；通过F检验(Graphpad)计算P值。
图13显示了用miRNA和siRNA转染对同基因TP53阴性SW48细胞中生物标志物蛋白质表达的影响。
图14显示了用miRNA和siRNA转染对同基因TP53阴性RKO细胞中生物标志物蛋白质表达的影响。
图15显示了用miRNA和siRNA转染对同基因TP53阳性RKO细胞中生物标志物蛋白质表达的影响。
图16A-16G显示了在用siRNA瞬时转染的同基因SW48细胞中各种mRNA的内源性mRNA表达水平。表达水平相对于用阴性对照siRNA(si-NC)转染的细胞的表达水平进行归一化。显示了一式三份实验的平均值和标准差。
图17显示了用siRNA和miRNA转染的同基因SW48细胞的细胞增殖。值相对于模拟转染(＝100％)进行归一化。显示了平均值和标准差。P值由双尾Studentt-检验获得。虚线表示在用miR-34a转染的细胞中的细胞增殖水平。
图18A显示了曲古抑菌素A对同基因SW48细胞系中的增殖的影响。值相对于未处理的细胞(NT)进行归一化。
图18B显示了qRT-PCR分析，该分析使用来自用曲古抑菌素A处理的细胞的RNA样品测定p21CIP1/WAF1mRNA水平。值相对于未处理的细胞(NT)进行归一化。
图19显示了在用浓度渐增的miR-34a转染的同基因RKO细胞中，p21mRNA表达水平和增殖速率的非线性回归分析。全部值相对于模拟转染的细胞中的值(＝1)进行归一化。显示了平均值。标准差包括在内，但是太小而无法在图中看到。
图20显示了在将miRNA模拟物和siRNA瞬时转染至同基因RKO细胞中之后，通过Western分析测得的生物标志物蛋白质表达。
图21显示了在用miRNA模拟物和siRNA瞬时转染之后同基因RKO细胞中的细胞增殖。增殖数据通过评估。值相对于用阴性对照转染的细胞(100％)进行归一化。显示了平均值和标准差。P值由双尾Studentt-检验获得。
图22显示了在用miRNA模拟物和siRNA瞬时转染之后同基因SW48细胞中的细胞增殖。增殖数据通过评估，并且相对于用阴性对照转染的细胞(100％)进行归一化。显示了平均值和标准差。P值由双尾Studentt-检验获得。
图23显示了在用miRNA模拟物和siRNA瞬时转染之后同基因Hep3B肝细胞癌细胞中的细胞增殖。增殖数据通过评估，并且相对于用阴性对照转染的细胞(miNC+siNC；100％)进行归一化。显示了平均值和标准差。针对EG5的siRNA(Kif11)用作癌细胞生长抑制的阳性对照。
图24A显示了在用基于miR-34a的疗法治疗的肝癌小鼠模型中p21CIP1/WAF1的上调。携带在肝中原位生长的人类Hep3B肿瘤的小鼠经由静脉内尾静脉注射被给予单剂量的基于miR-34的疗法(n＝3)。作为对照，向荷瘤小鼠注射空的脂质体(n＝2)或负载有阴性对照miRNA的脂质体(miR-NC2；n＝2)。24小时后，收集肿瘤组织并且通过Western分析探测蛋白质裂解物。肌动蛋白表达用作加样对照。
图24B显示在培养的Hep3B肝癌细胞中p21CIP1/WAF1的上调。细胞用miR-34a或miR-NC2瞬时转染。蛋白质裂解物通过Western分析针对p21CIP1/WAF1表达进行探测。肌动蛋白用作加样对照。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下发现：miR-34的功能不依赖于p53。已发现miR-34在不依赖TP53的肿瘤抑制途径中起作用。具体地，发现癌细胞生长的miR-34诱导的抑制在p53正常的和p53缺陷的细胞中是相同的。因此，miR-34在不与p53耦合的肿瘤抑制过程中具有更主要的作用。在不存在p53的情况下，不同于某些其他的miRNA，miR-34足以诱导已知被p53调控的基因的上调，该基因包括但不限于p21CIP1/WAF1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且诱导HDAC1的下调。因此，这些生物标志物可用作miR-34活性的生物标志物。本发明还基于以下发现：这些生物标志物中的一些对于对miR-34活性的治疗响应是不可或缺的，因此是miR-34活性的先决生物标志物。还发现p21CIP1/WAF1是miR-34的下游的关键效应分子。与p21CIP1/WAF1相反，p53可被miR-34绕过以用作不依赖p53的肿瘤抑制物。图1示出了miR-34和p53的共同的和各自的抑制途径。
miR-34置换已成为治疗癌症的有前途的方法。miR-34被p53转录诱导。然而，miR-34还在正反馈回路中激活p53，怀疑这是miR-34表型所需要的。已经使用一组同基因癌细胞系确定了p53与miR-34之间和其他p53调控的miRNA(包括miR-215/192)之间的功能关系，该组细胞系仅在它们的内源性p53状态方面不同。癌细胞生长的miR-34诱导的抑制在p53正常的和p53缺陷的细胞中是相同的。与miR-34相反，miR-215/192通过p53起作用。在不存在p53的情况下，miR-34，而非miR-215/192，足以诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p21CIP1/WAF1(CDKN1A)的上调。如此，miR-34在患者中可能是治疗活性的，而与他们的p53状态无关，这是因为不同于p53的其他下游靶标，miR-34在p53正常的和p53缺陷的细胞中表现出相似的活性。miR-34的不依赖p53的功能还具有重要的治疗意义，并可帮助预测哪些患者最有可能响应特定疗法，以及确定患者响应特定疗法的程度。
组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)被鉴定为miR-34的直接靶标，而且HDAC1的阻抑导致p21CIP1/WAF1的诱导并模拟了miR-34细胞表型。p21CIP1/WAF1的消耗尤其干扰了miR-34抑制癌细胞增殖的能力。数据提示，miR-34控制了先前留给p53的肿瘤抑制物途径，并提供了针对癌症患者的有吸引力的治疗策略，而与他们的p53状态无关。
已建立的范例将miR-34看作细胞效应分子，该分子通过阻抑与细胞周期进程和凋亡有关的基因在TP53的下游起作用。然而，我们的数据提示，miR-34具有不依赖于且平行于p53的更加主要的作用。在此提供了对于该论点的支持。miR-34a基因的不依赖TP53的转录调控(Christofferson等人,CellDeathDiffer17(2):236-45(2009))，以及在不存在miR-34的情况下显示完整p53响应的miR-34敲除小鼠中所进行的观察(Concepcion等人,PLoSGenet8(7):e1002797(2012))，进一步证实了单独的miR-34途径的存在。miR-34和p53可创建具有重叠功能的两个途径的界面并彼此相互激活——p53通过转录，而miR-34通过SIRT1、YY1和MDM4的转录后阻抑。
在p53缺陷的细胞中，p21CIP1/WAF1的miR-34诱导的表达是HDAC1阻抑的间接效应。先前已表明HDAC1与p21基因(CDKN1A)的调控有关。支持证据来自显示升高水平的p21CIP1/WAF1的HDAC1缺陷的胚胎干细胞和p53突变的人类骨肉瘤细胞，在该细胞中用HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理后诱导p21CIP1/WAF1表达(Sowa等人,BiochemBiophysResCommun(1997)；Lagger等人,EmboJ21(11):2672-81(2002))。在这些研究中，CDKN1A启动子中的两个Sp1结合位点被鉴定为TSA响应元件，这提示，在不存在TP53的情况下，Sp1是控制CDKN1A基因活化的转录因子。我们的数据表明，p21CIP1/WAF1是miR-34功能的功能性先决条件。然而，p21CIP1/WAF1消耗的影响在细胞系之间是不同的。p21CIP1/WAF1消耗完全消除了RKO细胞中miR-34a的抗增殖活性，而在SW48细胞中仅削弱其抗增殖活性。同样地，miR-34的抑制活性在缺乏p21CIP1/WAF1的TP53阴性Hep3B肝癌细胞中没有完全降低但显著减弱(数据未示出)。相反，先前的研究没有揭示在HCT116p21-/-细胞中的p21CIP1/WAF1依赖性miR-34a表型(He等人,Nature447(7148):1130-4(2007))。因此，p21CIP1/WAF1消耗的影响似乎在细胞系之间有所不同。miR-34表型有可能另外受到在癌症中经历变化的其他分子事件的控制。尽管CDKN1A的缺失可导致小鼠中自发的肿瘤形成，但人类癌症中的功能丧失性体细胞突变是罕见的(Lagger等人,EmboJ21(11):2672-81(2002))。然而，在结直肠癌、宫颈癌、食管癌和肺癌中已经注意到降低的表达，并且在其中的一些癌症中，这是由于CDKN1A启动子的高甲基化(Dotsch等人,ColdSpringHarbPerspectBiol2(9):a004887(2010)；Toledo等人,CancerCell9(4):273-85(2006))。因此，miR-34模拟物可能在具有沉默的或降低的CDKN1A的癌症中具有较低活性，CDKN1A应该被看作对miR-34疗法的响应的“预测性”标志物，即，miR-34活性的先决标志物。
p21CIP1/WAF1的miR-34特异性诱导提供了对于其抑制p53正常的和p53缺陷的细胞的恒定能力的解释。这与miR-215/192形成鲜明对比，miR-215/192在不存在p53的情况下不能诱导p21WAF1/CIP1，因而在TP53-/-细胞中具有降低的抑制活性。用miR-215/192生成的数据符合先前所描述的模型，其中miR-215/192在对TP53的正反馈回路中通过MDM2的阻抑起作用(Pichiorri等人,CancerCell18(4):367-81(2011))。有趣的是，所报道的经由SIRT1、YY1或MDM4从miR-34至TP53的正反馈似乎并没有促成抗增殖miR-34表型，尽管事实是这些蛋白质得到表达并被miR-34a下调。鉴于siRNA对这些基因产物的影响不太大，它们可能并不参与即时的抗增殖miR-34响应，但可能在以后的时间点显示增加的影响。
癌细胞增殖的miR-34诱导的抑制不依赖于p53，并且提示miR-34疗法在癌症患者中是有效的，而与p53状态无关。miR-34阻抑HDAC1和诱导p21CIP1/WAF1的能力显著巩固了它作为主要肿瘤抑制物的地位，并且补充了它在其他重要的致癌途径中的功能。
筛选和治疗方法
因此，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法和组合物。本发明还提供了确定有待治疗或正在用miR-34治疗剂治疗的受试者对癌症疗法的响应的方法，包括评价或预测治疗响应。
本发明还提供了p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2或HDAC1单独或组合作为miR-34活性的预测性生物标志物的用途。本发明还提供了p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2或HDAC1单独或组合作为生物标志物用于确定对包括施用miR-34治疗剂的癌症疗法的响应的用途。在使用中，该miR-34可以是miR-34a、b或c，或者miR-449a、b或c。
在一些实施方案中，所述治疗患有癌症的受试者的方法包括针对存在或不存在miR-34活性的至少一种先决生物标志物筛选受试者。在一些实施方案中，该方法包括：
(a)针对存在或不存在miR-34活性的至少一种先决生物标志物筛选受试者，
(b)如果确定存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用miR-34治疗剂，以及
(c)如果不存在miR-34先决生物标志物，则向该受试者施用供替代的疗法，
从而治疗该受试者。
在一些实施方案中，所述先决生物标志物可以是p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2或HDAC1。例如，可针对存在或不存在p21CIP1/WAF1筛选受试者，如果确定存在p21CIP1/WAF1，则可向该受试者施用miR-34治疗剂。在一些实施方案中，在施用miR-34治疗剂后细胞增殖的水平降低。在一些实施方案中，已经确定受试者具有p21阳性癌细胞。例如，已经确定受试者具有p21阳性和p53缺陷的癌细胞。例如，可确定受试者具有含有p21CIP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因和杂合失活的(-/-)p53基因的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有含有p21CIP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因且缺乏功能性p53蛋白质的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有功能性p21CIP1/WAF1蛋白质和非功能性或缺失p53蛋白质。可能为p21阳性和p53缺陷的癌症的实例包括p21阳性/p53阴性癌症和各种类型的癌症，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、膀胱癌(Koga等人,JpnJCancerRes91(4):416-23(2000))、食管癌(Nakamura等人,DisEsophagus17(4):315-21(2004)、乳腺癌(Thor等人,BreastCancerResTreat61(1):33-43(2000))和胃癌(Xiangming等人,148(2):181-8(2000))。
在一些实施方案中，所述确定用miR-34治疗剂治疗的受试者对癌症疗法的响应的方法包括：
(a)测定该受试者中miR-34活性的至少一种生物标志物的第一水平，
(b)向该受试者施用miR-34治疗剂，
(c)测定该受试者中该生物标志物的第二水平，
(d)如果相对于第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效，则进一步向该受试者施用miR-34治疗剂，以及
(e)如果相对于第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效不足，则向该受试者施用供替代的疗法，
从而确定该受试者对癌症疗法的响应并治疗该受试者。
在步骤(b)和(d)中施用的miR-34治疗剂可以是相同的或不同的。供替代的疗法可以是(i)非miR-34的microRNA疗法，(ii)非microRNA疗法，或(iii)(i)和(ii)的任何组合。例如，供替代的疗法可包括miR-215或miR-192中的至少一种。在一些实施方案中，确定该响应可以是确定该治疗将花费与另一治疗相比更长的时间或更短的时间。
miR-34治疗剂
MicroRNA(miRNA)是天然存在的小的非编码RNA分子，它在转录后调节基因表达并通过调控多个基因产物和细胞途径决定细胞命运。
先前证明了miR-34参与许多细胞活性的调控，这些细胞活性代表了癌症疗法和其他疾病和病症的疗法的干预点(美国专利号7,888,010和8,173,611，其通过引用并入本文)。miR-34还通过其调控许多关键癌基因的表达的能力作为肿瘤抑制物起作用(美国专利申请公开号2009/0227533，其通过引用并入本文)。被miR-34直接或间接调控的癌症相关基因有血管生成素、极光激酶B、BCL10、BRCA1、BRCA2、BUB1、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、CDK-4、CDK抑制剂2C、FAS、叉头框M1、HDA-C1、c-Jun、MCAM、Mcl-1、c-Met、MybL2、NF1、NF2、PI3-激酶、polo-样激酶1、R-RAS、SMAD3、TGFβ受体、TPD52肿瘤蛋白D52和Wnt-7b。因此，miR-34控制作为细胞增殖和存活的关键调节物的蛋白质的活性。这些靶标在人类癌症中被频繁地解除调控。
MicroRNA-34置换疗法已成为治疗癌症的有前途的方法，并且目前处于I期临床试验中。miR-34被p53转录诱导。miR-34还在正反馈回路中激活p53，先前文献提示这可能是miR-34表型所需要的。然而，TP53基因中的突变是在人类癌症中发现的最常见的基因变化，其在全部癌症的大约一半中发生。
miR-34疗法是包含miR-34治疗剂的疗法。miR-34疗法可包括包含miR-34治疗剂的联合疗法。例如，miR-34疗法可包含miR-34治疗剂并且还包含另一microRNA治疗剂，诸如miR-215(SEQIDNO:1)或miR-192(SEQIDNO:2)。在另一实例中，miR-34疗法可包含miR-34治疗剂并且还包含非microRNA疗法，诸如化学疗法、放射疗法或手术。
miR-34治疗剂是增加受试者中miR-34的量的药剂。在一些实施方案中，miR-34治疗剂包括人miR-34及其类似物。miR-34可包括但不限于miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b、miR-449c、修饰的miR-34核酸及其任何组合。作为寡核苷酸，miR-34治疗剂可以是双链或单链的。在一些实施方案中，miR-34包含miR-34a(SEQIDNO:3)、miR-34b(SEQIDNO:4)或miR-34c(SEQIDNO:5)的种子序列(表1)。在一些实施方案中，miR-34包含miR-449a(SEQIDNO:6)、miR-449b(SEQIDNO:7)或miR-449c(SEQIDNO:8)的种子序列(表1)。这些microRNA是本领域公知的，并且本领域技术人员将会理解，它们包括传统上天然存在的序列(本文提供的)和任何化学修饰的形式及其序列同源物。一般而言，所用的miRNA是17-25个核苷酸长的双链RNA分子，具有两个单独的链或发夹结构。被称为“引导链”的两条链中的一条含有与给出的相应miRNA的种子序列相同或基本互补的序列。如本文所用的“基本互补”意指允许至多1或2个错配和/或缺失。在一些实施方案中，引导链包含与种子序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同源的序列。在一些实施方案中，另一条链(“过客链”)包含与本文提供的相应全长序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。可使用各种miR-34治疗剂，例如，美国专利号8,173,611、美国专利申请公开号2009/0227533和2012/0288933中描述的那些，其通过引用并入本文。
表1：miR-34家族区。加下划线的序列部分代表种子区。
通常，miR-34在脂质体中配制，例如，美国专利号7,858,117和7,371,404、美国专利申请公开号2009/0306194和2011/0009641中描述的那些脂质体。其他递送技术是可用的，包括表达载体、脂质或各种配体偶联物、基于聚合物的纳米颗粒等。
miR-34治疗剂还可进行化学修饰；例如，修饰的miR-34可以在过客链上具有5’帽(例如，NH2-(CH2)6-O-)和/或在同一条链的第一和第二核苷酸处具有错配。其他可能的化学修饰可包括骨架修饰(例如，硫代磷酸酯、吗啉代化合物(morpholinos))、核糖修饰(例如，2’-OMe、2’-Me、2’-F、2’-4’-锁定/桥接的糖(例如，LNA、ENA、UNA)以及核碱基修饰(参见例如，Peacock等人,2011.JAmChemSoc.,133(24):9200-9203)。在某些实施方案中，miR-34具有如美国专利号7,960,359和美国专利申请公开号2012/0276627和2012/0288933中所述的修饰。
miR-34治疗剂可以以各种方式施用，例如局部、肠内或肠胃外。具体地，肠胃外递送可包括静脉内或皮下施用。例如，miR-34可作为缓慢团注剂以范围为每剂约0.001-10.0mg/kg的剂量静脉内施用，例如，每剂0.01-3.0、0.025-1.0或0.25-0.5mg/kg，每周一、二、三次或更多的剂量，持续2、4、6、8周或必要时更长的时间。
受试者/癌症
在本发明的方法中，受试者可以是动物，例如，哺乳动物，诸如人。在一些实施方案中，受试者可以是患有癌症、怀疑患有癌症或易患癌症的人。易患癌症的受试者可具有历史的(例如，既往癌症)、环境的(吸烟、过度的日光暴露、暴露于某些化学品)或遗传的(例如，Lynch综合征)易感性指示。示例性的癌症包括但不限于肺癌(非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌)、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。在一些实施方案中，已经确定受试者具有p21CIP1/WAF1阳性癌细胞。在一些实施方案中，受试者可能具有p53缺陷的癌细胞。在某些实例中，已经确定受试者具有p21CIP1/WAF1阳性的和p53缺陷的癌细胞。例如，可确定受试者具有含有p21CIP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因和杂合失活的(-/-)p53基因的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有含有p21CIP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因且缺乏功能性p53蛋白质的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有功能性p21CIP1/WAF1蛋白质和非功能性或缺失p53蛋白质。在一些实施方案中，受试者可能经历了之前的一线疗法的失败，诸如非miR-34的miRNA疗法或非miRNA疗法。例如，受试者可能已经经历了对一线疗法的一种或多种显著的不良副作用，或者一线疗法可能还没有处理受试者的癌细胞。例如，一线miRNA疗法如miR-192或miR-215的施用没有阻止受试者中的癌细胞增殖。在一些实施方案中，受试者可能具有原发性或转移性癌症，或I、II、III或IV期癌症。
生物标志物
miR-34活性的生物标志物是miR-34活性的代表，例如，其表达或活性表明miR-34在功能上具有活性的分子。例如，miR-34活性的生物标志物可以是miR-34的直接靶标，诸如HDAC1、干扰miR-34的分子或被miR-34诱导的分子。图1显示了miR-34靶标，其中的一些与p53共用，并且其中的一些是单独的，它们是miR-34活性的生物标志物。这些生物标志物的表达水平或活性可以使用测定来测量，如以下进一步所讨论的。在一些方面，miR-34活性的生物标志物可用作miR-34活性的预测性标志物，即，用以预测受试者将如何响应于miR-34治疗剂。在一些方面，miR-34活性的生物标志物的表达水平或活性水平的变化可用来确定受试者响应miR-34疗法的程度。miR-34活性的生物标志物包括但不限于以下详细描述的p21CIP1/WAF1(CDKN1A)(OMIM#116899)(SEQIDNO:9)、p53(OMIM#191170)(SEQIDNO:10)、PUMA(OMIM#605854)(SEQIDNO:11)、BAX(OMIM#600040)(SEQIDNO:12)、NOXA(OMIM#604959)(SEQIDNO:13)、PHLDA3(OMIM#607054)(SEQIDNO:14)、MDM2(OMIM#164785)(SEQIDNO:15)和HDAC1(OMIM#601241)(SEQIDNO:16)。这些生物标志物和它们的序列表的实例在美国专利申请公开号2008/0274956、2010/0292085和2009/0298054和WO2000/075184中讨论，其全部通过引用并入本文。
miR-34活性的先决生物标志物是这样的生物标志物，如果不存在则使得受试者不响应于miR-34疗法，即，对miR-34的响应的生物标志物。miR-34活性的一些生物标志物，例如p21CIP1/WAF1(CDKN1A)，是miR-34活性的先决生物标志物，而miR-34活性的其他生物标志物，例如p53，不是miR-34活性所必需的。例如，miR-34活性的生物标志物可表明，miR-34在受试者中是活性的，尽管如此，如果不存在miR-34活性的先决生物标志物，则可能在该受试者中不具有治疗益处。miR-34活性的先决生物标志物可包括但不限于p21CIP1/WAF1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2和HDAC1。如果表达水平或活性水平等于或高于参考水平，则确定存在该生物标志物，否则确定不存在该生物标志物。参考水平可根据细胞类型或受试者而变化。例如，该参考水平可以是通过特定的测定可检测到的最低水平。例如，该参考水平可以等于生物标志物在受试者中的表达或活性或在其正常范围之内。例如，如果表达水平或活性水平在参考水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、33％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％之内，则可确定存在生物标志物。
如果在生物标志物表达或活性的第一水平与生物标志物表达或活性的第二水平之间有相对变化，则生物标志物可指示出miR-34治疗剂的功效。第一水平与第二水平之间的相对变化为至少3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或100％可指示出miR-34治疗剂的功效。根据生物标志物，第二水平可以高于或低于第一水平以指示功效。例如，miR-34活性的生物标志物的第二水平可以比第一水平至少高50％，预期该生物标志物响应于miR-34治疗剂如p21而上升。在其他一些实例中，miR-34活性的生物标志物的第二水平可以比第一水平至少低50％，预期该生物标志物响应于miR-34治疗剂如HDAC1而下降。
p21 CIP1/WAF1
人p21CIP1/WAF1定位于染色体6p21.2的基因CDKN1A上，该基因编码细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。1922年首次描述了蛋白质p21CIP1/WAF1(Xiong等人,Cell71:505-514(1992))。p21CIP1/WAF1是另外已知被p53转录调控的强肿瘤抑制物，并且是p53响应所必需的。p21CIP1/WAF1的主要功能包括通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)而阻滞细胞周期和通过与增殖细胞的核抗原(PCNA)结合而阻断DNA合成(Abbas等人,NatRevCancer9(6):400-14(2009))。然而，p21CIP1/WAF1还可以抑制其他的致癌途径，包括通过WNT4、STAT3、MYC和TERT调控的途径(Abbas等人,NatRevCancer9(6):400-14(2009))。
p21CIP1/WAF1属于CKI的Cip/Kip家族(p21CIP1/WAF1、p27KIP1和p57KIP2)，这些CKI参与细胞周期蛋白/CDK复合物的活性调控并且已经显示通过抑制CDK负调控细胞周期蛋白介导的细胞周期进程(美国专利申请公开号2005/043262)。p21CIP1/WAF1的改变可对细胞增殖的调控有不良影响并且增加癌症的易感性。已经在多种人类癌症中观察到p21CIP1/WAF1多态性。
p21CIP1/WAF1阳性癌细胞是具有功能性p21CIP1/WAF1的可检测的表达水平或活性水平的癌细胞。例如，p21CIP1/WAF1阳性癌细胞可以是具有野生型p21CIP1/WAF1活性或表达水平的癌细胞。例如，可以通过测量细胞增殖或通过使用针对p21CIP1/WAF1的siRNA来检测p21CIP1/WAF1活性水平。
p53
如以上所讨论的，肿瘤抑制物TP53(p53)转录诱导全部三个miR-34家族的表达，但在癌症中具有高突变率。p53正常的癌细胞具有p53野生型表达和活性。p53缺陷的癌细胞具有低于p53正常的细胞的表达水平和/或活性水平。具有杂合的或纯合的TP53突变的癌细胞是p53缺陷的癌细胞。例如，具有显性阴性突变的细胞是p53缺陷的癌细胞。在一些实施方案中，p53缺陷的癌细胞不具有任何内源性p53。在一些实施方案中，p53缺陷的癌细胞不具有功能性p53。肺癌(非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌)、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌细胞可能是p53缺陷的癌细胞。可通过测定来测量p53蛋白质或mRNA的表达或活性水平。例如，该表达水平可以是功能性p53蛋白质的水平。例如，基因组试验可以测量显性阴性突变。
其他生物标志物
PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2和HDAC1是miR-34活性的其他示例性的生物标志物。PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2被miR-34上调。HDAC1——一种众所周知的药物靶标——在用miR-34a转染的细胞中下调，并且已经与转录调控相关联。HDAC1转录物在其被miR-34直接靶向的3'-非翻译区(UTR)具有miR-34结合位点，miR-34随后阻抑HDAC1。
测定
在实施本发明的方法时可使用各种测定来测量参数。在一些实施方案中，测定可直接或间接测量基因、mRNA和蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，活性测定可用来间接测量基因、mRNA或蛋白质的表达水平。常见的测定包括但不限于增殖测定、定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、萤光素酶报道基因测定、ELISA和Western分析。在一些实施方案中，可使用生物样品，如来自受试者的血液或组织样品，例如肿瘤活检样品进行测定。在一些实施方案中，其他参数可作为对治疗的响应的指示进行测量。例如，可测量肿瘤大小、凋亡速率、细胞增殖、脱发等。
供替代的癌症疗法
本发明的方法可使用除了miR-34治疗剂以外的癌症疗法，诸如非miR-34的microRNA疗法或非microRNA疗法。这些疗法可与miR-34治疗剂如miR-34疗法结合使用，或者它们可用作供替代的疗法。排除miR-34治疗剂的癌症疗法在本文中将被称为供替代的疗法。例如，供替代的疗法可用作“一线”疗法，即，先于施用miR-34治疗剂。在一些实施方案中，供替代的疗法是microRNA疗法。例如，供替代的疗法可以是microRNA，诸如miR-215治疗剂、miR-192治疗剂或排除miR-34的组合microRNA治疗剂。在一些实施方案中，供替代的疗法是非microRNA疗法。非microRNA疗法包括但不限于中断的疗法、化学疗法、放射、手术、姑息疗法、靶向疗法(例如，EGFR-TKI(例如，埃罗替尼、吉非替尼等)、贝伐珠单抗、克唑替尼)等。
通用
在本发明的方法中，“施用”不限于任何特定的递送系统，并且可包括但不限于肠胃外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌内或腹膜内)、直肠、局部、经皮或口服(例如，以胶囊、悬浮液或片剂的形式)。可以以单次剂量或重复施用，并以多种生理学上可接受的盐形式中的任一种，和/或与作为药物组合物的一部分的可接受的药物载体和/或添加剂一起，向个体施用。生理学上可接受的盐形式和标准的药物配制技术、剂量和赋形剂是本领域技术人员公知的(参见，例如，Physicians’DeskReference2005,59thed.,MedicalEconomicsCompany,2004；和Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,eds.Gennado等人,21sted.,Lippincott,Williams&Wilkins,2005)。
此外，在一种动物中获得的有效剂量可使用本领域已知的转换因子外推以用于另一种动物，包括人类(参见，例如，Freireich等人,CancerChemotherReports50(4):219-244(1966)；表2为等效表面积剂量因子)。
表2：等效表面积剂量因子。
以下实施例提供了本发明的说明性实施方案。本领域普通技术人员将会认识到，可进行许多修改和变化而不改变本发明的实质或范围。这样的修改和变化涵盖在本发明的范围内。这些实施例并非以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1-材料与方法
细胞培养、寡核苷酸和增殖测定。源自MCF10A乳腺癌的同基因癌细胞和SW48、HCT116、DLD-1和RKO结直肠癌细胞系从HorizonDiscoveryLtd(Cambridge,UK)获得。参见表3。合成的miRNA模拟物和siRNA从LifeTechnologies(Ambion,Austin,TX)购买。为了刺激TP53途径，用10μM依托泊苷预处理细胞28小时，并采集RNA用于qRT-PCR分析。使用针对EG5(增殖所需的一种纺锤状蛋白质)的siRNA确定每个细胞系的使用2000(Invitrogen)或RNAiMAXTM(Invitrogen)的最佳转染条件。一式两份或一式三份进行反向转染。简而言之，向含2000(SW48、MCF10A、DLD-1、HCT116)或RNAiMAX(RKO)的每孔20μl中加入5μl寡核苷酸在无RNA酶水中的溶液。混合物在室温下温育20min以形成脂质-RNA复合物。然后，加入悬浮在培养基中的75μl细胞以达到每孔6,000-10,000个细胞的最终浓度，这取决于每个细胞系的生长速率。约18小时后，去除上清液并更换为新鲜的培养基。转染后3-4天使用(Invitrogen,Carlsbad,CA)确定细胞增殖。底物在活细胞中被代谢转化为荧光产物，该荧光产物与活细胞数成比例。使用Graphpad(Prism)软件计算非线性回归和EC50值。全部的EC50值都在回归趋势线的95％置信区间(P<0.05)内。此处所用的EC50值被定义为半数最大miRNA活性。
表3：同基因癌细胞系的TP50基因型
*如癌症中体细胞突变目录(COSMIC，www.sanger.ac.uk)数据库所报道的
定量逆转录酶PCR。使用mirVANATMPARISTMRNA分离试剂盒(Ambion)按照制造商的说明从培养的同基因癌细胞系中分离总RNA。为了qRT-PCR检测miRNA，将10ng总RNA和针对hsa-miR-34a、hsa-miR-215、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-34b和hsa-miR-34c中每一种的miRNA特异性RT-引物(测定ID000426、000518、000491、000492、002102、000428；miRNA测定，AppliedBiosystems)在70℃下热变性2min，并使用MMLV逆转录酶(目录号28025-021，Invitrogen)逆转录。使用PlatinumTaq聚合酶试剂(Invitrogen)和ABIPrism7900SDS仪器(AppliedBiosystems)通过PCR确定miRNA表达水平。如下进行PCR反应：将样品加热至95℃1min，接着在多个循环过程中在95℃下温育样品5sec，并在60℃下温育30sec。管家miRNAmiR-191和miR-103(测定ID002299和000439)作为内部参考扩增，以对孔间RNA输入差异进行调整。原始Ct值相对于管家miRNACT的几何平均值进行归一化，并表示为相对于未处理的、miR-NC或模拟转染的细胞中的值的倍数差异。
为了检测人类mRNA，使用10ng总RNA和随机十聚体(AM5722G，Ambion)生成cDNA。使用多个Taqman基因表达测定(Invitrogen)进行基因特异性扩增。管家GAPDH和亲环蛋白A(Invitrogen)的mRNA水平用作加样对照。原始Ct相对于管家mRNA的Ct进行归一化，并且如上所述进行分析。
定点诱变。编码与人HDAC1的完整3’-UTR融合的萤光素酶报道基因的人HDAC13’-UTRLenti-报道基因-萤光素酶载体(pLenti-UTR-LucHDAC1，HDAC1wt)从AppliedBiologicalMaterials,Inc.购买。进行两轮诱变以在HDAC13’-UTR的miR-34结合位点中引入6个点突变(HDAC1mut)。为了定点诱变，按照制造商的说明使用QuikChangeXL定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies)。在首轮中，使用以下引物：SEQIDNO:17(CCTCAAGTGAGCCAAGAAACAATAACTGCCCTCTGTCTGTC)和SEQIDNO:18(GACAGACAGAGGGCAGTTATTGTTTCTTGGCTCACTTGAGG)。阳性克隆通过测序(UTAustin)进行验证，并用作使用以下引物的第二轮诱变的模板：SEQIDNO:19(GGCCTCAAGTGAGCCAAAAATAAATAACTGCCCTCTGTCTGTC)和SEQIDNO:20(GACAGACAGAGGGCAGTTATTTATTTTTGGCTCACTTGAGGCC)。转染中使用的所有载体均通过测序进行验证。
萤光素酶报道基因测定。SW48-/-和H1299细胞分别用1nM或10nMmiR-34a在96-孔板中使用lipofectamine2000(LifeTechnology)进行反向转染。作为对照，用相同浓度的miR-NC转染细胞。第二天，用各100ng的HDAC1wt或HDAC1mut萤光素酶质粒正向转染细胞。48小时后，制备细胞裂解物并使用来自Pierce(ThermoScientific)的BCA系统进行定量。使用POLARStarOPTIMA平板阅读仪(BMGLabtech)和萤光素酶测定系统(Promega)来确定发光。发光相对于总蛋白质输入进行归一化。
Western分析。将200,000个SW48和RKO细胞接种在6-孔板中，并用miRNA模拟物和siRNA在6-孔板中使用2.5μllipofectamine2000或RNAiMax进行反向转染。3天后，将细胞裂解物收集在RIPA缓冲液(CellSignaling)中，并使用来自ThermoScientific的BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度。将各2.5μg的总细胞裂解物加样到12％SDS-PAGE上，然后转移至PVDF膜。用p21、HDAC1、c-MET和肌动蛋白特异性第一抗体(CellSignaling)在4℃下对膜进行印迹过夜。该膜在含0.2％TweenTM-20的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体一起在室温下温育1小时。用含0.2％TweenTM-20的1×PBS洗涤后，该膜与ECL检测试剂(ThermoScientific)一起温育，并使用AFPX射线胶片显影剂(AFPImageCorp.)对蛋白质条带进行可视化。
人类组织样品。NSCLC肿瘤样品和相应的正常邻近组织(NAT)从ProteoGenex和NationalDiseaseResearchInterchange购买。通过qRT-PCR确定HDAC1mRNA和miR-34a水平，并将其表示为每个肿瘤与NAT对之间的相对表达。使用GraphPad计算线性回归。
统计分析。使用Excel和GraphPad(Prism)软件进行统计分析。由一式两份或一式三份实验计算平均值和标准差。通过如图例中所示的双尾Studentt-检验或F检验生成P值。实施例2-miR-34对癌细胞增殖的抑制不依赖于TP53
本研究中使用的同基因细胞源自MCF10A乳腺癌和结直肠癌细胞系SW48、HCT116、RKO和DLD-1(表3)。在这些细胞中，TP53是野生型(+/+)、杂合的(+/-)或杂合失活的(-/-)(Sur等人,ProcNatlAcadSciUSA106(10):3964-9(2009))。亲代DLD-1细胞(DLD-1par)不表达功能性TP53蛋白质，这是由于S241F/SILTP53基因型中的一个等位基因是突变的，而另一个是表位(epitopically)沉默的。因此，其中点突变已经通过定点诱变得到校正的DLD-1+/SIL细胞(+/-)用作具有完整TP53的DLD-1参考系(Sur等人,ProcNatlAcadSciUSA106(10):3964-9(2009))。每个非同基因细胞系显示出可能影响miRNA的抑制效果的其他肿瘤抑制基因和癌基因中的突变(表3)。
为了证实TP53在同基因细胞系中的连续失活，通过将细胞暴露于DNA损伤剂依托泊苷28小时来诱导TP53响应并收集总RNA。定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)分析显示了TP53mRNA和TP53调控的靶基因根据其基因型的等位基因依赖性增加(图2A-2E)。TP53mRNA在TP53-/-细胞中未检测到。TP53调控的基因的提高的mRNA水平类似于发表的数据(Brady等人,Cell145(4):571-83(2011))，并在细胞系之间有所不同，这推测是由于这些基因的细胞类型特异性调控。同样，TP53调控的miRNA、miR-34a/b/c、miR-192、miR-194和miR-215的诱导依赖于细胞系——除DLD-1+/-外的所有细胞系都缺乏miR-34b/c表达，而miR-215仅在SW48和DLD-1细胞中可检测到。
同基因细胞用miR-34a、miR-34c、miR-192、miR-194和miR-215的模拟物转染。miRNA以系列稀释使用以生成剂量-响应曲线并计算EC50值。作为阴性对照，使用模拟转染的细胞和用携带杂乱序列的miRNA转染的细胞(miR-NC)。温育3-4天后，使用评估细胞增殖。如图3所示，miRNA模拟物与对照相比将细胞增殖抑制约40-80％。TP53增强了miR-215和miR-192抑制癌细胞的能力，并且在MCF10A和SW48细胞中最大，与TP53+/+细胞相比EC50值低约28-35倍(表4)。相反，miR-34a和miR-34c的抑制活性在TP53阳性和TP53阴性细胞中是相同的(图3A-6D，表4)。在不存在TP53的情况下，RKO细胞显示更大的抑制，这进一步证明了TP53不是miR-34诱导的表型的先决条件(图7A-7B)。有趣的是，在完整TP53的存在下，miR-215/192的最大抑制活性大于miR-34a/c的最大活性，这提示miR-215/192在TP53正反馈回路中起作用，并利用了仅被TP53调控的辅助途径。
表4：miRNA在同基因癌细胞中的EC50*值。
*EC50值用Prism生成，并且在趋势线的95％置信区间(P<0.05)内。
以nM表示数值。
比值表示TP53阳性和TP53阴性细胞中的EC50值的倍数差异。
实施例3-在不存在TP53的情况下miR-34a而非miR-215诱导TP53调控的基因
为了理解TP53阳性和TP53缺陷的细胞中miR-34诱导的表型，确定与TP53/miR-34轴有关的基因的表达水平。不依赖TP53的效应的一个可能的解释是这些细胞不表达内源性SIRT1或MDM4。然而，如通过qRT-PCR所证实的，TP53+/+和TP53-/-细胞均携带可检测的SIRT1和MDM4mRNA水平，提示不依赖TP53的表型不是由于不存在这些基因产物(图8)。相反，根据显示SIRT1和MDM4被该miRNA直接靶向的实验数据，在用miR-34转染的细胞中这两种mRNA均减少(Yamakuchi等人,ProcNatlAcadSciUSA105(36):13421-6(2008)；Mandke等人,PLoSOne7(8):e42034(2012))。类似地，在被相应miRNA转染的细胞中，miR-34a靶标MET和miR-215靶标BCL2特别地下调(图8)。TP53mRNA水平在SW48-/-细胞中检测不到，与它确定的基因型是一致的。在SW48+/+细胞中，TP53mRNA水平是不变的并且符合以下假说：通过这些miRNA对TP53的正反馈回路不需要TP53的从头合成，而是在转录后发生。这进一步得到以下观察的证实，该观察显示miR-215诱导在TP53阳性细胞中p21CIP1/WAF1(p21，CDKN1A)的表达，但在TP53缺陷的细胞中不能诱导表达。出乎意料的是，miR-34a不仅在TP53+/+细胞中而且在TP53缺陷的细胞中都能够诱导p21、PUMA和MDM2(图8)。为了确保该现象不是SW48所特有的，我们测试了用miR-34a转染的所有其他同基因癌细胞，并将该分析扩展至被TP53转录调控的其他基因。其中包括促凋亡蛋白BAX和NOXA以及肿瘤抑制物PHLDA3，PHLDA3是用作AKT/PKB的负调节物的仅有PH结构域的蛋白质(Kawase等人,Cell136:535-50(2009))。与来自SW48细胞的数据相符，不仅在存在功能性TP53的情况下，而且在它不存在的情况下，miR-34a都诱导了六种转录物的积累(图9A和9B)。
实施例4-HDAC1是miR-34a的直接靶标
p21CIP1/WAF1的不依赖TP53的上调的似乎合理的解释是其他TP53家族成员TP63和TP73的潜在参与。这两种蛋白质发挥了不同于TP53的作用；然而，它们还控制与TP53的基因重叠的一组基因。测定了已经用miR-34a转染的TP53野生型和TP53缺陷型细胞中TP63和TP73的内源性mRNA水平。然而，这些细胞均未显示可检测的TP63或TP73水平，提示这些基因产物的参与是不大可能的(数据未示出)。
接着，分析了不依赖于TP53的调控机制和可控制p21CIP1/WAF1表达的核调节物。感兴趣的一个候选物是HDAC1，因为它在其3'UTR中具有推定的miR-34a结合位点(图10)，在用miR-34a转染的细胞中下调(图11)，并且已经与在不存在TP53的情况下p21CIP1/WAF1的转录调控相关(Lagger等人,MolCellBiol23(8):2669-79(2003))。为了证实HDAC1是否被miR-34a直接阻抑，检查miR-34a以确定其是否可以阻抑与完整HDAC13’UTR(SEQIDNO:21)融合的萤光素酶报道基因。该报道基因在缺乏内源性miR-34a的两种细胞系中瞬时表达。然后，细胞用miR-34a(SEQIDNO:3)或miR-215(SEQIDNO:1)转染，预计后者不阻抑HDAC1，因此用作阴性对照。如图12A所示，在两种细胞系中miR-34a的转染相对于对照使发光减弱了约50％。该阻抑在miR-34a结合位点突变(SEQIDNO:22)时被完全消除(图12A)，提示HDAC13’UTR在该位点处被miR-34a直接靶向。为了进一步评价在人类肿瘤试样中是否表现出HDAC1的miR-34a依赖性阻抑，我们检查了先前所用的一组14个非小细胞肺癌样品以证明降低的miR-34a表达水平(Wiggins等人,CancerRes70(14):5923-30(2010))。通过qRT-PCR确定肿瘤HDAC1mRNA和miR-34a水平，并将其相对于它们各自正常的邻近组织中的水平进行归一化。通过Pearson方法的分析显示了HDAC1mRNA与miR-34a水平之间统计显著的负相关(图12B)，这支持了miR-34a在调控人类肿瘤的HDAC1中的作用。
实施例5-HDAC1的抑制模拟miR-34a表型
先前的结果表明HDAC1与p21CIP1/WAF1基因的调控有关。例如，HDAC1缺陷的胚胎干细胞显示升高的p21CIP1/WAF1水平，并且使用HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对HDAC1的抑制可在不存在TP53的情况下诱导p21CIP1/WAF1表达(Sowa等人,1997；Lagger等人,2002)。为了证实HDAC1消耗时p21CIP1/WAF1的不依赖TP53的诱导，我们用针对HDAC1的siRNA转染TP53阴性细胞，并通过蛋白质印迹法评估细胞裂解物。该结果与用miR-34a或miR-215转染的细胞进行比较。测试两种细胞系，并且其包括模拟处理的和miR-NC处理的细胞作为阴性对照。正如所预期的，Met仅在用miR-34a转染的细胞中下调，而miR-34a和HDAC1siRNA减少了HDAC1蛋白质(图13-14)。需要注意的是，这两种寡核苷酸均诱导了在这些细胞中p21CIP1/WAF1蛋白质表达的明显增加。这一观察与不能在TP53缺陷型细胞中诱导p21CIP1/WAF1的miR-215形成鲜明对比。然而，miR-215转染至TP53阳性细胞中导致TP53阳性细胞中p21CIP1/WAF1蛋白质的增加(图15)，这符合以下假说：作为从miR-215至TP53的正反馈回路的结果，p21CIP1/WAF1的miR-215依赖性诱导由TP53介导(Picchiori等人,CancerCell18(4):367-81(2011))。
为了探索HDAC1的抑制是否能模拟miR-34a表型，我们测量了针对HDAC1的siRNA在TP53阳性和TP53缺陷型SW48细胞中的增殖效果。细胞也用针对可拮抗TP53功能的基因产物的一系列其他siRNA进行转染。这些基因包括YY1、MDM4和SIRT1，以及是被证实或预测的miR-34a靶标并且在miR-34转染的细胞中受到阻抑的一些其他基因(数据未示出)。siRNA的瞬时转染导致靶mRNA的>80％的敲减，如通过qRT-PCR所证实的(图16A-16G)。作为对照，还用miR-34a和miR-215转染细胞。我们试图鉴定在两种细胞系中产生类似的癌细胞抑制水平的siRNA。正如所预期的，miR-34a同等地抑制SW48+/+和SW48-/-细胞，并且miR-215的活性依赖于TP53(图17)。大多数siRNA不能在任一种细胞类型中减少细胞增殖，其包括针对SIRT1和YY1的siRNA。MDM4的敲减能够抑制SW48+/+细胞的增殖，但在SW48-/-细胞中没有效果。这令人想起miR-215表型，并证实了MDM4在调节TP53反式激活而非DNA调控中的作用(Toledo等人,2006)。相反，HDAC1的敲减抑制了癌细胞生长，类似于miR-34a，这在两种同基因细胞系中是相同的。从用曲古抑菌素A处理的细胞中获得了类似的结果(图18A-18B)，这进一步证实了HDAC1在通过p21CIP1/WAF1介导miR-34a响应中的作用。
实施例6-p21的消耗干扰癌细胞增殖的miR-34a诱导的抑制。
在各种细胞系中生成的剂量-响应数据提示，p21CIP1/WAF1表达是癌细胞增殖的miR-34a诱导的抑制过程中的关键事件。p21CIP1/WAF1的表达水平与miR-34a抑制TP53阳性和TP53阴性细胞的能力明显相关。例如，miR-34a的抑制活性在MCF10A和SW48细胞中是相同的，并且与TP53-/-和TP53+/+细胞中类似的p21CIP1/WAF1表达水平相关(图3)。相比于TP53-/-细胞，在TP53+/+细胞中，HCT116表现出更高的p21CIP1/WAF1mRNA水平，这与在更高miR-34a浓度(30nM，图3)下TP53+/+细胞中略微增加的miR-34a抑制活性一致。在RKO细胞中，p21CIP1/WAF1水平在TP53-/-细胞中较高，并且反映了在RKO-/-细胞中相比在RKO+/+细胞中更大的增殖抑制(图7A-7B)。p21CIP1/WAF1的诱导在低miR-34a浓度下也是明显的，并且与细胞增殖的抑制负相关(图19)。
为了讨论miR-34a诱导的表型是否需要p21CIP1/WAF1表达，我们通过用miR-34a和针对p21CIP1/WAF1的siRNA共转染细胞进行了干扰试验。作为对照，用miR-34a、miR-215或miR-NC转染细胞。每种miRNA均补充了阴性对照寡核苷酸，使得转染的RNA的总量等于miR-34a/si-p21组合之一。靶向基因的下调通过Western分析进行验证(图20)。单独的miR-34a使RKO细胞的增殖降低约20-30％(图21)。相反，miR-34a/si-p21组合对癌细胞增殖没有影响，并且提示p21CIP1/WAF1表达实际上是介导miR-34肿瘤抑制物响应中的必要因素。p21CIP1/WAF1依赖性表型在同基因SW48癌细胞(图22)和缺乏p21CIP1/WAF1的TP53阴性Hep3B肝癌细胞(图23)中是可再现的。
实施例7-miR-34a模拟物的全身递送在体内诱导肿瘤中p21CIP1/WAF1的表达。
为了讨论在荷瘤动物中miR-34a是否能诱导p21CIP1/WAF1的上调，将Hep3B肝细胞癌细胞经手术植入NOD/SCID小鼠肝脏的左侧叶。Hep3B癌细胞缺乏功能性TP53。大约5周后，当小鼠形成可检测到的大肿瘤时，通过静脉内尾静脉注射施用单剂量的浓度为1mg/kg小鼠体重的miR-34a模拟物。该miR-34a模拟物是含有miR-34a的模拟物的脂质体制剂。1mg/kg的剂量等价于20μgmiR-34a。24小时后，处死小鼠，然后收集肿瘤组织以用于蛋白质裂解物制备。通过Western分析探测裂解物以确定p21CIP1/WAF1蛋白质的表达。如图24A所示，三个MRX34治疗的小鼠中的两个表达了高水平的p21CIP1/WAF1。相反，对照肿瘤均不显示p21CIP1/WAF1蛋白质的升高的表达。类似地，用miR-34a瞬时转染的Hep3B细胞显示出p21CIP1/WAF1的上调。图24B。数据提示，基于miR-34a的疗法能够在缺乏功能性TP53的肿瘤中诱导p21CIP1/WAF1。

Claims (35)

1.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
(a)针对存在或不存在miR-34活性的至少一种先决生物标志物筛选受试者；
(b)如果确定存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用miR-34治疗剂；以及
(c)如果确定不存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用供替代的疗法，
从而治疗该受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物选自p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2和HDAC1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物包括p21CIP1/WAF1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中筛选受试者所针对的唯一的先决生物标志物为p21CIP1/WAF1。
6.根据权利要求1所述的方法或用途，其中miR-34为miR-34a、miR-34b、miR-34-c、miR-449a、miR-449b或miR-449c。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述供替代的疗法是中断的疗法。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述miR-34治疗剂包括miR-34并且还任选包括miR-215和miR-192中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述供替代的疗法为非miR-34的microRNA疗法。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述供替代的疗法选自化学疗法、放射疗法和手术，并且还任选包括miR-215和miR-192中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的方法，其中已经确定所述受试者具有p21CIP1/WAF1阳性癌细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其中已经确定所述受试者具有p21CIP1/WAF1阳性癌细胞和p53缺陷的癌细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中已经确定所述受试者具有缺乏功能性p53蛋白质的癌细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中已经确定所述受试者具有含有野生型或杂合p21CIP1/WAF1基因的癌细胞。
15.根据权利要求1所述的方法，其中已经确定所述受试者具有p53缺陷的癌细胞，针对存在或不存在p21CIP1/WAF1筛选所述受试者，如果确定存在p21CIP1/WAF1则向所述受试者施用miR-34治疗剂，并且如果确定不存在p21CIP1/WAF1则中断miR-34治疗剂。
16.一种确定用miR-34治疗剂治疗的受试者对癌症疗法的响应的方法，该方法包括：
(a)测定所述受试者中miR-34活性的至少一种生物标志物的第一水平；
(b)向所述受试者施用miR-34治疗剂；
(c)测定所述受试者中该生物标志物的第二水平；
(d)如果相对于该第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效，则进一步向所述受试者施用miR-34治疗剂；以及
(e)如果相对于该第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效不足，则向所述受试者施用供替代的疗法，
从而确定所述受试者对癌症疗法的响应。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。
18.根据权利要求16所述的方法，其中从所述第一水平至所述第二水平的10％差异指示出所述miR-34治疗剂的功效。
19.根据权利要求16所述的方法，其中(b)和(d)中的miR-34治疗剂是相同的。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述供替代的疗法是非microRNA疗法。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述非microRNA疗法是中断的疗法、化学疗法、放射疗法或手术。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述供替代的疗法为非miR-34的microRNA疗法。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述供替代的疗法包含miR-215和miR-192中的至少一种。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种生物标志物是miR-34活性的先决生物标志物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物选自p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且其中如果第二水平高于第一水平则指示出功效。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物是HDAC1，并且其中如果第二水平低于第一水平则指示出功效。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物是p21CIP1/WAF1，并且其中所述供替代的疗法是中断的疗法。
28.一种处理受试者中的癌细胞的方法，其包括：
选择具有p53缺陷的且p21CIP1/WAF1阳性的癌细胞的受试者，并用miR-34治疗剂治疗该受试者。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者患有膀胱癌、食管癌、乳腺癌或胃癌。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有白血病、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(全部四种亚型)、滤泡性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(全部亚型)、骨髓瘤、多发性骨髓瘤或骨髓发育不良综合征。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述先决生物标志物是DNA、mRNA或蛋白质。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述DNA为非沉默的基因并且它没有任何失活突变。
34.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述至少一种先决生物标志物选自p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且(ii)所述至少一种先决生物标志物的存在包括等于或高于参考水平的表达水平或活性水平。
35.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述至少一种先决生物标志物是HDAC1；并且(ii)所述至少一种先决生物标志物的存在包括等于或低于参考水平的表达水平或活性水平。
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